緩沖體系pH值對黑豆皮花青素含量及抗氧化活性測定影響的研究

張春雨，謝巖黎*，楊玉輝

1.河南工業(yè)大學(xué) 谷物資源轉(zhuǎn)化與利用省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001 2.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

隨著人們對營養(yǎng)健康食品的需求逐漸增大，含有花青素等天然抗氧化劑的食品受到消費(fèi)者的青睞。食品工業(yè)中富含花青素的加工食品體系有較寬的pH值范圍，例如：山楂酒的pH值在2.3～2.5之間[1]，葡萄酒[2-3]、果汁[4-6]等產(chǎn)品的pH值在2.9～3.7之間，豆?jié){、面條等食品的pH值則可以達(dá)到6.4～7.3[7-8]。在加工過程中，為了使最終的產(chǎn)品具有一定的風(fēng)味和較長的貨架期，還引入了非常多的熱處理，如工業(yè)烹飪、熱燙、熱擠壓和熱殺菌等[9]。目前作者所在實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)針對黑豆的綜合利用開展了其在面制品方面的研究[10-11]，為了拓展黑豆皮花青素在食品及保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用，有必要研究花青素在較寬pH值范圍和不同溫度熱處理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性和抗氧化活性，降低工業(yè)化處理導(dǎo)致的損失，達(dá)到最大程度保留花青素的目的。

pH示差法是實(shí)驗(yàn)室常用的測定花青素含量的方法，該方法以強(qiáng)酸環(huán)境下花青素黃烊鹽陽離子在520 nm附近的吸光度為依據(jù)對花青素進(jìn)行定量[12-13]。天然產(chǎn)物的抗氧化活性測定有多種方法，其中ABTS和DPPH自由基清除能力是實(shí)驗(yàn)室常用的測定方法，兩種物質(zhì)的自由基都位于結(jié)構(gòu)中的N原子上[14]。由于不同方法之間抗氧化機(jī)理存在差異，且相同的方法也因試驗(yàn)材料、試驗(yàn)對象等的不同而具有細(xì)節(jié)上的差異，導(dǎo)致數(shù)據(jù)之間的橫向?qū)Ρ却嬖诶щy。鑒于此，作者探討了pH示差法在測定花青素液體時(shí)的局限性以及自由基種類對黑豆皮花青素抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside，C3G)：純度98%，從黑龍江雙鴨山市出產(chǎn)的黑豆中分離提純，采用文獻(xiàn)[15]的方法制備；2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，98%)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，98%)：酷爾化學(xué)科技(北京)有限公司；試驗(yàn)中所用其他試劑均為分析純，所用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋:金壇市華峰儀器有限公司；UV-6100S型紫外可見分光光度計(jì):上海美譜達(dá)儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì):上海雷磁儀器廠；DL-5-B型低速大容量離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花青素樣品的制備

使用0.2 mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉的緩沖液體系，分別取1 mg花青素固體溶于25 mL的pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0緩沖液，得到7個(gè)pH值的花青素溶液；取花青素溶液5 mL于25 mL玻璃試管中，分別在65、85、100 ℃下水浴加熱處理30 min后立即置于冷水中降至室溫，得到熱處理樣品。

1.3.2 pH示差法測定花青素含量

參考文獻(xiàn)[16]的方法，分別用0.2 mol/L的鹽酸-氯化鉀緩沖液和0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液配制pH 1.0、4.5的緩沖液，取上述花青素溶液樣品0.4 mL與3.2 mL緩沖液混合，平衡10 min后測定樣品在510、700 nm處吸光度A510、A700，每個(gè)樣品處理做3組平行試驗(yàn)。

花青素含量按照下式[17]計(jì)算：

A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5，

式中：C為花青素含量，mg/L；A為吸光度；ε為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的吸光系數(shù)，26 900 L·mol-1·cm-1；F為稀釋因子；M為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，449.2 g/mol；d為光程，1 cm。

1.3.3 花青素抗氧化活性測定

1.3.3.1 ABTS清除率的測定

參考Van Den Berg等[18]的方法，并作適當(dāng)調(diào)整。

分別配制7 mmol/L ABTS水溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀水溶液作為儲(chǔ)備液，等體積混合兩種儲(chǔ)備液后在室溫下避光放置12～16 h，形成工作母液，使用無水乙醇將工作母液稀釋23倍后作為ABTS工作液。

