神經(jīng)干細(xì)胞與脊髓脫細(xì)胞支架體外共培養(yǎng)的可行性

漆國(guó)棟，江瓊，伍亞民，申開(kāi)琴，楊琴，漆偉

1.重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院骨科，重慶市 400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市 400016；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所，創(chuàng)傷燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市400042

脊髓損傷致殘率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。目前臨床康復(fù)采用多學(xué)科協(xié)同方案，但效果有限[1]。種子細(xì)胞與生物支架構(gòu)建的脊髓組織工程可能成為未來(lái)脊髓損傷康復(fù)的關(guān)鍵方向，現(xiàn)階段重點(diǎn)為選擇不同種類(lèi)細(xì)胞與支架，探索最適宜的構(gòu)建方案[2-3]。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)源于神經(jīng)組織，作為種子細(xì)胞中最能定向分化為神經(jīng)譜系的細(xì)胞，可直接代替損傷的神經(jīng)樣細(xì)胞，分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，改善損傷處微環(huán)境，但存在單獨(dú)應(yīng)用時(shí)存活率較低、分化不可控等缺點(diǎn)[4-6]。脊髓脫細(xì)胞支架(spinal cord acellular scaffold,SCAS)為正常脊髓組織經(jīng)脫除細(xì)胞后保留的細(xì)胞外基質(zhì)，成分和結(jié)構(gòu)與正常脊髓高度相似，具有低免疫原性和良好的生物相容性[7]。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植于SCAS，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞與支架復(fù)合良好，可生存、生長(zhǎng)并分化為神經(jīng)譜系細(xì)胞[8-9]。本課題組前期對(duì)體外培養(yǎng)的NSCs增殖與分化調(diào)控進(jìn)行探索[10-12]，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)NSCs 具備復(fù)合生物支架構(gòu)建脊髓組織工程的可行性[13]。本研究選擇NSCs 作為種子細(xì)胞，與SCAS 進(jìn)行脊髓組織工程構(gòu)建，初步探討該模式的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑與儀器

SPF 級(jí) 新 生24 h Sprague-Dawley 大 鼠、SPF 級(jí)Sprague-Dawley 雌性大鼠，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(渝)2012-0001。所有操作均依據(jù)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》要求，符合動(dòng)物福利與倫理原則。

Neural basal 培養(yǎng)基、B-27、Acctuase 酶、胎牛血清：美國(guó)GIBCO 公司。堿性纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)：美國(guó)PEPROTECH 公司。小鼠單克隆抗Nestin 抗體：美國(guó)MILLIPORE 公司。兔多克隆抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體：美國(guó)INVITROGEN公司。小鼠單克隆抗微管相關(guān)蛋白-2 (microtubule associated protein-2,MAP-2)抗體：英國(guó)ABCAM 公司。DMEM/F12 培養(yǎng)基、0.25%胰酶：美國(guó)HYCLONE 公司；DyLight488標(biāo)記山羊抗小鼠二抗、TRITC 標(biāo)記山羊抗兔二抗、DAPI、HE 染色試劑盒、免疫組化染色試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。TritonX-100、脫氧膽酸鈉、PBS、正常山羊血清：北京索萊寶科技有限公司。激光共聚焦顯微鏡、冰凍切片機(jī)：德國(guó)LEICA 公司。熒光倒置顯微鏡：日本OLYMPUS 公司。冷凍干燥機(jī)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、-80 ℃冰箱：美國(guó)THERMO FISHER SCIENTIFIC公司。掃描式電子顯微鏡：日本HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 NSCs

1.2.1.1 原代培養(yǎng)及傳代

新生24 h 內(nèi)大鼠5 只，斷頭取腦。無(wú)菌條件下仔細(xì)剝離腦膜和血管，眼科鑷前緣解剖分離大腦皮質(zhì)，鋒利剪刀剪成1 mm3小塊。加適量0.25%胰酶，37 ℃消化15～20 min；胎牛血清終止消化，藍(lán)槍頭均勻用力吹打10～15 次，200 目細(xì)胞篩過(guò)濾，形成單細(xì)胞懸液。離心，棄上清液，加適量培養(yǎng)基吹打、重懸。重復(fù)離心、重懸步驟。細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×106/ml 接種于6 cm培養(yǎng)皿中，增殖培養(yǎng)基含DMEM/F12、2%B-27、20 ng/ml EGF 和20 ng/ml bFGF，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d 半量換液1 次，6～7 d 傳代1 次。傳代時(shí)，細(xì)胞懸液離心，棄上清液，Acctuase 酶吹打、重懸，37 ℃消化10 min；離心，去Acctuase 酶，加培養(yǎng)基，均勻用力吹打30～50 次，加入適量增殖培養(yǎng)基重懸。傳代后培養(yǎng)方式同原代。

