miR-33b靶向Myc對T細胞活化的調(diào)控及其在擴張型心肌病中的作用①

黃 侃 史慧穎 王淑男 霍艷萍 劉燦君 那靜濤

(齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院心血管二科,齊齊哈爾 161000)

擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)屬于原發(fā)性心肌病，其主要特征為心臟收縮功能障礙及左心室擴張，其具有較高的發(fā)病率并可導致患者心力衰竭[1]。目前DCM發(fā)病機制尚未完全闡明，既往研究認為免疫紊亂、自身免疫心肌炎及炎癥損傷等均可導致DCM發(fā)生[2]。故而深入探究DCM患者免疫紊亂機制對尋找DCM治療靶點具有重要意義。CD4+T細胞屬于免疫系統(tǒng)重要細胞亞群，研究發(fā)現(xiàn)DCM患者心臟組織均發(fā)生CD4+T細胞浸潤，CD4+T細胞可促使炎癥介質(zhì)釋放并引起心肌細胞凋亡進而導致心功能惡化[3]。同時相關(guān)報道指出DCM患者外周血中表面活化標記物CD25和CD69表達增加并可促進心衰發(fā)生[4]。以上研究表明DCM患者體內(nèi)存在細胞免疫紊亂并可能促進心功能惡化。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性單鏈小RNA并可通過調(diào)控靶基因表達進而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后表達，研究顯示miRNA可調(diào)控T淋巴細胞發(fā)育及分化等過程[5]。研究表明 T細胞活化后微小RNA-33b(miR-33b)表達水平明顯降低并可調(diào)控機體免疫系統(tǒng)[6]。CD4+T細胞異?；罨梢l(fā)DCM患者炎癥損傷，miR-33b又可調(diào)節(jié)T細胞活化，但miR-33b與CD4+T細胞在DCM發(fā)病機制中的作用關(guān)系尚未研究。通過生物信息學軟件預測Myc是miR-33b的靶基因，Myc作為多效能轉(zhuǎn)錄因子又可被T細胞中細胞因子激活進而參與細胞增殖及分化過程[7]。因此，本研究通過分析miR-33b對T細胞活化的調(diào)控作用及其在DCM發(fā)生過程中的作用，初步探討其是否通過靶向調(diào)控Myc表達來發(fā)揮作用，為進一步揭示DCM患者免疫活化機制提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1DCM患者一般資料 收集2015年3月至2016年4月本院收治的45例DCM患者為研究對象，作為DCM組，所有患者均符合WHO原發(fā)性擴張性心肌病診斷標準[8]。DCM組患者中男25例，女20例，年齡45～67歲，平均年齡為(52.31±5.52)歲。同時選取同期本院體檢中心健康志愿者30例為正常組，其中男18例，女12例，年齡42～70歲，平均年齡為(53.62±6.17)歲。兩組受試者年齡、性別等比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：DCM患者左心室舒張期末直徑高于5.5 cm且右心室射血分數(shù)低于45%；未接受類固醇激素等治療者。排除標準：血性心肌病患者；合并高血壓性心臟病及心臟瓣膜病患者；自身免疫性疾病或嚴重感染者；合并嚴重內(nèi)分泌疾病患者。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，受試者知情且簽署同意書。

1.1.2實驗材料 人T淋巴細胞白血病細胞Jurkat T購自武漢華連科生物技術(shù)有限公司。RPMI1640培養(yǎng)基、胰酶購自杭州仟諾生科技有限公司；雙熒光報告檢測系統(tǒng)購自美國Promega 公司；雙熒光報告檢測試劑盒購自北京白奧萊博科技有限公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；anti-CD3、anti-CD28、anti-CD4-FITC抗體、anti-CD25-PE抗體、anti-CD69-PE-Cy7抗體購自美國Biolegend公司；白細胞介素-2(IL-2)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自美國BD Bio-sciences公司；MTT檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；miR-33b mimic、miR-33b抑制劑(anti-miRNA)及其陰性對照購自上海吉瑪基因制藥技術(shù)有限公司；Myc siRNA及其陰性對照質(zhì)粒購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol試劑與SYBR Green qPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；M-MLV Reverse Transcription Kit試劑盒購自美國Invitrogen公司；兔抗人Myc多克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG購自中山金橋生物技術(shù)有限公司；Western blot所需試劑購自上海西寶生物科技股份有限公司；淋巴細胞分離液購自美國MP Biomedicals公司；紅細胞裂解液購自美國eBioscience公司。

