基因編輯產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

王夢(mèng)雨， 王顥潛， 王旭靜， 王志興*

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（分子）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京100176

近年來(lái)，基因編輯技術(shù)、RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)、合成生物學(xué)等轉(zhuǎn)基因新技術(shù)飛速發(fā)展，特別是2020 年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的基因編輯技術(shù)——間隔規(guī)律成簇短回文重復(fù)序列及關(guān)聯(lián)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas），已經(jīng)成為最熱門的轉(zhuǎn)基因工具，為基因功能研究和生物育種開創(chuàng)了新局面[1-2]。2021 年中央一號(hào)文件[3]、中央經(jīng)濟(jì)工作會(huì)議和中央農(nóng)村工作會(huì)議均明確指出要“尊重科學(xué)，嚴(yán)格監(jiān)管，有序推進(jìn)生物育種產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用”“打贏種業(yè)翻身仗”?；蚓庉嫙o(wú)疑是生物育種產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用和打贏種業(yè)翻身仗的關(guān)鍵核心技術(shù)，為政策落實(shí)落地提供了重大支撐。目前，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于水稻、大豆、玉米、番茄等多種植物的研究，并且已經(jīng)有相關(guān)產(chǎn)品在國(guó)外獲得了商業(yè)許可，即將推向市場(chǎng)。基因編輯技術(shù)給傳統(tǒng)的生物育種帶來(lái)巨大推動(dòng)作用的同時(shí)[4]，也向轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管提出了挑戰(zhàn)[5-6]。

基因編輯技術(shù)主要包括3 種：鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）[7]、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）[8]、CRISPR/Cas[9]。基因編輯依賴于經(jīng)過(guò)改造的核酸酶，核酸酶在基因組中特定位置產(chǎn)生位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂（double strand break，DSB），誘導(dǎo)生物體通過(guò)同源重組（homologous recombination，HR）或非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）的方式來(lái)修復(fù)DSB[10]。HR修復(fù)的效率很低，因?yàn)樾枰型雌蔚拇嬖?，以其為模板才能進(jìn)行修復(fù)[11]。而NHEJ修復(fù)，不需要模板，修復(fù)過(guò)程容易出錯(cuò)，從而實(shí)現(xiàn)靶點(diǎn)的堿基替換、缺失、插入和基因表達(dá)的調(diào)控等。利用該技術(shù)對(duì)二倍體植物進(jìn)行基因編輯后，植株單個(gè)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生3種突變結(jié)果：?jiǎn)蔚任换蛲蛔?，也稱雜合突變；雙等位基因突變，2 個(gè)等位基因發(fā)生不同類型的突變；純合突變，2 個(gè)等位基因發(fā)生相同的突變[12-13]。對(duì)于基因編輯可能產(chǎn)生的多種突變結(jié)果，需要更加精準(zhǔn)、高效的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)判定[13]。因此，本文基于基因編輯檢測(cè)中已報(bào)道的技術(shù)方法，從測(cè)序技術(shù)、酶切技術(shù)、PCR 技術(shù)和其他檢測(cè)技術(shù)4 個(gè)方面，對(duì)每種方法的研究應(yīng)用情況和優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析，以期為今后基因編輯產(chǎn)品的檢測(cè)提供借鑒和參考。

1 基于測(cè)序的檢測(cè)技術(shù)

1.1 第一代測(cè)序技術(shù)

以Sanger雙脫氧鏈終止法為代表的第一代測(cè)序技術(shù)，在日?？蒲泄ぷ髦惺褂妙l率很高，該方法可以用來(lái)檢測(cè)動(dòng)植物基因編輯產(chǎn)品。通常分為PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序和PCR 產(chǎn)物克隆后測(cè)序。若直接對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，可將純合突變與野生型進(jìn)行序列比對(duì)，從而獲知具體的突變；若將PCR產(chǎn)物克隆后再測(cè)序，測(cè)序峰圖不會(huì)出現(xiàn)雜亂的雙峰，可以據(jù)此判斷雙等位基因突變和雜合突變的類型[14]。該方法已廣泛應(yīng)用于水稻植株和擬南芥植株中。Sanger法測(cè)序主要適用于簡(jiǎn)單突變的樣品，測(cè)序結(jié)果能更直接地反映突變類型，準(zhǔn)確度高。即使利用其他方法進(jìn)行初篩，最終都需要Sanger法測(cè)序來(lái)確定具體突變類型。但該方法成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、通量低，在檢測(cè)時(shí)工作強(qiáng)度大[10]。

