地骨皮甲素調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)通路對(duì)分泌性中耳炎大鼠的作用研究

卡迪麗婭·木拉提，艾力根·阿不都熱依木，張 瑾

0 引言

分泌性中耳炎(Otitis media with effusion，OME)是以中耳積液及聽(tīng)力下降為特征的中耳非化膿性炎性疾病，又稱(chēng)為滲出性中耳炎或卡他性中耳炎，為耳鼻喉科常見(jiàn)疾病。潑尼松是臨床上治療分泌性中耳炎常用的一種糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物，因其不良反應(yīng)較多而不宜長(zhǎng)期使用[1-3]。地骨皮甲素是一種從中藥地骨皮中分離出的生物堿類(lèi)物質(zhì)，研究表明，地骨皮具有抗興奮性神經(jīng)毒性、抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[4-7]。本文通過(guò)研究地骨皮甲素對(duì)分泌性中耳炎大鼠的作用及機(jī)制，為分泌性中耳炎的臨床治療提供新的參考及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠72只，SPF級(jí)別，6周齡，體重(180±20)g，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，購(gòu)買(mǎi)后進(jìn)行72 h適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。地骨皮甲素購(gòu)買(mǎi)于成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司，卵清蛋白(Ovalbumin，OVA，Ⅴ級(jí))購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，VEGF、VEGFR-2和GAPDH抗體均購(gòu)自Proteintech公司，RIPA蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天公司，IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6及IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，ECL顯色液購(gòu)自Thermo公司，全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自北京島津公司，雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀、凝膠成像儀均購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.2 分泌性中耳炎大鼠模型的建立及給藥 全部大鼠在電耳鏡下檢查，排除外耳道及中耳感染。將大鼠隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為對(duì)照組、模型組、地骨皮甲素低劑量組、地骨皮甲素中劑量組、地骨皮甲素高劑量組及潑尼松組，除對(duì)照組外，其余各組參照文獻(xiàn)方法[8-9]建立分泌性中耳炎大鼠模型。具體方法為：將1.2 mg OVA溶于0.6 ml磷酸緩沖液(Phosphate buffer solution，PBS)，再以5.14 mg氫氧化鋁溶于0.6 ml PBS作為免疫佐劑對(duì)大鼠行腹腔注射，第8天重復(fù)注射1次，此為全身致敏階段;第15天用10%水合氯醛15 mg/kg對(duì)大鼠行腹腔注射麻醉，在手術(shù)顯微鏡下經(jīng)鼓膜以微量進(jìn)樣器將0.1 mg OVA溶于35 μl PBS后注入大鼠中耳腔，第16天再次麻醉，耳內(nèi)鏡觀察鼓膜情況，并重復(fù)第2次注射，此為耳內(nèi)激發(fā)階段，制成OME模型。耳鏡檢查發(fā)現(xiàn)鼓膜明顯內(nèi)陷、紅斑，部分可見(jiàn)液平面及中耳內(nèi)氣泡形成，視為造模成功。

造模完成后，根據(jù)大鼠體重，對(duì)照組及模型組按照20 ml/kg灌胃給予生理鹽水，地骨皮甲素低、中、高劑量組按照20 ml/kg分別灌胃給予大鼠0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml的地骨皮甲素，潑尼松組按照20 ml/kg灌胃給予大鼠0.25 mg/ml的潑尼松，所有組別每天定時(shí)給藥1次，連續(xù)給藥21 d，最后一次給藥24 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平的測(cè)定 對(duì)各組大鼠通過(guò)眼眶靜脈叢取血至干凈離心管中，于4 ℃靜置4 h，然后置于離心機(jī)中，4 ℃，3 500 r/min離心10 min。取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.4 大鼠中耳灌洗液中IFN-γ、IL-4水平測(cè)定 參照文獻(xiàn)方法[9]，每組取6只大鼠，斷頭處死后，取出聽(tīng)泡，自聽(tīng)泡鉆孔，以50 μl PBS灌洗中耳腔3次并收集灌洗液共150 μl，于4 ℃以4 000 r/min離心10 min后，取上清液凍存于-20 ℃?zhèn)溆茫凑誆LISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)中耳滲液中IFN-γ、IL-4水平。

