RNAA-sseeqq技術在水生生物生態(tài)毒理學中的應用進展

柯楊， 馬瑜，*， 朱海云， 張育輝

1.陜西省微生物研究所，西安710043；2.陜西師范大學生命科學學院，西安710119

水域是地球環(huán)境的重要組成部分，也是最易受污染的生態(tài)系統之一，其變化影響著整個生態(tài)系統及人類的生存。水生態(tài)系統中不同營養(yǎng)級別的水生生物，如甲殼類、魚類及兩棲類等，均可通過攝食、接觸等多種途徑攝入水體中的污染物；同時，水域污染物也可通過直接毒性（短/長期暴露）和間接毒性（如生殖生理毒性及環(huán)境適應性）等多種途徑影響水生生物的生存[1]。因此，研究水生生物對水域環(huán)境污染的響應有助于快速準確地檢測環(huán)境污染水平、評價環(huán)境風險及尋求新的生物標志物。此外，人口增長和化學工業(yè)的發(fā)展導致許多污染物和毒素釋放到環(huán)境中，這些污染物和毒素在環(huán)境中的降解、蓄積、遷移和轉化過程會對生態(tài)系統和人類健康造成威脅。因此，監(jiān)測這些污染物和毒素對生物體和生態(tài)系統的影響是生態(tài)毒理學的研究重點，而敏感、有效的生物標志物對生態(tài)毒理學研究和環(huán)境風險評價具有重要意義[2]。

水生生物生態(tài)毒理學可從不同層面闡明有毒化學物質對水生生物以及生態(tài)環(huán)境的影響，預測并減少或防止水生污染物對環(huán)境的有害影響[3]。隨著分子生物學的發(fā)展，傳統以動物為基礎的個體、組織和器官水平的毒理學研究，實現了向細胞和分子水平的跨越。此前，基于微陣列和RNA 測序（RNA sequencing，RNA-seq）技術的基因表達分析已經應用于水生物種的生態(tài)毒理學研究中[4]。而基于雜交基礎的微陣列技術只限用于已知序列，且雜交技術靈敏度有限，難以檢測低豐度的目標、重復序列及異常的轉錄產物，因而逐步被RNA-seq技術所替代。

RNA-seq技術是基于二代測序技術（next-generation sequencing，NGS）進行轉錄組學研究的方法，應用該方法對特定生理條件下，一個或多個細胞內所有轉錄產物或所有mRNA的集合進行轉錄組分析，可全面快速地獲得特定狀態(tài)下的特定組織或器官幾乎所有的轉錄本序列信息，從整體水平上分析基因的轉錄及其調控規(guī)律，精確檢出特定基因的表達水平、差異剪接及轉錄本的等位基因特異性表達[5]。與傳統的文庫構建、測序相比較，RNA-seq 技術具有所需樣品量少、背景信號低、成本較低等優(yōu)勢[6]。此外，在水生生物生態(tài)毒理學研究中，RNA-seq 技術可用于分析缺乏基因表達數據和參考基因組（reference genome）信息的非模式生物的毒理分子機制。傳統的研究方法受樣本量及檢測尺度的限制，不能在整體水平上反映細胞中基因轉錄的情況及調控規(guī)律，從而限制了對污染物毒理機制的深入分析；而RNA-seq 技術所需樣品量少，可在整體水平上鑒別因環(huán)境因子改變而導致的轉錄組水平差異變化，成為鑒別環(huán)境污染物脅迫下機體基因差異表達變化的可靠手段。同時，RNA-seq 技術在尋找新的生物標志物、發(fā)現新的毒性通路中也扮演著重要角色。因此，RNA-seq 技術成為水生生物生態(tài)毒理學研究的最佳方法之一。

目前，已有許多水生生物作為水生態(tài)毒理學研究的指示物種被用于研究污染物對不同生態(tài)位水生生物的毒性效應及其作用機制[7]。本文介紹了RNA-seq 技術的基本流程與數據分析過程，同時也對該技術在不同生態(tài)位的水生毒理學研究中的應用進展、優(yōu)勢、挑戰(zhàn)及發(fā)展趨勢進行了探討，以期為該技術在水生生物生態(tài)毒理學研究中的應用，尤其是水生態(tài)環(huán)境中污染物脅迫水生生物機制的闡明及污染水域生態(tài)環(huán)境恢復提供參考。