1.2 下一代測(cè)序

下 一 代 測(cè) 序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)又稱第二代測(cè)序技術(shù)。不同的二代測(cè)序平臺(tái)的區(qū)別主要體現(xiàn)在測(cè)序反應(yīng)的技術(shù)上，根據(jù)這些差別可以分為焦磷酸測(cè)序、合成法測(cè)序、連接法測(cè)序和離子半導(dǎo)體測(cè)序。以焦磷酸測(cè)序（pyrosequencing）技術(shù)為例，引物與模板DNA退火后，在DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶這4 種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP 的聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定DNA 序列的目的[15-16]。焦磷酸測(cè)序技術(shù)在檢測(cè)基因編輯水稻[15,17]、基因編輯豬[18]及基因編輯大豆[19]等方面均有廣泛應(yīng)用。焦磷酸測(cè)序是檢測(cè)短片段突變的金標(biāo)準(zhǔn)[17]，使用過(guò)程簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高，可清晰、直觀地獲取突變的具體信息，包括突變位點(diǎn)、類型及等位鏈上變化的堿基數(shù)，已經(jīng)成為中通量單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）基因分型、突變檢測(cè)、拷貝數(shù)研究和DNA甲基化分析的有用工具[17]。但該方法成本較高、耗時(shí)長(zhǎng)、讀長(zhǎng)比較短，不適合大規(guī)模缺失的檢測(cè)，并且后續(xù)的數(shù)據(jù)分析也更復(fù)雜[13]。

2 基于酶切的檢測(cè)技術(shù)

2.1 錯(cuò)配切割法

錯(cuò)配切割法是指識(shí)別并切割不完全配對(duì)的DNA，即用酶切反應(yīng)來(lái)檢測(cè)突變?cè)斐傻膲A基錯(cuò)配。將突變體和野生型目的片段等體積混合，變性復(fù)性后酶切，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，可以估計(jì)突變效率，是基因編輯產(chǎn)品常用的檢測(cè)方法。錯(cuò)配切割酶包括T7核酸內(nèi)切酶I（T7 endonuclease I，T7EI）檢 測(cè)[20-24]、Surveyor 酶[25-29]和Cruiser酶[30]。T7EI酶檢測(cè)法可以檢測(cè)基因編輯的脫靶情況[20]、動(dòng)植物基因組DNA 突變[21,24]，同時(shí)還能檢測(cè)ZFN 技術(shù)在青蛙胚胎中獲得的缺失突變[20]，并且研究表明T7EI 酶檢測(cè)缺失突變的靈敏度要優(yōu)于Surveyor 酶，但不能檢測(cè)單堿基突變[22,31]。Surveyor 酶檢測(cè)法可快速篩查mtDNA 中的小突變[26]以及檢測(cè)單堿基突變[25]，并且Surveyor酶高度敏感[27]，能夠檢出低至32 個(gè)拷貝中的1 個(gè)罕見(jiàn)突變體[27]。通過(guò)Cruiser 酶消化基因組片段，評(píng)估基因組編輯的效率，使用毛狀根轉(zhuǎn)化（hairy-root transformation）方法可以檢測(cè)點(diǎn)突變[30]。錯(cuò)配切割法能對(duì)與DNA 雜交不匹配的基因組進(jìn)行切割，對(duì)靶序列的選擇沒(méi)有限制。但該方法成本較高，對(duì)實(shí)驗(yàn)要求嚴(yán)格，耗時(shí)耗力，容易低估突變頻率[32]，其靈敏性不如PCR/限制性核酸內(nèi) 切 酶（PCR/restriction endonuclease，PCR/RE）技術(shù)。