1.2.1.2 鑒定

1.2.1.2.1 Nestin鑒定

取第3 代神經(jīng)球，接種于多聚賴(lài)氨酸包被的六孔板無(wú)菌爬片中培養(yǎng)4 h 貼壁。4%多聚甲醛固定，0.5%TritonX-100 破膜，10%山羊血清封閉。加Nestin 一抗(1∶200) 4 ℃孵育過(guò)夜。加Dylight488 標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(1∶100)37 ℃孵育1 h。DAPI 染核，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.1.2.2 分化鑒定

取第3 代神經(jīng)球吹散后，接種于多聚賴(lài)氨酸包被后的六孔板無(wú)菌爬片中分化培養(yǎng)7 d，分化培養(yǎng)基含Neural basal、2%B-27和10%胎牛血清。4%多聚甲醛固定，0.5% TritonX-100 破膜，10%山羊血清封閉。加Map-2 (1∶500)、GFAP(1∶1000)一抗4 ℃孵育過(guò)夜。加Dylight488 標(biāo)記山羊抗小鼠(1∶100)、TRITC標(biāo)記山羊抗兔(1∶100)二抗37 ℃孵育1 h。DAPI染核，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.2 SCAS

1.2.2.1 制備

雌性Sprague-Dawley 大鼠20 只，1%苯妥英鈉45 mg/kg 腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下經(jīng)心臟灌注無(wú)菌PBS。完全取出胸段脊柱，置0 ℃D-hanks 中。取部分完整脊髓(正常脊髓)，修剪為10 mm 左右小段，-20 ℃保存。

取部分脊髓(SCAS)，置-80 ℃冰箱1 h，-20 ℃、4 ℃、37 ℃梯度解凍，無(wú)菌蒸餾水浸泡6 h，每2 小時(shí)換水1 次。脊髓修剪為10 mm 左右小段，依次浸入2%TritonX-100 溶液，超聲振蕩5 min (振幅20%，振5 s 停5 s)，室溫持續(xù)振蕩3 h (170 r/min)；置0.01 mol/L PBS 持續(xù)振蕩3 h；置10%氯化鈉溶液持續(xù)振蕩15 min；置純水持續(xù)振蕩15 min；置10%氯化鈉溶液持續(xù)振蕩15 min；置純水持續(xù)振蕩15 min；置2%脫氧膽酸鈉溶液，超聲振蕩5 min (振幅20%，振5 s 停5 s)，室溫持續(xù)振蕩3 h (170 r/min) ；置0.01 mol/L PBS持續(xù)振蕩3 h。-20 ℃保存。

1.2.2.2 檢測(cè)

1.2.2.2.1 孔隙率

采用液體置換法。凍干脊髓各5 條置量筒中，加入V1 體積無(wú)水乙醇中，輕壓脊髓組織中空氣至無(wú)氣泡，此時(shí)體積為V2；將脊髓移出，此時(shí)體積為V3。

1.2.2.2.2 含水率

凍干脊髓各5 條稱(chēng)重(W1)，置0.01 mol/L PBS 中浸泡2 h，吸出多余水分，稱(chēng)重(W2)。

1.2.2.2.3 體外酶解率

凍干脊髓各5 條稱(chēng)重(W1)，置含1 mg/ml 胰蛋白酶PBS中，37 ℃、100 r/min振蕩24 h取出，凍干后稱(chēng)重(W2)。

1.2.2.2.4 組織學(xué)觀察

凍干脊髓4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，冰凍切片，HE染色，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.3 體外共培養(yǎng)

取第3代神經(jīng)球吹散，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106/ml，微量注射器取20μl接種于SCAS 中，培養(yǎng)箱孵育4 h，加分化培養(yǎng)基Neural basal、2% B-27 和10%胎牛血清，培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。

1.2.3.1 免疫熒光染色

共培養(yǎng)1 d 后，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，冰凍切片，0.5% TritonX-100 破膜，10%山羊血清封閉。DAPI 染細(xì)胞核，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞黏附情況。