1 轉錄組測序

利用RNA-seq技術進行轉錄組測序的步驟主要包括文庫構建、平臺測序及數據分析。平臺測序中，目前商業(yè)應用的主要有454 FLX SOLiD?（Roche）、SOLiD?（Applied Biosystems）、Solexa GA（Illumina Life Technologies）這 3 個二代高通量測序平臺。該平臺依賴于體外克隆步驟（克隆擴增）來擴增無細胞系統中每個片段化的cDNA分子[8-9]。

盡管RNA-seq技術的應用使獲取轉錄組序列更便捷，但會產生大量的原始序列，這些序列必須經過生物信息學軟件和工具處理才能獲得有效的信息，因此，對于測序數據的分析處理尤其重要。利用RNA-seq 得到的海量原始序列需進行過濾、剪切和校正，從而去除低質量序列、短序列、銜接子序列及污染序列，然后再進行讀段定位、轉錄本組裝、轉錄本定量及差異表達分析。常用的RNA-seq測序數據處理工具見表1。

表1 RNA-seq測序數據處理軟件Table 1 Processing tools of RNA-seq sequencing data

2 RNAA--sseeqq 技術在水生生物生態(tài)毒理學中的應用

隨著測序技術的發(fā)展，RNA-seq 技術越來越多的應用于水生生物生態(tài)毒理學研究中。利用該技術對暴露于污染水體中不同生態(tài)位的水生生物進行轉錄組測序和分析，可獲得差異表達基因，進而了解基因的表達情況及其調控機理。同時，RNA-seq 技術的應用，有利于深入研究不同污染物脅迫水生生物的分子毒性機制。此外，轉錄組測序篩選獲得的分子生物標志物，可用于水域環(huán)境污染物的評估及預測，對水域環(huán)境污染進行預警。

2.1 RNAA--sseeqq 技術在魚類生態(tài)毒理學研究中的應用

魚類作為水生食物鏈的頂端生物，是水生態(tài)系統的重要組成部分，在水生生物生態(tài)毒理學研究中具有重要作用。目前，斑馬魚（Danio rerio）是水生生物生態(tài)毒理學研究通用的模式生物。汞是水環(huán)境中一種廣泛的有毒物質，會對魚類造成有害影響。采用RNA-seq技術對低濃度氯化汞（24～120 hpf HgCl2）暴露下斑馬魚幼體發(fā)育的轉錄組進行分析，分別獲得391 個上調基因和87 個下調基因，包括補體激活（cfb、c3a、c3b和c3c）、化學刺激響應（keap1a、keap1b）、蛋白酶體通路（psme1、psme2）、核受體信號傳導通路（nr1d1、nr4a1和nr1d2a）及蛋白激酶（sgk1、sgk2b）等與汞調節(jié)相關的基因，上述這些基因可作為潛在的生物標志物，與汞的分析化學檢測結合起來，用于檢查和評估汞污染的嚴重程度。此外，還表征了一種新的汞誘導 ABCB（ATP-binding cassette B subfamily）轉運蛋白基因abcb5，該基因的過表達可顯著降低汞對細胞的毒性。上述研究結果有助于進一步了解斑馬魚幼蟲急性接觸汞后的轉錄反應和解毒能力[25]。氯氰菊酯（beta-cypermethrin，BCP）和毒死蜱（chlorpyrifos，CPF）在農業(yè)中的廣泛應用引起的水環(huán)境污染問題已引起廣泛關注。對暴露在BCP、CPF及這2種農藥混合物下的斑馬魚幼體進行RNA-seq，結果顯示，與單一農藥暴露組相比，農藥混合暴露組對斑馬魚轉錄組的影響更大，獲得的差異表達基因數量更多[26]。