2.2 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）是PCR 結(jié)合限制性內(nèi)切酶的一種檢測(cè)方法。通過(guò)PCR 擴(kuò)增靶位點(diǎn)的DNA 片段，再用限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)酶切情況判斷靶位點(diǎn)是否被編輯。主要包括酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）分析方法、CAPS 衍生方法和RGEN（RNA-guided endonucleases）介導(dǎo)的 RFLP分析方法3種類型。

CAPS 方 法可分 為 PCR/RE[13,33-34]、RE/PCR 和RE/PCR/RE，可以對(duì)轉(zhuǎn)基因幼苗進(jìn)行基因分型[34]，并且近似估計(jì)突變效率[31]。該方法靈敏度高、檢測(cè)成本較低、操作簡(jiǎn)單，但基因編輯位點(diǎn)附近必須要有適合的酶切位點(diǎn)，且基因編輯后的原酶切位點(diǎn)被破壞，否則會(huì)漏檢[35-36]。其中，PCR/RE 法通常簡(jiǎn)單、敏感，適用于篩選CRISPR/Cas9 誘導(dǎo)的突變體，但受目標(biāo)序列附近的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的可用性限制。

RGEN 是指CRISPR/Cas9 可以特異性切割靶位點(diǎn)，若靶位點(diǎn)被編輯，則無(wú)法切割，最終可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳判斷基因編輯情況。此方法適用于檢測(cè)CRISPR/Cas與少數(shù)TALENs系統(tǒng)的基因組編輯。RGEN 介導(dǎo)的RFLP 分析可以檢測(cè)純合突變克隆，包含相同的雙等位插入/缺失（insertions/deletions，indels）序列，不受核酸酶靶位點(diǎn)附近序列多態(tài)性的限制[37]。但相比于CAPS 方法所使用的限制性內(nèi)切酶，CRISPR/Cas9 或CRISPR/Cas12a價(jià)格更高[13]。

2.3 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是指對(duì)基因組DNA 酶切后，使用特異性引物擴(kuò)增出來(lái)不同長(zhǎng)度的片段，通過(guò)檢測(cè)片段長(zhǎng)度的多態(tài)性，來(lái)判斷靶位點(diǎn)的編輯情況。該方法更適用于大片段的缺失檢測(cè)[38-39]，對(duì)小片段的插入或缺失和堿基替換無(wú)法檢測(cè)，適用范圍有限[13]。

3 基于PCR的檢測(cè)技術(shù)

3.1 臨界退火溫度PCR

臨界退火溫度PCR（at critical temperature PCR，ACT-PCR）主要基于突變體與野生型的退火溫度存在差異。設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)野生型進(jìn)行梯度PCR，確定臨界退火溫度，由于該引物不能與突變體DNA 嚴(yán)格匹配，導(dǎo)致突變體DNA 不能被有效擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后便可篩選出突變體。該方法已成功應(yīng)用于基因編輯水稻和基因編輯斑馬魚中[31]，ACT-PCR 可以準(zhǔn)確地區(qū)分CRISPR/Cas9 誘導(dǎo)的突變體和野生型。該方法比PCR/RE 和T7EI 酶有更高的靈敏度，能檢測(cè)單個(gè)堿基突變的基因編輯產(chǎn)品，操作簡(jiǎn)單，靶點(diǎn)的選擇不受物種限制，適用于大批量突變體檢測(cè)，但對(duì)PCR引物的設(shè)計(jì)和擴(kuò)增條件有較高的要求[40]。

3.2 TaqMan方法

TaqMan 熒光探針是一種寡核苷酸探針，其5'端攜帶發(fā)光基團(tuán)，3'端攜帶淬滅基團(tuán)。由于發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)距離近，發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，收集不到信號(hào)；但當(dāng)PCR 擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使發(fā)光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而可接收到熒光信號(hào)。即每擴(kuò)增一條DNA 鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR 產(chǎn)物形成的完全同步[41-42]。雙熒光探針?lè)╗43]以及鎖定核酸（locked nucleic acid，LNA）探針?lè)╗44]，就是在此原理上進(jìn)行改進(jìn)的，應(yīng)用于植物基因編輯產(chǎn)品的檢測(cè)。TaqMan 方法具有高通量、特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可以檢測(cè)和鑒定單堿基突變，可對(duì)基因編輯位點(diǎn)進(jìn)行分型分析。但儀器、試劑貴，不適合少量樣品操作，無(wú)法區(qū)分雙等位基因雜合突變和純合突變。