1.2.3.2 免疫組化染色

共培養(yǎng)7 d 后，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，冰凍切片，過(guò)氧化氫滅活，5% BSA 封閉，加MAP-2 一抗(1∶100)4 ℃孵育過(guò)夜，加生物素標(biāo)記二抗37 ℃0.5 h，SABC 37 ℃0.5 h，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)與分化情況。

1.2.3.3 掃描電鏡

共培養(yǎng)7 d 后，2%戊二醛固定，手術(shù)刀橫向切開(kāi)，梯度酒精脫水，叔丁醇置換，粘臺(tái)，臨界點(diǎn)干燥，噴金，掃描電鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)與分化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以(±s)表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NSCs鑒定

原代細(xì)胞接種6～7 d 后，可見(jiàn)神經(jīng)球增殖、融合變大，直徑可達(dá)到150～300 μm，呈球形、桑葚狀，透光性強(qiáng)(圖1A)。第3 代神經(jīng)球95%以上細(xì)胞表達(dá)Nestin 蛋白(圖1B、圖1C)。分化培養(yǎng)7 d 后，可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞(圖1D)，表達(dá)MAP-2 蛋白(圖1E)和GFAP 蛋白(圖1F)，符合NSCs分化特點(diǎn)。

2.2 SCAS基本特征

正常大鼠脊髓呈圓柱狀，乳白色，稍有黏性(圖2A)。物理振蕩結(jié)合化學(xué)萃取過(guò)程中，萃取液變渾濁，脫細(xì)胞的脊髓略短縮，呈圓柱狀，乳白色，透光性增加，強(qiáng)度有所下降，黏性略有增加，硬脊膜保持完整(圖2B)。脫細(xì)胞脊髓的孔隙率、含水率與體外酶解率較正常脊髓均明顯提高(P<0.01)。見(jiàn)表1。正常脊髓細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)致密，基質(zhì)可見(jiàn)較多完整細(xì)胞核(圖2C、圖2D)。SCAS 基質(zhì)結(jié)構(gòu)呈疏松網(wǎng)絡(luò)狀，基質(zhì)上可見(jiàn)極少量殘留細(xì)胞核(圖2E、圖2F)。

表1 SCAS與正常脊髓特性比較(%)

2.3 體外共培養(yǎng)

共培養(yǎng)1 d 時(shí)，NSCs 散在黏附于支架上(圖3A、圖3B)。共培養(yǎng)7 d 時(shí)，NSCs 在支架上逐漸分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；神經(jīng)元發(fā)育良好，胞體豐滿(mǎn)，形態(tài)各異，軸突清晰，部分神經(jīng)元軸突間建立穩(wěn)定聯(lián)系，形成軸突網(wǎng)絡(luò)(圖3C、圖3D)。共培養(yǎng)7 d 時(shí)，細(xì)胞良好黏附于支架上，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元之下，并分泌相關(guān)物質(zhì)，可見(jiàn)神經(jīng)元軸突間相互連接；神經(jīng)元發(fā)育良好，軸突可深入支架基質(zhì)孔隙中(圖3E、圖3F)。

圖1 NSCs鑒定(bar=100 μm)

圖2 正常脊髓與SCAS形態(tài)學(xué)觀察

3 討論

脊髓損傷康復(fù)臨床路徑包括急性期重建脊柱和神經(jīng)減壓外科治療，以及亞急性和后期綜合康復(fù)[14]。隨著組織工程在各領(lǐng)域研究的日益廣泛，課題組提出脊髓組織工程5R 療法設(shè)想[15]，即先通過(guò)外科手術(shù)挽救(Rescue)脊髓功能，隨后引入脊髓組織工程，通過(guò)支架上種子細(xì)胞促進(jìn)受損脊髓再生(Regeneration)和替代(Replacement)受損神經(jīng)樣細(xì)胞，然后支架的橋接作用增強(qiáng)再髓鞘化(Remyelination)，在各種因素的協(xié)同作用下，獲得最大程度康復(fù)(Rehabilitation)。

圖3 細(xì)胞和支架體外共培養(yǎng)

由于脊髓神經(jīng)的特殊性，選擇不同種類(lèi)細(xì)胞與支架進(jìn)行構(gòu)建可能導(dǎo)致不同結(jié)果。胚胎干細(xì)胞與纖維蛋白支架構(gòu)建導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加[16]。在自組裝肽納米纖維支架中培養(yǎng)靈長(zhǎng)類(lèi)NSCs，分化率與常規(guī)培養(yǎng)無(wú)顯著性差異[17]。探索適宜的構(gòu)建有重要意義。評(píng)估一項(xiàng)新構(gòu)建的效果，通常先進(jìn)行體外共培養(yǎng)，即將細(xì)胞種植在具有三維結(jié)構(gòu)的支架上，使細(xì)胞在支架中遷移和生長(zhǎng)，最終形成細(xì)胞-支架復(fù)合體。