目前，關于污染物對魚類幼體全轉錄特征和分子機制的研究主要集中于斑馬魚上，而將RNA-seq 技術用于研究更多魚類發(fā)育中污染物誘導的轉錄特征，以確定用于監(jiān)測水生環(huán)境中污染物的生物標記物，對于水域生態(tài)環(huán)境保護具有非常重要的意義。利用RNA-seq 技術對暴露于8.0 mg·kg-1甲基毒死蜱（chlorpyrifos-methyl）前后的大西洋鮭魚（Salmo salar）腦、肝組織進行轉錄組分析，結果顯示，暴露30 d后，在腦組織中有98個顯著差異表達基因（differentially expressed genes,DEGs），而在暴露 67 d 時僅發(fā)現了 2 個；相較之下，在肝組織中分別獲得239、258 個DEGs，DEGs累積效應與暴露時間正相關。這說明甲基毒死蜱可影響其腦組織中與神經疾病和脂質代謝相關的基因轉錄表達[27]。水環(huán)境中鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯[Di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]可通過食物鏈在水生生物體內積累。通過研究DEHP對羅非魚肝臟轉錄組的影響，分別獲得3 217個上調基因和1 791 個下調基因。這些差異表達基因主要與機體免疫、生殖內分泌以及脂類代謝相關，可為在轉錄組水平篩選DEHP 生物標志物、解析DEHP 對羅非魚毒性作用的分子機制提供科學參考[28]。

在水環(huán)境中，污染物通常以復雜化合物的混合物形式存在，與單一污染物相比，可能對生物體產生更為復雜的影響。如石油泄露可影響魚類種群數量和多樣性。通過RNA-seq技術分析重質原油（Iranian heavy crude oil，IHCO）對胚胎發(fā)育期的野生牙鲆（Paralichthys olivaceus）及花鱸（Lateolabrax maculates）的發(fā)育毒性作用表明，IHCO 暴露可使這2種魚的基因表達發(fā)生改變，其中，具有解毒代謝功能的CYP1A1、CYP1B1、AHR 2等基因顯著上調，而發(fā)育相關ORG基因則顯著下調。此外，牙鲆胚胎對新鮮重質原油和風化的重質原油均敏感，而花鱸胚胎對風化的重質原油比對新鮮的重質原油表現出更高的敏感性，這表明物種特異性差異很可能反映在漏油事件后的種群水平中[29]。

早前的研究大多集中在單一污染物的毒性上，較少關注多種毒物的綜合毒性以及它們之間相互作用，采用RNA-seq技術，可鑒定不同物種中對混合污染物有特異性反應的基因，用作環(huán)境風險評估的潛在分子標記。因此，RNA-seq 技術是研究污染環(huán)境對魚類生態(tài)毒理效應的有效方法，有助于闡明污染物暴露下魚類的轉錄調控的分子機制，篩選差異表達基因及生物標志物，為水域環(huán)境污染評估提供依據。

2.2 RNAA--sseeqq 技術在兩棲類生態(tài)毒理學研究中的應用

兩棲動物的胚胎及幼體發(fā)育過程均在水域中進行，其皮膚對水體中的化學物質具有較高的滲透性，也是檢測水域環(huán)境化學污染的理想物種。利用RNA-seq 技術研究有機磷殺蟲劑敵百蟲（trichlorfon）對中國林蛙（Rana chensinensis）成體肝臟的毒性作用機制，共獲得3 329 個DEGs，其中，與機體代謝和氧化應激相關基因的mRNA表達水平顯著改變。如外源毒性物質對CYP3A具有調節(jié)作用，毒性物質敵百蟲在機體內的蓄積可抑制CYP3A1基因表達；此外，外源毒性物質可通過轉錄或有機體體內的不完全降解來影響GST基因的表達，GST基因表達的下調說明它對敵百蟲在林蛙體內的毒性降解等生理學過程具有重要作用[30]。水生環(huán)境中普遍存在的硝酸鹽成分可能對兩棲動物的生存、發(fā)育和變態(tài)有不利影響。利用RNA-seq 技術對硝酸鹽（nitrate）暴露前后的中華蟾蜍（Bufo gargarizans）蝌蚪的肝臟組織進行轉錄組分析，結果顯示，硝酸鹽暴露可引起膽汁分泌和氧化應激等相關基因在mRNA水平上的表達顯著改變，進而導致肝組織病理變化[31]。過量氟會對人類和動物的骨骼發(fā)育產生損害。應用RNA-seq技術對持續(xù)暴露在1、5、10和20 mg·L-1的氟化鈉4周后各處理組中G40 和G42 期B.gargarizans蝌蚪后肢進行轉錄組測序分析，結果表明，高濃度的氟化物會影響骨化相關基因mRNA 的表達，進而抑制軟骨內骨化[32]。