3.3 微滴數(shù)字PCR

微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是通過(guò)對(duì)DNA 樣品進(jìn)行微滴化處理，形成眾多納米級(jí)的小液滴，有的小液滴不含待測(cè)靶分子，而有的小液滴含有一個(gè)或多個(gè)待測(cè)靶分子，PCR 擴(kuò)增后收集所有小液滴的熒光信號(hào)。根據(jù)泊松分布原理、陽(yáng)性比例就可以得出靶分子濃度的絕對(duì)定量[45]。該方法最早應(yīng)用在人類細(xì)胞系基因組編輯檢測(cè)方面，隨后Gao 等[46]首次使用ddPCR 對(duì)CRIS-PR 修飾的植物大群體進(jìn)行高通量篩選；并且ddPCR 能夠?qū)崿F(xiàn)超精準(zhǔn)檢測(cè)分析，最低檢測(cè)限（limit of detection，LOD）達(dá)到0.1%，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)多拷貝復(fù)雜基因組物種(如油菜、小麥等)的基因編輯精準(zhǔn)檢測(cè)分析，同時(shí)該方法適用于食品加工品的基因編輯檢測(cè)，如基因編輯水稻制備的米飯等[47]。ddPCR 具有極強(qiáng)的絕對(duì)定量能力，需要的模板量少，實(shí)驗(yàn)結(jié)果很少會(huì)受到引物設(shè)計(jì)因素的影響[48]，具有很高的靈敏度，適合高通量操作。但是合成探針的成本較高，對(duì)樣品DNA 初始濃度有較高的要求。

3.4 等位基因特異性PCR

等位基因特異性PCR（allele specific PCR，AS-PCR）又被稱為擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）。根據(jù)等位基因上的基因編輯位點(diǎn)，設(shè)計(jì)2條上游引物，將突變堿基置于3'端，同時(shí)設(shè)計(jì)1 個(gè)下游引物，只有當(dāng)引物3'端與模板嚴(yán)格互補(bǔ)時(shí)，才能得到PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，反之，則無(wú)PCR 產(chǎn)物。通過(guò)電泳分離，可判斷是否為基因編輯產(chǎn)品。該方法易于操作、成本低廉，不受限制性內(nèi)切酶的限制，對(duì)儀器設(shè)備要求不高，適用于已知基因編輯位點(diǎn)的樣品檢測(cè)。但該方法對(duì)引物設(shè)計(jì)要求較高，不適用于CRISPR/Cas12a造成的突變檢測(cè)[13]。

3.5 高分辨率片段分析法

高分辨率片段分析（high-resolution fragment analysis，HRFA）是PCR 結(jié)合毛細(xì)管電泳的一種檢測(cè)方法。將PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物熒光標(biāo)記，進(jìn)行毛細(xì)管電泳，可檢測(cè)不同分子量大小的PCR 產(chǎn)物，分辨出基因編輯造成的不同突變類型。HRFA 可有效篩選突變體，能夠識(shí)別多個(gè)突變等位基因，分辨率為1 bp[49]。該方法靈敏度較高，適用于多倍體植物的檢測(cè)，可以分析多個(gè)基因位點(diǎn)突變情況，還可以區(qū)分小到單個(gè)堿基的插入或缺失。但其無(wú)法檢測(cè)出含有單堿基替換的突變，也不能區(qū)分具有相同片段大小插入或缺失的突變[13]。