1.2方法

1.2.1分離人外周血單個核細胞(PBMCs) 采用肝素鈉抗凝試管收集兩者受試者外周靜脈血5 ml，2 500 r/min離心8 min，收集上層血漿，加入等體積無菌PBS緩沖液，另取10 ml無菌離心管，加入等體積淋巴細胞分離液，緩慢加入外周血，離心機中2 500 r/min離心20 min，取出中間PBMCs層，加入4 ml PBS緩沖液，混勻，1 600 r/min離心6 min，棄上清并收集細胞，加入紅細胞裂解液(2 ml)，混勻，室溫靜置2 min，加入PBS緩沖液至8 ml，混勻后離心并收集細胞，采用RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度2×106ml-1，采用免疫磁珠分選法(MACS)分離CD4+T細胞，具體方法參照相關(guān)文獻[9]，收集CD4+T細胞置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含有10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Jurkat T細胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2 d更換培養(yǎng)液，待細胞融合至60%～70%時進行傳代培養(yǎng)。參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前一天將Jurkat T細胞接種至96孔細胞培養(yǎng)板，每孔分別接種2×105個細胞，同時分別將miRNA陰性對照、miR-33b mimic、anti-miRNA及miR-33b抑制劑溶解于OPYI-MEM培養(yǎng)基(50 μl)，混勻后加入2 μl Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，混勻后室溫孵育20 min，向96孔板中每孔加入100 μl上述miRNA配置混合液，分別為miR-con組、miR-33b組、anti-miR-con組 及anti-miR-33b組。采用小RNA干擾技術(shù)沉默Myc表達，分別將Myc siRNA及其陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Jurkat T細胞，轉(zhuǎn)染方法與miR-33b轉(zhuǎn)染方法相同，分別為si-con組、si-Myc組。轉(zhuǎn)染后置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6 h后更換為RPMI1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞進行檢測。

1.2.3qRT-PCR檢測miR-33b 、Myc mRNA表達 CD4+細胞與Jurkat T細胞均按照Trizol試劑說明書提取總RNA，利用核酸蛋白分析儀檢測RNA濃度及純度，以A260與A280比值在1.8～2.0之間為RNA濃度測定標準。引物序列：miR-33b正向引物為：5′-ATTCTTTCGAACTGTCTTGG-3′，反向引物為：5′-TTCACCCTCGGCTGTCCTTGACA-3′；Myc正向引物為：5′-AATGAAAAGGCCCCCAAGGTAGTTATCC-3′，反向引物為：5′-GTCGTTTCCGCAACAAGTCCTCTTC-3′。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR擴增反應(yīng)，擴增條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共30次循環(huán)，72℃終延伸10 min。qRT-PCR反應(yīng)均嚴格按照SYBR Green qPCR試劑盒說明書操作。miR-33b 、Myc 的溶解曲線見圖1。

圖1 miR-33b與Myc的溶解曲線Fig.1 Dissolution curve of miR-33b and Myc

1.2.4Western blot檢測Myc蛋白表達 取各組Jurkat T細胞及CD4+細胞，加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，經(jīng)電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉60 min，分別加入Myc(1∶200)、GAPDH(1∶1 000)一抗，4℃冰箱內(nèi)保存過夜，次日加入IgG(1∶5 000)，室溫孵育1 h，經(jīng)化學發(fā)光試劑顯影，Myc以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測表面活化標記物CD25和CD69的表達 收集各組對數(shù)生長期Jurkat T細胞，用anti-CD3/28刺激Jurkat T細胞24 h，用anti-CD4-FITC、anti-CD25-PE、anti-CD69-PE-Cy7抗體標記后，置于流式細胞儀檢測，采用FlowJo7.6軟件分析CD25和CD69平均熒光強度(MFI)。

1.2.6MTT檢測細胞增殖 取各組對數(shù)生長期Jurkat T細胞，0.25%胰酶消化，接種至96孔板，每孔細胞密度為5×103個，每孔體積為100 μl，每組設(shè)置4個復孔，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h、48 h、72 h后分別在每孔加入50 μl MTT試劑，然后加入150 μl DMSO，避光室溫下孵育10 min，利用酶標儀檢測各孔在490 nm波長處的OD值。