上述研究應用RNA-seq技術獲得了污染物暴露下中國林蛙和中華蟾蜍的轉錄組信息，通過對轉錄組數據的分析，有助于探究環(huán)境污染物對兩棲動物生長發(fā)育的毒理機制及組織病理變化機制，對了解非模式物種的毒性機制具有重要價值，可為兩棲物種的保護提供理論支持。同時，RNA-seq 技術的應用也為兩棲物種環(huán)境暴露的分子機制提供了研究基礎，可作為水環(huán)境風險管理以及水生生物生態(tài)毒理學研究的依據。

2.3 RNAA--sseeqq 技術在貝類生態(tài)毒理學研究中的應用

貝類可通過濾食方式攝食環(huán)境中的污染物，也是水生生物生態(tài)毒理學研究的理想指示物種。采用RNA-seq 技術分析多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）對扇貝（Chlamys farreri）消化腺轉錄組的影響發(fā)現，PAHs 可顯著改變應激反應、解毒、抗氧化等基因的表達[33]。其中，細胞色素P450（CYP4503A2、CYP4502P1）基因、醌氧化還原酶（quinone oxidoreductase，QO）基因和谷 胱 甘 肽-S-轉 移 酶（glutathione-S-transferase，GST）基因等上調基因可能作為PAHs 污染的潛在生物標志物，為進一步研究雙殼類對PAHs 污染響應的分子機制及生物標志物的選擇提供依據。利用RNA-seq 技術對暴露于敵草隆（diuron）的太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）子代幼體進行轉錄變化研究發(fā)現，將親代暴露于污染物中會導致子代機體中與能量、蛋白質合成及有絲分裂相關基因的轉錄水平升高，并且會在不同代際間傳遞[34]。此外，RNA-seq 技術也可用于研究水污染對貝類的生態(tài)毒理學效應，結果顯示，多瑙河沿岸垃圾傾倒點上下游貽貝（Margaritifera margaritifera）樣本轉錄組信息僅存在細微差異，老齡貽貝的初級代謝和生理機能受到影響，而幼齡個體對暴露于環(huán)境中的污染物則具有更好的恢復及適應能力[35]。這一研究表明，年齡相關的個體之間的變異性可對污染物導致的影響產生掩蓋或偏差，因此，對于長壽命雙殼動物的生態(tài)毒理學研究應限制在一個年齡范圍內，有利于對研究結果做出正確的判斷并對物種采取適當的保護措施。另一項轉錄組研究結果顯示，長期暴露于污水和城市徑流中的河蜆（Corbicula fluminea）參與排毒的基因顯著上調，說明這2 個位點都存在有機污染。轉錄組測序的結果表明，接觸有機污染物可干擾細胞信號通路，從而導致能量障礙、細胞損傷、免疫紊亂和內分泌紊亂。RNA-seq 技術的應用可在整體水平上觀察到對生物體的有害后果之前，對水質污染做出預警[36]。