3.6 高分辨率熔解曲線法

高分辨率熔解曲線（high-resolution melting，HRM）分析方法的原理是：雙鏈DNA 的熔解溫度跟它的長(zhǎng)度和堿基組成有關(guān)，當(dāng)堿基發(fā)生突變后，堿基之間的作用力也會(huì)隨之改變，從而影響解鏈溫度，突變體與野生型則會(huì)產(chǎn)生不同的熔解曲線，可據(jù)此檢測(cè)基因編輯造成的突變、SNP 和甲基化[50-51]。該方法具有極高的靈敏度和特異性、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快，特別適用于高通量操作。但HRM 不能區(qū)分野生型和AT 顛換的突變序列，分析設(shè)備昂貴，SNP 位點(diǎn)會(huì)有干擾，不能進(jìn)行定量檢測(cè)。

3.7 異源雙鏈泳動(dòng)分析法

異源雙鏈泳動(dòng)分析法（heteroduplex mobility assay，HMA）的原理是：野生型和突變體分子雜交后產(chǎn)生異源雙鏈DNA 分子，與同源雙鏈DNA 分子相比，在電泳中的遷移率不同，從而可以區(qū)分基因有沒(méi)有發(fā)生突變。HMA 可以檢測(cè)植物體16S rDNA[52]、基因編輯動(dòng)物[53-54]，靈敏度可至單堿基水平[53]；同時(shí)對(duì)HMA 進(jìn)一步改造，研發(fā)出兩步混合HMA（mixing HMA，mHMA）方法來(lái)識(shí)別純合突變體[55]。HMA 與錯(cuò)配切割方法相比，省去了酶切步驟，避免了切割不完全導(dǎo)致的假陽(yáng)性，但是容易錯(cuò)過(guò)大片段的缺失突變。

3.8 單鏈構(gòu)象多態(tài)分析法

單鏈構(gòu)象多態(tài)（single-strand conformational polymorphism，SSCP）分析法的原理是：當(dāng)單鏈DNA 分子中的一個(gè)堿基發(fā)生變化時(shí)，可引起空間構(gòu)象改變，這種差異會(huì)導(dǎo)致DNA 分子在電泳時(shí)的遷移率不同。SSCP 是一種經(jīng)典的SNP 檢測(cè)方法，可以有效地檢測(cè)CRISPR/Cas9 編輯水稻，成功鑒定多個(gè)突變體[56]。針對(duì)小片段插入、缺失和錯(cuò)配的檢測(cè)，該方法靈敏度要高于RFLP，且不受酶切位點(diǎn)的限制。但其不能確定基因編輯類型，只適合初篩。

3.9 聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）的原理是：?jiǎn)捂?DNA 的構(gòu)象隨堿基的變化而發(fā)生改變，不同構(gòu)象的DNA 在變性聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速率不一樣。因此，PAGE法也用作CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯后代的突變檢測(cè)。該方法可成功檢測(cè)基因編輯油菜，除1 bp indels外，其余不同大?。?～8 bp）的缺失都可以與野生型區(qū)分開來(lái)[57]。PAGE靈敏性高，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

3.10 連接酶檢測(cè)反應(yīng)

連接酶檢測(cè)反應(yīng)（ligation detection reaction，LDR）是在連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ligase chain reaction，LCR）的基礎(chǔ)上改進(jìn)而成。高溫連接酶一旦檢測(cè)到與DNA 互補(bǔ)的2 條寡聚核苷酸，在接頭處有點(diǎn)突變類型的堿基錯(cuò)配，連接反應(yīng)就不能進(jìn)行。探針與模板只有在配對(duì)的情況下，連接反應(yīng)才能進(jìn)行，通過(guò)溫控循環(huán)，連接反應(yīng)可反復(fù)進(jìn)行，達(dá)到線性擴(kuò)增的效果。LDR 可以區(qū)分小的indels 和SNP[58]；LDR 結(jié)合 PCR 和 qPCR 的檢測(cè)方法，能夠在野生型過(guò)量存在時(shí)，以單分子分辨率檢測(cè)點(diǎn)突變[59]。該方法可以用于基因分型、檢測(cè)SNP 位點(diǎn)和點(diǎn)突變，以及檢測(cè)ZFN、TALENs 和CRISPR/Cas9 造成的基因突變。但是LDR 通量低，同時(shí)難以滿足基因編輯產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化后定量標(biāo)識(shí)的需求。此外，由于LDR 檢測(cè)方法需要已知的序列信息，所以不能用于突變體的初篩[59]。