1.2.7檢測T細胞活化功能 分別將Jurkat T細胞鋪于96孔U底板(2×105個/孔)，用anti-CD3/28抗體刺激，24 h后收集細胞上清液，采用ELISA法檢測IL-2水平，嚴格按照檢測試劑盒說明書操作。

1.2.8雙熒光素酶活性檢測 收集呈指數(shù)式生長的Jurkat T細胞，胰蛋白酶消化，制備細胞懸液，以每孔1×105個細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞融合度達到60%左右時進行轉(zhuǎn)染，分別將WT-Myc、MUT-Myc與miR-con共轉(zhuǎn)染至Jurkat T細胞，分別將WT-Myc、MUT-Myc與miR-33b mimic共轉(zhuǎn)染至Jurkat T細胞，轉(zhuǎn)染48 h后棄培養(yǎng)基，然后在每孔加入300 μl 1×Passive Lysis Buffer，放入4℃冰箱內(nèi)，20 min后取出并混勻，吸取40 μl細胞裂解液置于Lockwell maxisorp檢測板，再加入Luciferase Assay Reagent(20 μl)，混勻后檢測螢火蟲熒光素酶熒光值，之后加入Stop & Glo Reagent(20 μl/孔)，混勻后室溫放置3 min，檢測海腎熒光酶熒光值。

2 結(jié)果

2.1擴張型心肌病患者CD4+細胞中miR-33b和Myc的表達 通過qRT-PCR法檢測DCM患者CD4+細胞中miR-33b及Myc mRNA表達水平，結(jié)果顯示DCM組患者CD4+細胞中miR-33b表達水平相較于正常組顯著降低(t=10.528，P<0.000 1)，Myc mRNA表達水平顯著升高(t=11.238，P<0.000 1)，見圖2A、B。Western blot檢測結(jié)果顯示DCM組患者CD4+細胞中Myc蛋白表達水平顯著高于正常組(t=8.718，P<0.000 1)，見圖2C。采用Pearson法分析DCM患者CD4+細胞中miR-33b與Myc蛋白表達水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示miR-33b與Myc呈負相關(guān)(F=14.091，P<0.05)，見圖2D。

圖2 DCM患者CD4+細胞中miR-33b和Myc的表達Fig.2 Expression of miR-33b and Myc in CD4+ cells from DCM patientsNote:A.Down-regulation of miR-33b expression in circulating CD4+ cells in DCM patients compared with normal group；B.Upregulation of Myc mRNA expression in circulating CD4+ cells in DCM patients compared with normal group；C.Upregulation of Myc protein expression in circulating CD4+ cells in DCM patients compared with normal group；D.Negative correlation between Myc protein expression in circulating CD4+ cells in DCM patients.Compared with Normal group,*.P<0.05.

2.2miR-33b對Jurkat T細胞活化的影響 分別將miR-33b mimic、miR-33b抑制劑(anti-miRNA)轉(zhuǎn)染至Jurkat T細胞，轉(zhuǎn)染48 h后采用qRT-PCR法檢測Jurkat T細胞中miR-33b表達，結(jié)果顯示miR-33b組Jurkat T細胞中miR-33b表達水平顯著高于miR-con組，anti-miR-33b組Jurkat T細胞中miR-33b表達水平顯著低于anti-miR-con組(F=219.514，P<0.000 1)，見圖3A。提示轉(zhuǎn)染效果良好可用于后續(xù)研究。用anti-CD3/28刺激Jurkat T細胞24 h，流式檢測表面活化標記物CD25和CD69的表達，結(jié)果顯示miR-33b組Jurkat T細胞中CD25、CD69 MFI值及IL-2水平均顯著低于miR-con組，anti-miR-33b組Jurkat T細胞中CD25、CD69 MFI值及IL-2水平均顯著高于anti-miR-con組(FCD25=32.532，F(xiàn)CD69=75.971，F(xiàn)IL-2=38.084，P<0.000 1)，見圖3B～D。結(jié)果表明miR-33b過表達可抑制Jurkat T細胞活化，抑制miR-33b表達可促進Jurkat T細胞活化。

圖3 miR-33b調(diào)控Jurkat T細胞活化Fig.3 miR-33b regulates Jurkat T cell activationNote:A.Detection of miR-33b expression in Jurkat T cells 48 h after transfection；B，C.After 48 h transfection,Jurkat T cells were stimulated with anti-CD3/28 for 24 h,and the expression of surface activation markers CD25 and CD69 were detected by flow cytometry；D.ELISA for detection of IL-2 concentration in cell supernatant.Compared with miR-con group,*.P<0.05;compared with anti-miR-con group,#.P<0.05.

