CD103和E-鈣黏蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)及作用研究①

粟 虹 韓云雪 佐 妍

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院綜合科，桂林 541001)

結(jié)直腸癌是全球第四大常見癌癥，其整體5年生存率約為50%[1]。除了腫瘤的病理分期，組織學(xué)亞型和外科手術(shù)程度外，手術(shù)切除的腫瘤組織中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes,TIL)的存在也與良好的預(yù)后顯著相關(guān)[2]。比如CD8+TIL在幾種惡性腫瘤中的積累已被證明與患者良好的預(yù)后相關(guān)[3,4]。新近報(bào)道表明，ITGAE(integrin，alpha E)也稱為CD103，在抗癌免疫中起著至關(guān)重要的作用。例如，ITGAE可以通過肺癌和宮頸癌中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞識別異常細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞[5-7]。上皮組織中的鈣黏蛋白稱為E-鈣黏蛋白，是一種Ca2+依賴的細(xì)胞黏著糖蛋白，在維持細(xì)胞形態(tài)和黏附中發(fā)揮重要作用。E-鈣黏蛋白功能異常將導(dǎo)致多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。本研究檢測了45例結(jié)腸癌組織中CD103和E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平，并在體外實(shí)驗(yàn)探究CD103和E-鈣黏蛋白表達(dá)變化對腫瘤活性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 選取2018～2019年于我院進(jìn)行結(jié)腸癌手術(shù)的45例標(biāo)本，均未進(jìn)行化療和放療。38例正常結(jié)腸組織標(biāo)本中有18例為癌旁組織，并經(jīng)病理證明為正常組織，20例取自良性疾病結(jié)腸部分切除標(biāo)本。結(jié)腸癌45例樣本中男性27例，女性18例。年齡 48～72歲，平均年齡(61.5±6.5)歲。腫瘤分化程度：高中分化21例，低分化24例，伴淋巴轉(zhuǎn)移19例，無淋巴轉(zhuǎn)移26例。TNM分期：Ⅰ-Ⅱ期23例，Ⅲ-Ⅳ期22例。兔抗CD103抗體(Sigma)，鼠抗E-cadherin抗體和鼠抗GAPDH抗體(Proteintech)。

1.2方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR，qRT-PCR) Trizol法提取結(jié)腸癌組織中總RNA。使用紫外分光光度計(jì)測RNA濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR檢測結(jié)腸癌組織中CD103和E-鈣黏蛋白的表達(dá)。所用引物：以 GAPDH 為內(nèi)參， 上游引物:5′-CTCATGACCACAGTCCATGC-3′，下游引物:5′-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3′；E-鈣黏蛋白引物:上游引物： 5′-TCATGAGTGTCCCCCGGTAT-3′，下游引物：5′-TCTTGAAGCGATTGCCCCAT-3′；CD103引物：上游引物：5′-CAAGAGGTCATCTGCTCATGT-3′，下游引物：5′-GGACAGAACTGCAACGAAGC-3′。

1.2.2腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的分離 根據(jù)文獻(xiàn)[9,10]中介紹的方法，分離結(jié)腸癌組織中浸潤淋巴細(xì)胞。無菌操作取得結(jié)腸癌組織。PBS清洗結(jié)腸癌組織，置于培養(yǎng)皿中，加入8倍體積胰酶消化3 h。剪碎結(jié)腸癌組織，并于37℃水浴中孵育1 h，充分消化結(jié)腸癌組織，吹打混勻，過濾，收集單細(xì)胞懸液于50 ml離心管中，冰上放置10 min。50 g離心2 min。取上清于另一離心管中，400 g離心5 min。棄上清，加入3 ml胰酶重懸沉淀。加入密度梯度離心液，500 g離心20 min，加速9減速4。收集云霧層細(xì)胞，加入3 ml胰酶消化液重懸。再加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，處理5 min，加入2 ml PBS終止孵育，400 g離心5 min，棄上清，得到腫瘤浸潤細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，用含10%血清的DMEM重懸細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 TIL在實(shí)驗(yàn)前轉(zhuǎn)染CD103過表達(dá)質(zhì)粒(CD103 ACT)(Santacruz),轉(zhuǎn)染了CD103 ACT質(zhì)粒的TIL細(xì)胞記為TIL CD103+，SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染E-鈣黏蛋白敲低質(zhì)粒(siCDH1)(Invitrogen)記為SW480 siCDH1。