4 其他檢測(cè)技術(shù)

4.1 基因芯片分析法

基因芯片（gene chips），又叫做 DNA 芯片、DNA 微陣列（DNA microarray），是利用核酸雜交原理建立的一種集成化、自動(dòng)化的檢測(cè)技術(shù)。將待測(cè)樣品DNA 與固定在芯片上的陣列探針雜交，通過(guò)激光共聚焦掃描來(lái)檢測(cè)熒光信號(hào)，并對(duì)強(qiáng)弱進(jìn)行判斷，從而判斷是否進(jìn)行過(guò)基因編輯?；蛐酒夹g(shù)在SNP 分析方面也有廣泛應(yīng)用[60-61]。但其只適用于少量堿基改變的基因編輯產(chǎn)品檢測(cè)。

4.2 變性高效液相色譜法

變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）是基于 SSCP 和變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）研發(fā)的一種新的突變位點(diǎn)檢測(cè)方法。原理類似于陰離子交換層析，通過(guò)變性退火后形成同源或異源雙鏈DNA 分子，調(diào)節(jié)溫度接近至DNA 解旋溫度，異源雙鏈DNA 分子解旋溫度低，更易解旋為單鏈，單鏈在分離柱上保留時(shí)間短，易被洗脫，根據(jù)峰型或數(shù)目來(lái)確定是否有突變[60]。DHPLC 方法的檢測(cè)效率高、自動(dòng)化程度高，比較適合大樣本自動(dòng)化篩選，重復(fù)性較高。但該方法對(duì)于試劑和環(huán)境要求較高，且不能檢測(cè)出純合突變。

4.3 質(zhì)譜分析方法

根據(jù)不同的電離技術(shù)，可將質(zhì)譜技術(shù)分為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight，MALDI-TOF）、電噴霧離子化質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）、MassARRAY 質(zhì)譜分析技術(shù)等。將變性的單鏈產(chǎn)物共價(jià)結(jié)合到芯片上，在芯片上進(jìn)行引物的退火、延伸反應(yīng)，由于編輯部位配對(duì)的堿基與正常配對(duì)堿基的質(zhì)量不同，通過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜可檢測(cè)出不同的峰值。目前MALDI-TOF 是應(yīng)用于SNP 質(zhì)譜檢測(cè)的主要方法[62]，已成功應(yīng)用于Y-SNP 位點(diǎn)分析[63]；MassARRAY 質(zhì)譜分析技術(shù)可進(jìn)行基因分型[64-65]。質(zhì)譜分析方法無(wú)需對(duì)靶序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，適用于少量堿基突變的基因編輯產(chǎn)品的檢測(cè)。

上述3 種方法，尚無(wú)用于基因編輯產(chǎn)品檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道，但已成功應(yīng)用于SNP的檢測(cè)，具有后續(xù)應(yīng)用于基因編輯產(chǎn)品檢測(cè)的潛力。

5 展望

根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA）2020 年最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2019年全球29個(gè)國(guó)家種植了1.904億hm2轉(zhuǎn)基因作物，種植面積比1996 年增加了約112 倍[66]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外生物技術(shù)革命和產(chǎn)業(yè)變革加速推進(jìn)，以基因編輯為代表的轉(zhuǎn)基因新技術(shù)發(fā)展迅速，轉(zhuǎn)基因性狀更加多樣，新產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)?；蚓庉嫾夹g(shù)給傳統(tǒng)的生物育種帶來(lái)了效率的提升和技術(shù)門檻的降低，是助力種業(yè)彎道超車、開展種源“卡脖子”技術(shù)攻關(guān)的關(guān)鍵。