2.3miR-33b對Jurkat T細胞增殖的影響 MTT檢測Jurkat T細胞增殖能力，結(jié)果顯示miR-33b 組Jurkat T細胞增殖活性顯著低于miR-con組，anti-miR-33b組Jurkat T細胞增殖活性顯著高于anti-miR-con組(F=23.044，P<0.000 1)，見圖4。結(jié)果表明miR-33b過表達可抑制Jurkat T細胞增殖，抑制miR-33b表達可促進Jurkat T細胞增殖。

圖4 miR-33b調(diào)控Jurkat T細胞增殖Fig.4 miR-33b regulates Jurkat T cell proliferationNote:Compared with miR-con group,*.P<0.05;compared with anti-miR-con group,#.P<0.05.

2.4miR-33b靶向Myc調(diào)控其表達 靶基因預測軟件預測出miR-33b與Myc 3′UTR存在結(jié)合位點，見圖5A。分別將WT-Myc、MUT-Myc與miR-33b mimic共轉(zhuǎn)染至Jurkat T細胞，分別將WT-Myc、MUT-Myc與miR-con組共轉(zhuǎn)染至Jurkat T細胞，檢測Jurkat T細胞熒光活性，結(jié)果顯示野生型WT-Myc與miR-33b mimic共轉(zhuǎn)染Jurkat T細胞熒光活性比WT-Myc與miR-con共轉(zhuǎn)染Jurkat T細胞熒光活性顯著降低(t=6.507，P=0.03)，突變型MUT-Myc與miR-con共轉(zhuǎn)染相較于MUT-Myc與miR-33b mimic共轉(zhuǎn)染Jurkat T細胞熒光活性差異無統(tǒng)計學意義(t=1.905，P=0.130)，見圖5B。Western blot法驗證miR-33b對Myc蛋白表達的調(diào)控作用，結(jié)果顯示miR-33b組Jurkat T細胞中Myc蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，anti-miR-33b組Jurkat T細胞中Myc蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖5C。結(jié)果表明miR-33b可負向調(diào)控靶基因Myc表達。

圖5 miR-33b靶向Myc mRNA調(diào)控其蛋白表達Fig.5 miR-33b targets Myc mRNA to regulate its protein expressionNote:Compared with miR-con group,*.P<0.05;compared with anti-miR-con group,#.P<0.05.

2.5沉默Myc抑制Jurkat T細胞活化和增殖 將Myc siRNA及其陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Jurkat T細胞，轉(zhuǎn)染48 h后采用Western blot驗證轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示si-Myc組Jurkat T細胞中Myc蛋白表達水平顯著低于si-con組(F=43.279，P<0.000 1)，見圖6A，提示轉(zhuǎn)染成功。進一步分析沉默Myc表達對Jurkat T細胞活化和增殖的影響，結(jié)果顯示si-Myc組Jurkat T細胞CD25、CD69 MFI值及IL-2水平均顯著低于si-con組(FCD25=67.278，F(xiàn)CD69=30.855，F(xiàn)IL-2=208.496，P<0.05)，Jurkat T細胞活性明顯降低(F=13.838，P=0.006)，見圖6B～E。結(jié)果表明沉默Myc 表達可抑制Jurkat T細胞活化并降低細胞增殖能力。

圖6 Myc表達對Jurkat T細胞活化和增殖的影響Fig.6 Effect of Myc expression on activation and proliferation of Jurkat T cellsNote:A.Detection of Myc expression in Jurkat T cells after 48 hours of transfection；B，C.Expression of surface activation markers CD25 and CD69；D.ELISA for detection of IL-2 concentration in cell supernatant；E.Detection of Jurkat T cell proliferation.Compared with si-con group,*.P<0.05.