2.4 RNAA--sseeqq 技術在甲殼類生態(tài)毒理學研究中的應用

水域環(huán)境或養(yǎng)殖系統的污染也會對甲殼類水生生物產生毒性作用。利用RNA-seq技術對暴露于原油的綠尾蝦（Metapenaeus bennettae）肝胰腺進行轉錄組分析，獲得了參與生物體解毒及氧化應激的多種生物標志物，如細胞色素p450（cytochrome P450s）、甲殼類高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone，CHH)蛋白和熱休克蛋白(heat shock proteins，Hsps)，用于判斷原油污染的存在[37]。對不同濃度Cd 處理后淡水蟹(Sinopotamon henanense)的肝胰腺進行RNA-seq 測序和基因表達分析的結果表明，Cd 暴露以濃度依賴的方式改變基因表達，參與大分子代謝、氧化磷酸化、解毒和抗氧化防御的基因上調，而除參與吞噬作用外的其他免疫相關基因下調，提示淡水蟹可能通過增加代謝、排毒和抗氧化防御相關基因的表達水平而在轉錄組水平上降低Cd 的毒性[38]。應用RNA-seq技術考察了大型溞在攝食經納米銀和銀離子暴露的斜生柵藻細胞后的基因毒性作用，結果表明，編碼磷脂酶PLA2G和磷脂酶D基因的表達量均下調，導致磷脂酶的合成量下降，進而影響到大型溞小腸正常的消化功能及磷脂類脂質的代謝過程[39]。集約化養(yǎng)殖系統和環(huán)境污染產生的高濃度氨會對對蝦類產生脅迫作用。然而，目前對于該脅迫相關的分子機制知之甚少。應用RNA-seq 技術分析凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的抗氨氮脅迫關鍵基因和代謝途徑，結果顯示，14 個 GO 功能注釋和 6 個 KEGG 通路顯著改變，在獲得的3 145 個DEGs 中有136 個與水生物種中已知的基因具有較高的同源性，有94 個與免疫功能相關，其余的基因參與細胞凋亡、生長、蛻皮和滲透調節(jié)。此外，與凋亡和氨氮代謝有關基因表達的改變在減少氨的毒性中起重要作用[40]。上述結果反映了急性氨脅迫早期對基因表達和代謝通路的影響。氨脅迫可抑制免疫系統，增加蝦對病原體的易感性，該研究將為進一步研究氨脅迫引起對蝦免疫抑制的分子機制提供重要信息。

綜上，RNA-seq 技術研究有助于在分子水平上開展污染物毒性作用機理及環(huán)境風險早期評價方面的研究。通過對外源污染物脅迫下基因表達動態(tài)（上調或下調）和代謝途徑變化的分析，可為污染暴露脅迫下機體的代謝反應機理研究提供分子基礎，同時也可篩選水生環(huán)境重金屬污染檢測的生物標記物，為水生態(tài)環(huán)境風險評價提供科學依據。

3 展望

水域是水生生物賴以生存的環(huán)境，隨著工業(yè)化、城市化進程的加速，水污染不僅嚴重威脅著水域生態(tài)系統平衡，影響水生生物的生存、繁衍，還可通過食物鏈傳遞，危害人類健康[41]。而RNA-seq 技術在水生生物生態(tài)毒理學研究中的應用，對于闡明有毒化學物對水生生物的影響、預測并減少水體污染物對水生生物和環(huán)境的影響等均具有優(yōu)勢。目前，水生生物中僅有模式生物斑馬魚和少量水生生物的基因組可作為參考序列，而RNA-seq 技術的應用不需要參考基因組，可直接將得到的序列與數據庫中的核苷酸序列進行比對、基因功能分類與注釋。

與傳統的文庫構建、測序技術相較，RNA-seq技術的應用具有一定的優(yōu)勢，如所需樣品量少、背景信號低、成本較低。但其技術本身仍存在不足。首先，RNA 提取過程需去除rRNA 會帶來改變其他RNA 濃度的潛在風險，有可能使檢測到的RNA 發(fā)生偏差。其次，測序平臺需要在測序之前進行擴增，這一步驟會根據GC 含量和長度引入偏差[42]。與此同時，RNA-seq 技術也面臨著一些挑戰(zhàn)：①測序所產生的海量數據的高效快捷處理，需要研究開發(fā)更好的數據處理方法和軟件；②如何通過理論與技術的系統結合，將RNA-seq數據分析、綜合、存儲與傳統生物學、化學、毒理學研究有效結合起來，使其更好地在水生生物毒理學研究中發(fā)揮作用，有待更深入的研究；③由于基因組中轉錄活性變化很大，如何選擇合適的測序深度以達到足夠的覆蓋度并降低檢測成本，還需要進一步考量[5]。

在過去的十幾年里，RNA-seq 技術的應用對于水生生物對環(huán)境污染物的反應所涉及的分子機制的研究起到了很好的推動作用?，F有的研究主要是應用RNA-seq技術來研究有毒物質對某一個特定時期的水生生物的影響，而低劑量或實際環(huán)境濃度的水域污染對處于不同發(fā)育階段水生生物的毒性作用機制的動態(tài)研究尚欠缺，后續(xù)需加強這方面的研究[43]。RNA-seq 技術在水生生物生態(tài)毒理學研究中的應用，不僅為研究污染物脅迫下水生生物機體轉錄調控機制提供了便利，而且也為特定藥物毒理學研究提供了平臺，同時其所產生的轉錄組數據也可為不同水生生物的相關研究提供理論依據。