1.2.4體外殺瘤活性測定 將培養(yǎng)的腫瘤浸潤細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，SW480作為靶細(xì)胞，采用效靶比20∶1在96孔板中混合培養(yǎng)，CCK8檢測SW480細(xì)胞存活比率，評價(jià)腫瘤浸潤細(xì)胞殺傷癌細(xì)胞能力。實(shí)驗(yàn)分組：①CD103對TIL腫瘤殺傷活性的影響：SW480與普通TIL共培養(yǎng)(SW480+TIL)，SW480與過表達(dá)CD103后的TIL共培養(yǎng)(SW480+TIL CD103+)；②E-鈣黏蛋白對CD103+TIL腫瘤殺傷活性的影響：SW480與普通TIL共培養(yǎng)(SW480+TIL)，SW480與過表達(dá)CD103后的TIL共培養(yǎng)(SW480+TIL CD103+)，SW480細(xì)胞敲低E-鈣連蛋白后與普通TIL共培養(yǎng)(SW480 siCDH1+TIL)，SW480細(xì)胞敲低E-鈣黏蛋白后與過表達(dá)CD103后的TILTIL共培養(yǎng)(SW480 siCDH1+TIL CD103+)。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/空白對照組吸光度值×100%。

1.2.5Transwell體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell小室PVDF膜上預(yù)先鋪上基質(zhì)膠，37℃平衡2 h。PBS清洗1遍，放入24孔板內(nèi)，每孔預(yù)先加入600 μl培養(yǎng)基，在Transwell 內(nèi)室加入400 μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～18 h。用棉簽擦去靠近內(nèi)室一側(cè)的細(xì)胞，另一面用甲醛室溫固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3遍，顯微鏡下觀察細(xì)胞，計(jì)數(shù)。每組設(shè)3復(fù)孔。

1.2.6Western blot 收集組織樣本，冰上使用RIPA裂解液裂解組織。BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入上樣緩沖液稀釋并在100℃水浴5 min。采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗(1∶1 000),4℃孵育過夜。用TBST洗3次，每次15 min，室溫孵育二抗(1∶2 000)2 h，TBST洗滌后用化學(xué)發(fā)光顯色法顯影，拍照統(tǒng)計(jì)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行分析。各組數(shù)據(jù)的比較依據(jù)資料的性質(zhì)，采用t檢驗(yàn)或方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸組織中CD103和E-鈣黏蛋白表達(dá)情況 結(jié)腸癌組織中CD103與E-鈣黏蛋白的表達(dá)情況采用RT-PCR和Western blot檢測，結(jié)果如圖1、2所示，與正常組織相比E-鈣黏蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)降低(P<0.001)，CD103 表達(dá)增加(P<0.001)。

圖1 結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸組織中CD103和E-鈣黏蛋白表達(dá)情況Fig.1 Expressions of CD103 and E-cadherin in colon cancer tissues and normal colon tissuesNote:Compared with normal tissues,***.P<0.001.

2.2CD103、E-鈣黏蛋白與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果圖3所示，E-鈣黏蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及分化程度有關(guān)，與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者相比，淋巴轉(zhuǎn)移患者中E-鈣黏蛋白表達(dá)更低；臨床分期Ⅲ-Ⅳ期以及低分化患者中E-鈣黏蛋白表達(dá)更低(P<0.001)。CD103 表達(dá)與結(jié)腸癌的臨床分期及分化程度有關(guān)，在Ⅲ-Ⅳ期以及低分化患者中CD103表達(dá)更低(P<0.001)；與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者相比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中CD103表達(dá)降低，但沒有統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。

圖3 CD103、E-鈣黏蛋白與結(jié)腸癌臨床病理特征關(guān)系Fig.3 Correlation of CD103,E-cadherin and clinicopa-thological features of colon cancerNote:Compared with no lymphatic metastasis,ns.P>0.05,***.P<0.001;compared with Ⅰ-Ⅱ stage,*.P<0.05,***.P<0.001;Compared with G1-G2 stage,**.P<0.01,***.P<0.001.

2.3E-鈣黏蛋白對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響 在結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中敲低E-鈣黏蛋白的表達(dá)進(jìn)行Transwell 體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，E-鈣黏蛋白敲低的SW480細(xì)胞(SW480 siCDH1)穿過Transwell 的數(shù)目(177±18)明顯高于對照組(SW480)穿過的數(shù)目(107±21)。

圖2 Western blot檢測結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸組織中CD103和E-鈣黏蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of CD103 and E-cadherin in colon cancer tissues and normal colon tissues were determined by Western blot

2.4CD103對TIL腫瘤殺傷活性的影響 結(jié)腸癌組織中分離出的TIL過表達(dá)CD103后，與普通TIL相比，對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的殺傷活性顯著提高，SW480細(xì)胞存活減少(P<0.001)。結(jié)果見圖4。

圖4 CD103對TIL腫瘤殺傷活性的影響Fig.4 Effect of CD103 on TIL tumor killing activityNote:Compared with TIL，***.P<0.001.