3 討論

CD4+T細胞介導免疫炎癥反應(yīng)可促進DCM發(fā)生及發(fā)展，DCM患者外周血CD4+T細胞異?；罨蓳p傷機體免疫功能[10]。miRNA與T細胞激活及分化密切相關(guān)，T細胞激活可通過增加細胞代謝進而調(diào)節(jié)免疫功能，同時還可調(diào)控miRNA表達并間接調(diào)控靶基因表達進而促進T細胞增殖，miRNA異常表達還可通過調(diào)控靶基因表達進而促進T細胞增殖[11-13]。miR-33b在食管鱗狀細胞癌中呈低表達并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程，研究表明miR-33可通過調(diào)控ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白表達進而調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)[14，15]。關(guān)于miR-33b在DCM發(fā)生過程中的作用尚未有相關(guān)研究報道，本研究結(jié)果顯示DCM患者CD4+T細胞中miR-33b表達水平低于正常組，說明miR-33b可能參與DCM發(fā)生過程。提示miR-33b表達水平異?？赡芡ㄟ^引起機體免疫系統(tǒng)紊亂進而導致DCM發(fā)生。通過靶向預測軟件得出Myc與miR-33b基因序列存在結(jié)合位點，研究顯示抑制Myc表達可抑制T細胞活化及增殖，同時Myc表達水平升高還與白血病病毒感染有關(guān)[16，17]。本研究結(jié)果顯示DCM患者CD4+T細胞中Myc mRNA及蛋白表達水平顯著高于正常組，miR-33b與Myc呈負相關(guān)，提示miR-33b與Myc異常表達可促進DCM發(fā)生及發(fā)展。但Myc與miR-33b是否存在直接靶向關(guān)系及其對DCM患者T細胞活化及增殖的調(diào)控作用如何均需進行深入研究。

CD69可作為T淋巴細胞表面活化的早期標志，抗原刺激T淋巴細胞時CD69表達上調(diào)[18]。CD4+T細胞早期免疫活化標志物CD25、CD69表達增加可能是DCM患者免疫激活的重要因素[19]。研究發(fā)現(xiàn)IL-2是Myc轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮調(diào)控作用中的重要因子，IL-2可誘導CD4+T細胞合成相關(guān)miRNA，miRNA又可通過靶向抑制Foxol因子表達進而促進CD4+T細胞增殖[20，21]。提示IL-2在CD4+T細胞活化及增殖過程中發(fā)揮重要作用。本研究選用T淋巴細胞系Jurkat T細胞為實驗細胞，通過體外實驗探討miR-33b、Myc與T淋巴細胞活化及增殖的關(guān)系。本實驗將miR-33b過表達及抑制表達后，結(jié)果顯示miR-33b過表達后Jurkat T細胞中CD25、CD69 MFI值、IL-2水平及細胞增殖能力均顯著降低，抑制miR-33b表達后Jurkat T細胞中CD25、CD69 MFI值、IL-2水平及細胞增殖能力均顯著升高，說明miR-33b表達水平升高可有效抑制Jurkat T細胞活化及增殖。提示Jurkat T細胞中miR-33b表達水平降低可促進免疫活化及增殖。同時本研究熒光素酶檢測結(jié)果顯示Myc是miR-33b的靶基因，miR-33b可負向調(diào)控靶基因Myc表達。提示miR-33b、Myc表達異?？赡芘cDCM過度免疫激活有關(guān)。通過沉默Myc表達進一步驗證其對T細胞活化的調(diào)控作用，結(jié)果顯示si-Myc組Jurkat T細胞CD25、CD69 MFI值及IL-2水平均顯著低于si-con組，Jurkat T細胞活性明顯降低，說明降低Myc表達可有效抑制T細胞活化。提示miR-33b可能通過負向調(diào)控Myc表達并減少IL-2分泌量進而抑制T細胞增殖及活化。

綜上所述，DCM患者CD4+T細胞中miR-33b表達下調(diào)并可促進Myc表達進而促使T細胞異?；罨?，這可能是DCM發(fā)病機制之一，為提高DCM治療效果提供潛在靶標基因。但CD4+T細胞活化及增殖過程較為復雜，涉及轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子、多種miRNA等調(diào)控過程，因而需進一步探究miR-33b與Myc對T細胞活化及增殖的調(diào)控機制。