分別量取2.85 mL ABTS溶液、0.15 mL花青素溶液，2.85 mL ABTS溶液、對應(yīng)pH值的空白緩沖液，2.85 mL無水乙醇、0.15 mL花青素溶液于10 mL離心管中，振蕩混勻后避光反應(yīng)10 min。未離心樣品組直接在734 nm處測定得到吸光度A1、A0和A2；離心樣品組經(jīng)3 000g離心5 min后在相同波長下測定吸光度A1、A0和A2。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率的測定

參考Brand-William等[19]的方法并作適當(dāng)修改。

取DPPH固體溶于無水乙醇得到80 μmol/L的DPPH工作溶液，然后分別量取2.85 mL DPPH溶液、0.15 mL花青素溶液，2.85 mL DPPH溶液、對應(yīng)pH值的空白緩沖液，2.85 mL無水乙醇、0.15 mL花青素溶液于10 mL離心管中，振蕩混勻后避光反應(yīng)30 min。未離心樣品組直接在515 nm處測定得到吸光度A1、A0和A2；離心樣品組經(jīng)3 000g離心5 min后在相同波長下測定吸光度A1、A0和A2。

上述兩種自由基清除率按照下式計(jì)算：

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總整理，用Origin 8.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，使用SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析(ANOVA)及配對樣品T檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 緩沖體系pH值對花青素含量測定的影響

在強(qiáng)酸環(huán)境下花青素黃烊鹽陽離子呈現(xiàn)出鮮艷的紅色，pH示差法主要是通過測定其在520 nm附近的吸光度判定溶液中花青素含量。當(dāng)被測體系不在強(qiáng)酸環(huán)境中，花青素在水溶液中主要存在黃烊鹽陽離子、甲醇假堿、查爾酮以及醌式堿4種結(jié)構(gòu)，4種結(jié)構(gòu)之間存在化學(xué)平衡[20-21]。因此，當(dāng)花青素受到熱加工等外界因素影響導(dǎo)致其無法以陽離子結(jié)構(gòu)存在，以pH示差法測定的花青素含量會(huì)降低。

試驗(yàn)pH值范圍內(nèi)不同溫度熱處理后的花青素含量如表1所示?？筛鶕?jù)花青素含量的變化規(guī)律將pH值劃分成3個(gè)范圍：pH 2.0～4.0，花青素在各種加熱條件下保持相對穩(wěn)定，變化率??；pH 5.0、6.0，花青素含量在特定加熱環(huán)境下出現(xiàn)升高的趨勢；pH 7.0、8.0，花青素含量隨著溫度升高而迅速降低。試驗(yàn)結(jié)果主要是由花青素結(jié)構(gòu)隨pH環(huán)境變化而變化導(dǎo)致的：花青素在pH<4.0時(shí)主要以黃烊鹽陽離子結(jié)構(gòu)存在[22]，該結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較好；在pH 5.0～6.0之間是黃烊鹽陽離子、查爾酮、甲醇假堿及醌式堿4種結(jié)構(gòu)共存的狀態(tài)，加熱雖然會(huì)導(dǎo)致一部分花青素降解成小分子或轉(zhuǎn)變成查爾酮，但由于其他結(jié)構(gòu)之間存在相互轉(zhuǎn)化，整體表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性；花青素在pH≥7.0的環(huán)境則以查爾酮和醌式堿結(jié)構(gòu)為主，這兩種結(jié)構(gòu)都是由黃烊鹽陽離子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化來的，二者之間不存在直接轉(zhuǎn)化途徑[20, 23]，因而溶液中殘留的花青素在此pH值環(huán)境下無法逆回到黃烊鹽陽離子結(jié)構(gòu)顯色，導(dǎo)致以pH示差法檢測的花青素含量下降。

表1 pH值對熱處理后花青素含量的影響Table 1 Effect of pH on anthocyanin content after heat treatment mg/L

2.2 緩沖液pH值及自由基種類對花青素抗氧化活性的影響

2.2.1 ABTS清除率

在測定花青素清除自由基能力時(shí)，離心處理對不同pH值環(huán)境熱處理后花青素ABTS清除率的影響如圖1所示。在未經(jīng)離心處理的樣品組中，pH 2.0～8.0范圍內(nèi)花青素對ABTS的清除率呈現(xiàn)倒“U”形的趨勢，圖1a、圖1b和圖1c中的花青素在pH 2.0時(shí)的清除率最低，pH 3.0～6.0之間的清除率較高且互相之間沒有顯著差異(P>0.05)，而pH值達(dá)到7.0和8.0時(shí)清除率降低且兩種環(huán)境無顯著差異(P>0.05)。圖1d仍具有倒“U”形的趨勢，但是兩種處理的樣品組清除率分別在pH 4.0、5.0時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。經(jīng)離心處理的樣品組中花青素對ABTS的清除率卻呈現(xiàn)類似“～”的波動(dòng)趨勢，清除率在pH 4.0、5.0、8.0達(dá)到較高，pH 2.0環(huán)境的清除率最低。