基因編輯產(chǎn)品根據(jù)雙鏈DNA 斷裂后的不同修復(fù)機(jī)制分為3 類：第一類（SDN1）不引入修復(fù)模板及任何外源基因，只存在點(diǎn)突變、少量幾個(gè)堿基插入或缺失；第二類（SDN2）引入同源修復(fù)模板，通過(guò)同源重組，導(dǎo)致基因組1 個(gè)到幾個(gè)堿基突變（＜20 bp）；第三類（SDN3）為通過(guò)同源重組修復(fù)途徑，在靶位點(diǎn)插入大片段外源基因[67]。相比于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品而言，基因編輯技術(shù)在受體生物內(nèi)留下的痕跡較少，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)很難滿足基因編輯產(chǎn)品的檢測(cè)，特別是SDN1 和SDN2 這類只涉及少量堿基改變的產(chǎn)品，因此，需要加強(qiáng)檢測(cè)新技術(shù)的研究，建立針對(duì)基因編輯產(chǎn)品等新技術(shù)產(chǎn)品的檢測(cè)方法。

對(duì)于SDN1 類和SDN2 類編輯位點(diǎn)和序列已知的基因編輯產(chǎn)品，可使用ACT-PCR 分析方法、Taqman 方法、ddPCR 分析方法、AS-PCR 分析方法等中的一種或幾種進(jìn)行初篩，對(duì)篩查得到的疑似或陽(yáng)性樣品再通過(guò)Sanger法測(cè)序或NGS測(cè)序進(jìn)一步確定，可大幅減少工作量；對(duì)于SDN3 類編輯位點(diǎn)和序列已知的基因編輯產(chǎn)品，可參照目前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)策略對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于編輯位點(diǎn)和序列未知的基因編輯產(chǎn)品，可根據(jù)熱門編輯位點(diǎn)和常見(jiàn)脫靶位點(diǎn)等，采用錯(cuò)配切割法、RFLP 分析方法、AS-PCR分析方法、HRFA分析方法、HRM分析方法、SSCP 分析方法、DHPLC 分析方法、質(zhì)譜分析方法等中的一種或幾種進(jìn)行初篩，對(duì)篩查得到的疑似或陽(yáng)性樣品再通過(guò)Sanger法測(cè)序或NGS測(cè)序進(jìn)一步確定。同時(shí)，通過(guò)測(cè)序結(jié)合大數(shù)據(jù)分析對(duì)未知基因編輯產(chǎn)品進(jìn)行鑒別也是未來(lái)檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)之一。

就目前來(lái)說(shuō)，PCR/RE、Sanger 法測(cè)序、NGS 測(cè)序技術(shù)和錯(cuò)配切割法應(yīng)用比較廣泛。其他方法的應(yīng)用相對(duì)較少。選擇何種檢測(cè)方法，與基因編輯效率、突變類型、植物倍性等密切相關(guān)。并且每種方法都存在自身局限性，檢測(cè)時(shí)可以根據(jù)具體需求進(jìn)行選擇，利用單一或多種方法結(jié)合起來(lái)進(jìn)行檢測(cè)、驗(yàn)證。

與此同時(shí)，基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展也給我國(guó)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管工作帶來(lái)了前所未有的挑戰(zhàn)。結(jié)合我國(guó)現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因監(jiān)管和基因編輯技術(shù)的發(fā)展情況，應(yīng)當(dāng)完善基因編輯產(chǎn)品相關(guān)管理政策、法規(guī)。目前我國(guó)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)管與安全評(píng)價(jià)的主要依據(jù)是《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理辦法》及《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)指南》等，但由于基因編輯產(chǎn)品的特殊性，現(xiàn)行法規(guī)并不完全適用，應(yīng)遵循“個(gè)案分析”與“分類管理”相結(jié)合的原則，制定、修訂相關(guān)法律法規(guī)，完善安全評(píng)價(jià)與監(jiān)管制度，加強(qiáng)基因編輯產(chǎn)品的管理。

隨著基因編輯產(chǎn)品的不斷涌現(xiàn)，對(duì)其進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)以及檢測(cè)方法的多樣性也將成為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)流程構(gòu)建的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)，優(yōu)化突變檢測(cè)技術(shù)仍是今后的努力方向。加快基因編輯產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)方法的研究，以保護(hù)研發(fā)人員的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，為國(guó)家安全監(jiān)管監(jiān)測(cè)提供有力的技術(shù)支撐。