NSCs 是一種組織特異性干細(xì)胞，來(lái)源于神經(jīng)上皮，具有自我更新和定向分化的潛能。相較其他來(lái)源的干細(xì)胞，NSCs 更可能定向分化為神經(jīng)譜系細(xì)胞[18]。將NSCs 與殼聚糖-明膠支架共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)NSCs 的黏附與生長(zhǎng)，并向神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞分化[19]。本研究以大腦皮質(zhì)來(lái)源的NSCs 作為種子細(xì)胞，選用能保持干細(xì)胞特性的原代方式進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NSCs 聚集成桑葚狀神經(jīng)球，直徑可達(dá)150～300 μm，高于常規(guī)生物材料的內(nèi)部孔隙間距，直接以神經(jīng)球方式接種，難以將NSCs種植入支架內(nèi)，也不便于觀察?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)傳代時(shí)胰酶消化加機(jī)械吹打，將神經(jīng)球吹散為單個(gè)細(xì)胞[20]，但由于消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或吹打過(guò)度等原因，導(dǎo)致NSCs 活力降低甚至凋亡。本課題組采用溫和的Acctuase 酶進(jìn)行消化，獲得單個(gè)的細(xì)胞更利于傳代培養(yǎng)與后續(xù)共培養(yǎng)[21]。

已有研究表明[22]，SCAS 可以橋接大鼠受損脊髓，并促進(jìn)損傷后軸突再生和運(yùn)動(dòng)功能康復(fù)。但相對(duì)于脫細(xì)胞真皮基質(zhì)[23]，脊髓組織脫細(xì)胞研究較少，可能與脫細(xì)胞時(shí)間長(zhǎng)(數(shù)十小時(shí))、細(xì)胞脫去不徹底、基質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重而引起失敗率較高有關(guān)[24]。目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究多采用物理結(jié)合化學(xué)萃取，輔以交聯(lián)劑對(duì)經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間脫細(xì)胞過(guò)程而受損的基質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行交聯(lián)[25-26]。本課題組實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，該方法存在制備時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、交聯(lián)劑可能存在化學(xué)毒性等問(wèn)題。因此，本研究對(duì)SCAS 制備的方法進(jìn)行優(yōu)化，避免使用未知毒性的交聯(lián)劑，通過(guò)調(diào)節(jié)振蕩、凍融等相關(guān)參數(shù)，引入超聲振蕩與高低滲交替輔助裂解細(xì)胞法，大大縮短制備時(shí)間，并在脫除細(xì)胞的情況下最大限度保留基質(zhì)結(jié)構(gòu)。檢測(cè)表明，本研究?jī)?yōu)化的脫細(xì)胞法可去除絕大部分細(xì)胞，較完整保留細(xì)胞外基質(zhì)成分與結(jié)構(gòu)。

在此基礎(chǔ)上，本研究將穩(wěn)定傳代的NSCs 與脫去細(xì)胞并保留完整基質(zhì)的SCAS用于構(gòu)建脊髓組織工程，觀察細(xì)胞在支架上的黏附、生長(zhǎng)與分化情況，發(fā)現(xiàn)NSCs 在支架上黏附較好，可在支架上逐漸分化為胞體豐滿(mǎn)、形態(tài)各異、軸突清晰的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，且分化后的神經(jīng)元軸突間建立穩(wěn)定聯(lián)系，形成的軸突網(wǎng)絡(luò)還可深入支架基質(zhì)孔隙中。

綜上所述，本研究制備的SCAS 脫細(xì)胞較徹底，具有多通道空間結(jié)構(gòu)，在體外共培養(yǎng)過(guò)程中適合NSCs 黏附、生長(zhǎng)與分化，構(gòu)建脊髓組織工程具備一定可行性。未來(lái)該類(lèi)構(gòu)建仍需要開(kāi)展更多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估移植后的效果與不良反應(yīng)。相信以NSCs 與SCAS構(gòu)建的脊髓組織工程能夠?yàn)榭祻?fù)醫(yī)學(xué)脊髓損傷領(lǐng)域提供新的應(yīng)用可能。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。