1.5 組織樣本的采集及組織蛋白的提取 大鼠頸椎脫臼處死后迅速分離大鼠中耳組織，然后將一部分中耳組織放入10%中性甲醛中固定，其余部分放入玻璃勻漿器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，置于4 ℃離心機(jī)以12 000 r/min離心10 min，用移液槍將上清液移至另一干凈離心管中，并向其中加入SDS loading buffer，混勻后放入100 ℃水浴5 min，然后放入-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，HE染色) 將在10%中性甲醛中固定24 h后的中耳組織轉(zhuǎn)移至75%的酒精中，經(jīng)自動(dòng)組織脫水機(jī)脫水、透明處理，在石蠟包埋機(jī)中浸蠟、包埋，進(jìn)行5 μm切片，水浴展開(kāi)，撈片，瀝干，放恒溫箱中烘干，置于烘箱中60 ℃烤2 h，常規(guī)HE染色，在顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。HE染色步驟：①脫蠟:將石蠟切片依次置于二甲苯(I)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min;②復(fù)水：依次置于100%乙醇2 min→95%乙醇1 min→80%乙醇1 min→75%乙醇1 min→蒸餾水洗2 min，各2次,然后把水吸干;③蘇木精染色：置于蘇木精溶液中2 min，自來(lái)水流水沖洗2 min，把水吸干;④分化：1%鹽酸乙醇分化30 s，自來(lái)水浸泡15 min，吸干水;⑤伊紅染色:置于伊紅溶液中2 min;⑥脫水:依次置于95%乙醇(I)5 min→95%乙醇(Ⅱ)5 min→100%乙醇(I)5 min→100%乙醇(Ⅱ)2 min;⑦封片：置于通風(fēng)櫥，待乙醇徹底干后依次置于二甲苯(I)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min，待載玻片上殘留二甲苯揮干后用中性樹(shù)膠封片。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 將凍存的大鼠中耳組織蛋白液于室溫下融化后，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，處理好待測(cè)樣品后，取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h，經(jīng)VEGF、VEGFR-2及GAPDH抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后，進(jìn)行灰度值檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 地骨皮甲素對(duì)分泌性中耳炎大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平的影響 各組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平見(jiàn)表1。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平顯著升高(P<0.05)，提示分泌性中耳炎大鼠存在病理性全身炎癥反應(yīng);與模型組比較，地骨皮甲素各劑量組及潑尼松組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平均顯著降低(P<0.05)，且隨著地骨皮甲素劑量的增加，地骨皮甲素各劑量組TNF-α、IL-6及IL-1β水平逐漸降低。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平(n=12)

2.2 地骨皮甲素對(duì)分泌性中耳炎大鼠中耳灌洗液中IFN-γ、IL-4水平的影響 各組大鼠中耳灌洗液中IFN-γ、IL-4水平見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠中耳灌洗液中IFN-γ、IL-4水平(n=6)

結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組大鼠中耳灌洗液中IFN-γ水平顯著降低(P<0.05)，IL-4水平顯著升高(P<0.05)，提示中耳灌洗液IFN-γ、IL-4水平可能與大鼠分泌性中耳炎大鼠發(fā)病機(jī)制密切相關(guān);與模型組比較，地骨皮甲素各劑量組及潑尼松組大鼠中耳灌洗液中IFN-γ水平顯著升高(P<0.05)、IL-4水平顯著降低(P<0.05)，且隨著地骨皮甲素劑量的增加，地骨皮甲素各劑量組大鼠中耳灌洗液中IFN-γ、IL-4水平變化表現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)性。

2.3 病理學(xué)檢查 各組大鼠中耳黏膜組織病理學(xué)檢查結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜細(xì)胞腫脹，黏膜增厚，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及多處細(xì)胞脫落，提示造模成功;與模型組比較，地骨皮甲素低、中劑量組分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜腫脹情況好轉(zhuǎn)，少見(jiàn)黏膜細(xì)胞脫落，地骨皮甲素高劑量組中耳黏膜較完整，細(xì)胞腫脹明顯好轉(zhuǎn)，偶見(jiàn)黏膜細(xì)胞脫落，潑尼松組分泌性中耳炎大鼠黏膜增厚基本消失，偶見(jiàn)細(xì)胞腫脹。

圖1 各組大鼠中耳黏膜組織病理學(xué)檢查結(jié)果(20×)注：A.對(duì)照組;B.模型組;C.地骨皮甲素低劑量組;D.地骨皮甲素中劑量組;E.地骨皮甲素高劑量組;F.潑尼松組

2.4 地骨皮甲素對(duì)分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR-2水平的影響 各組大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR-2水平見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR-2水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示VEGF信號(hào)通路的過(guò)度激活可能與大鼠分泌性中耳炎發(fā)病機(jī)制密切相關(guān);與模型組比較，地骨皮甲素各劑量組及潑尼松組大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR-2水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著地骨皮劑量的增加，VEGF、VEGFR-2水平逐漸降低，即表現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)性。