注：不同的大寫字母表示離心處理樣品組不同pH環(huán)境之間具有差異性，不同的小寫字母表示未離心處理樣品組不同pH環(huán)境之間具有差異性，P<0.05。圖2同。圖1 緩沖液pH值對熱處理前后花青素ABTS清除率的影響Fig.1 Effect of buffer pH on ABTS free radical scavenging rate of anthocyanin before and after heat treatment

2.2.2 DPPH清除率

離心處理對不同pH值環(huán)境經(jīng)熱處理后花青素DPPH清除率的影響如圖2所示。在未經(jīng)離心處理的樣品組中，pH 2.0～8.0范圍內(nèi)花青素對DPPH的清除率呈現(xiàn)和圖1類似的倒“U”形趨勢，pH 2.0環(huán)境下的花青素對DPPH清除率也同樣是最低的。經(jīng)離心處理的樣品組對DPPH的清除率在25 ℃和65 ℃時(shí)呈現(xiàn)“M”形趨勢，而在85 ℃和100 ℃處理后則呈現(xiàn)倒“U”形趨勢，其清除率的最低點(diǎn)為pH 8.0環(huán)境。

對比上述兩種自由基試驗(yàn)結(jié)果可以看到，花青素所處的pH值環(huán)境對花青素的自由基清除率有顯著影響(P<0.05)，但是熱加工對相同pH值環(huán)境下的自由基清除率卻只在個(gè)別條件下影響顯著(以離心組數(shù)據(jù)為基準(zhǔn))。這可能是因?yàn)閜H值對花青素結(jié)構(gòu)有較大影響，而花青素各個(gè)結(jié)構(gòu)之間可以通過化學(xué)反應(yīng)維持相對平衡，雖然熱加工會(huì)導(dǎo)致一部分花青素發(fā)生降解，花青素依然可以通過一定的結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)平衡以及降解產(chǎn)物來發(fā)揮抗氧化活性[24-27]。另外，兩種自由基試驗(yàn)表明，花青素的未離心組和離心組在pH 2.0時(shí)清除率基本一致，在pH 3.0～8.0環(huán)境下離心組花青素對DPPH的清除率遠(yuǎn)低于未離心組，但pH 8.0環(huán)境下離心組花青素對ABTS清除率出現(xiàn)明顯上升且接近未離心組。同樣采用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖體系且以乙醇作為自由基溶劑的文獻(xiàn)[26, 28-29]并沒有提到離心處理。除了pH 2.0的樣品，其他pH值的花青素樣品加入自由基溶液后會(huì)出現(xiàn)明顯的白色渾濁，這是緩沖液中含有的不溶于乙醇的磷酸氫二鈉析出導(dǎo)致的，如果未經(jīng)離心處理直接測定會(huì)因?yàn)殁c鹽晶體對光路的遮擋作用導(dǎo)致吸光度增大，從而使得測定的花青素抗氧化活性增大。ABTS自由基溶液的吸光度在加入pH 8.0的緩沖液后顯著下降，比其他緩沖液的吸光度低約14%(從1.512下降到1.300)，這可能是導(dǎo)致pH 8.0環(huán)境的離心組樣品ABTS清除率異常升高的原因。

圖2 緩沖液pH值對熱處理前后花青素DPPH清除率的影響Fig.2 Effect of buffer pH on DPPH free radical scavenging rate of anthocyanin before and after heat treatment

3 結(jié)論

由于花青素在pH 2.0～8.0緩沖體系中存在黃烊鹽陽離子、甲醇假堿、查爾酮以及醌式堿4種結(jié)構(gòu)之間的化學(xué)平衡，導(dǎo)致以pH示差法檢測此范圍溶液中花青素含量出現(xiàn)偏差。

弱酸環(huán)境(pH 4.0～6.0)下花青素的自由基清除率顯著高于強(qiáng)酸及堿性環(huán)境，而熱處理對自由基清除率的影響較小?；ㄇ嗨貙煞N自由基的清除能力在pH>7.0的環(huán)境下出現(xiàn)顯著差別，可能與DPPH屬于氮自由基而ABTS屬于氮陽離子自由基有關(guān)。

緩沖液體系中含有的磷酸氫二鈉在乙醇中析出對光路產(chǎn)生物理阻擋，導(dǎo)致測定的未離心處理組抗氧化活性顯著高于離心處理組。