2.5CD103+TIL依賴E-鈣黏蛋白發(fā)揮對結(jié)腸癌細(xì)胞殺傷作用 結(jié)果如圖5，敲低SW480細(xì)胞中E-鈣黏蛋白的表達(dá)后，TIL以及CD103+TIL對SW480殺傷活性降低，SW480細(xì)胞存活增加(P<0.001)；并且TIL和CD103+TIL對E-鈣黏蛋白敲低的SW480細(xì)胞(SW480siCDH1)的殺傷活性沒有顯著差異。

圖5 CD103+TIL依賴E-鈣黏蛋白發(fā)揮對結(jié)腸癌細(xì)胞殺傷作用Fig.5 CD103+TIL relies on E-cadherin to kill colon cancer cellsNote:Compared with SW480+TIL,**.P<0.01,***.P<0.001;compared with SW480+TILCD103+,###.P<0.001.

3 討論

CD103是一種介導(dǎo)上皮組織中淋巴細(xì)胞保留的整合素，并被認(rèn)為是腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的表面分子標(biāo)志物[11]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)通過與效應(yīng)T細(xì)胞相互調(diào)節(jié)而維持免疫穩(wěn)態(tài)[12]。然而，Treg細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中被重新編程，抑制抗惡性腫瘤的免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)癌癥發(fā)展[13]。研究人員發(fā)現(xiàn)CD103+TIL比CD103negTIL更強(qiáng)烈地抑制Treg細(xì)胞的活化，因此，CD103被認(rèn)為是選擇性消除腫瘤浸潤性Treg的有趣目標(biāo)，這種策略可能有助于抗癌療法的改善[11]。本研究結(jié)果顯示，與正常組織相比，CD103在結(jié)腸癌組織中表達(dá)升高，并且與腫瘤的惡性程度有關(guān)，在Ⅲ-Ⅳ期以及低分化患者中CD103表達(dá)更低(P<0.001)，表明隨著病情惡化，CD103+TIL對腫瘤免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)能力減弱，這可能是腫瘤惡化的一個(gè)原因。另一方面，雖然CD103在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中表達(dá)降低與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者相比沒有顯著差異，但的確存在降低的趨勢，這可能與樣本例數(shù)較少有關(guān)。最近的研究表明，CD103+淋巴細(xì)胞是結(jié)直腸癌微環(huán)境的重要組成部分，并與患者生存率呈正相關(guān)[14]。此與本研究所得結(jié)論一致。

E-鈣黏蛋白是由CDH1基因編碼的一種強(qiáng)有力的黏附分子，負(fù)責(zé)與鄰近細(xì)胞的黏附[15]?，F(xiàn)在普遍接受的是，在大多數(shù)癌癥的腫瘤進(jìn)展期間觀察到E-鈣黏蛋白表達(dá)的改變，這通常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲性增加和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[8,16]。本研究結(jié)果顯示，E-鈣黏蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)降低(P<0.001)，并且E-鈣黏蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期以及分化程度有關(guān)，與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者相比，淋巴轉(zhuǎn)移患者中E-鈣黏蛋白表達(dá)更低；臨床分期Ⅲ-Ⅳ期以及低分化患者中E-鈣黏蛋白表達(dá)更低(P<0.001)。表明隨著結(jié)腸癌的惡性程度進(jìn)展加劇，E-鈣黏蛋白表達(dá)降低。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)這一結(jié)論，敲低SW480細(xì)胞中E-鈣黏蛋白表達(dá)增加了SW480細(xì)胞的侵襲能力，表明E-鈣黏蛋白降低會(huì)促進(jìn)結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。

研究表明目前CD103的唯一已知配體是E-鈣粘蛋白[17,18]。研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤中E-鈣黏蛋白的缺失抑制CD103抗腫瘤活性[19]。然而，尚未研究E-鈣黏蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)對CD103+TIL抗腫瘤活性的影響。本研究結(jié)果顯示，從結(jié)腸癌組織中分離的TIL在過表達(dá)CD103后對SW480細(xì)胞的殺傷活性顯著增強(qiáng)，而這種殺傷效應(yīng)在E-鈣黏蛋白敲低后消失。這表明E-鈣黏蛋白的缺失抑制CD103+TIL抗腫瘤活性，主要是由于E-鈣黏蛋白表達(dá)降低，與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞上的CD103結(jié)合減少，導(dǎo)致TIL與癌細(xì)胞接觸減少，因此TIL的殺傷活性降低。即使此時(shí)增加CD103的表達(dá)，但是由于缺乏配體，也難以增加TIL的殺傷活性。CD103+TIL細(xì)胞需要與腫瘤細(xì)胞接觸并黏附于腫瘤細(xì)胞上從而發(fā)揮細(xì)胞毒性功能。

綜上所述，本研究結(jié)果表明CD103和E-鈣黏蛋白在結(jié)腸癌的發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。TIL細(xì)胞通過CD103對表達(dá)E-鈣黏蛋白的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫監(jiān)視，未來的治療策略可能是尋求擴(kuò)增CD103免疫細(xì)胞亞群，以靶向表達(dá)E-鈣黏蛋白的腫瘤細(xì)胞。