圖2 各組大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR水平(n=6)注：*與對(duì)照組比較，P<0.05;#與模型組比較，P<0.05

3 討論

OME的定義為不伴急性中耳炎癥狀和體征的中耳積液。OME具有一定的自限性，但約30%～40%患者會(huì)反復(fù)發(fā)作，其中又有5%～10%的患者發(fā)作時(shí)間持續(xù)≥1年。OME引起的持續(xù)中耳積液會(huì)降低鼓膜活動(dòng)度，阻礙聲音傳導(dǎo)。目前臨床上主要采用咽鼓管吹張、鼓膜穿刺、鼓膜置管、腺樣體切除術(shù)等對(duì)癥治療，使用抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素、黏液促排劑、鼻腔減充血?jiǎng)┑人幬镞M(jìn)行病因治療，但這些藥物會(huì)引起諸多不良反應(yīng)，不宜長(zhǎng)期應(yīng)用[1-3]。

地骨皮甲素是一種從地骨皮中分離出的生物堿類(lèi)物質(zhì)，具有抗興奮性神經(jīng)毒性、抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗腫瘤等藥理作用，并能夠抑制NF-κB通路及AP-1的活化，保護(hù)大鼠海馬體及預(yù)防大鼠因輻射誘發(fā)神經(jīng)炎[4-7]。

VEGF信號(hào)通路是參與腫瘤血管生成的重要信號(hào)通路。近年來(lái)研究表明，VEGF信號(hào)通路異常激活與肺癌、乳腺癌、胃癌、膽囊癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌等多種腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10-14]。研究表明，分泌性中耳炎大鼠中耳組織中VEGF信號(hào)通路表達(dá)異常，其發(fā)病機(jī)制可能與VEGF信號(hào)通路異常激活改變了大鼠中耳組織血管通透性有關(guān)[15-18]。

本文通過(guò)采用注射卵清蛋白的方法建立分泌性中耳炎大鼠模型。結(jié)果表明，與模型組比較，地骨皮甲素各劑量組及潑尼松組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平、中耳灌洗液中IL-4水平均顯著降低，而中耳灌洗液中IFN-γ水平顯著升高，且與地骨皮甲素的劑量呈依賴(lài)性;提示地骨皮甲素能夠呈劑量依賴(lài)性地顯著降低分泌性中耳炎大鼠血清炎癥因子水平，緩解分泌性中耳炎大鼠中耳炎癥狀態(tài)，改善疾病進(jìn)展，同時(shí)可能通過(guò)誘導(dǎo)大鼠中耳組織IFN-γ的產(chǎn)生，上調(diào)Th1型免疫應(yīng)答，抑制Th2細(xì)胞的增殖，減少Th2炎性介質(zhì)的釋放，進(jìn)一步抑制分泌性中耳炎大鼠中耳組織嗜酸性粒細(xì)胞的聚集，緩解中耳組織炎癥狀態(tài);病理學(xué)檢查結(jié)果表明，與模型組比較，地骨皮甲素低、中劑量組分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜腫脹情況好轉(zhuǎn)，少見(jiàn)黏膜細(xì)胞脫落，地骨皮甲素高劑量組中耳黏膜較完整，細(xì)胞腫脹明顯好轉(zhuǎn)，偶見(jiàn)黏膜細(xì)胞脫落，潑尼松組分泌性中耳炎大鼠黏膜增厚基本消失，偶見(jiàn)細(xì)胞腫脹，提示地骨皮甲素能夠明顯改善分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜組織病理學(xué)改變，緩解分泌性中耳炎大鼠的疾病狀態(tài)并改善疾病進(jìn)展;Western blot結(jié)果表明，與模型組比較，地骨皮甲素各劑量組及潑尼松組大鼠中耳黏膜VEGF及VEGFR-2水平均顯著降低，且與地骨皮甲素的劑量呈一定的依賴(lài)性，提示地骨皮甲素能夠呈劑量依賴(lài)性地降低分泌性中耳炎大鼠中耳黏膜VEGF、VEGFR-2水平，調(diào)節(jié)大鼠中耳黏膜VEGF信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而改善分泌性中耳炎大鼠的疾病狀態(tài)。

綜上所述，地骨皮甲素能夠緩解分泌性中耳炎大鼠的疾病狀態(tài)，改善大鼠疾病轉(zhuǎn)歸，其作用機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)通路有關(guān)。