芬戈莫德聯(lián)合順鉑通過調(diào)控COL11A1表達對順鉑耐藥胃癌細胞增殖和凋亡的影響

薛 珊，邢 穎*，宋華偉

0 引言

胃癌是常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。胃癌早期診斷率較低，多數(shù)患者在確診時已屬于晚期，錯過手術治療的最佳時期[2]?；熓峭砥谖赴┲委煹闹饕椒ǎ[瘤細胞常對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，導致化療療效降低甚至治療失敗[3]。順鉑(Cisplatin，DDP)是常用的化療藥物，尋找增強腫瘤細胞對DDP敏感性的方法對于改善晚期胃癌患者化療療效具有積極意義。芬戈莫德(Fingolimod，F(xiàn)TY720)是一種從冬蟲夏草中分離得到的鞘氨醇1-磷酸鹽受體抑制劑，可促進淋巴細胞歸巢、誘導淋巴細胞凋亡及抑制T淋巴細胞活性[4]。近年來研究顯示，F(xiàn)TY720還可誘導腫瘤細胞凋亡、增強化療敏感性及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，具有一定的抗腫瘤作用[5-6]。目前，還未見FTY720對胃癌耐藥細胞影響的相關報道。本研究主要觀察了FTY720聯(lián)合DDP對DDP耐藥胃癌細胞HGC27/DDP增殖和凋亡的影響及其可能的作用機制，以期為提高晚期胃癌化療療效提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞和實驗試劑 胃癌細胞系HGC27，上海美軒生物科技有限公司;注射用DDP，山東齊魯制藥公司;胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基，美國Gibco公司;FTY720和四甲基噻唑藍(MTT)，美國Sigma公司;LipofectamineTM2000試劑盒和Trizol試劑，美國Invitrogen公司;PCR引物、COL11A1的小干擾RNA(si-COL11A1)及亂序無意義陰性序列(si-NC)、COL11A1過表達載體(pcDNA-COL11A1)及空載體(pcDNA)，上海吉瑪制藥技術有限公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒，上海碧云天公司;XI型膠原α1鏈(COL11A1)單克隆抗體，武漢云克隆科技股份有限公司;細胞周期蛋白D1(CyclinD1)和活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-caspase-3)單克隆抗體，武漢博士德公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HGC27/DDP細胞建立和轉(zhuǎn)染 復蘇HGC27細胞，加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)培養(yǎng)。待細胞融合至80%左右時，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。用含0.1 μg/ml DDP完全培養(yǎng)基作用于HGC27細胞，連續(xù)作用2周后，間歇增加5 μg/ml DDP至DDP濃度為10 μg/ml。誘導后，HGC27細胞能夠在含10 μg/ml DDP的培養(yǎng)基中存活，即獲得耐DDP的HGC27細胞HGC27/DDP。將對數(shù)增殖期的HGC27/DDP細胞以1×105個/孔接種于6孔板中，采用LipofectamineTM2 000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染si-COL11A1、si-NC、pcDNA-COL11A1、pcDNA。轉(zhuǎn)染24 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細胞備用。

1.2.2 細胞分組處理 HGC27/DDP細胞分為對照組(NC組)、DDP組、FTY720組、FTY720+DDP組。NC組：完全培養(yǎng)基干預;DDP組：含10 μg/ml[7]DDP的完全培養(yǎng)基干預;FTY720組：含10 μmol/L[7]FTY720的完全培養(yǎng)基干預;FTY720+DDP組：含10 μg/ml DDP和10 μmol/L FTY720的完全培養(yǎng)基共同干預。轉(zhuǎn)染si-NC、si-COL11A1的細胞均用完全培養(yǎng)基干預，分別記為si-NC組和si-COL11A1組。轉(zhuǎn)染pcDNA-NC、pcDNA-COL11A1的細胞均用含10 μg/ml DDP和10 μmol/L FTY720的完全培養(yǎng)基共同干預，記為pcDNA-NC+FTY720+DDP組和pcDNA-COL11A1+ FTY720+DDP組。

1.2.3 MTT檢測HGC27/DDP細胞增殖 細胞以5×103個/孔接種于96孔板中，按“1.2.2”分組處理，每組設3個復孔。培養(yǎng)24 h后，加20 μl的MTT(5 mg/ml)。孵育4 h后，吸棄培養(yǎng)基，加150 μl二甲基亞砜，振蕩混勻，酶標儀490 nm測吸光度值(A)。細胞存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞儀檢測 HGC27/DDP細胞以2.5×104個/孔接種于24孔板中，按“1.2.2”分組處理，每組設3個復孔。培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶消化，收集細胞。取1.0×106個細胞，并用適量磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次。1 500 r/min離心5 min，棄上清。加400 μl結合緩沖液，混懸細胞。加10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫避光孵育15 min。再加100 μl結合緩沖液，混勻后上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 Western blot法檢測細胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3和COL11A1蛋白表達 細胞接種和分組處理時間同“1.2.4”。RIPA裂解液提取各組細胞中總蛋白，BCA法測蛋白濃度后定量，行SDS-PAGE電泳，并濕轉(zhuǎn)至聚PVDF膜，且于5%脫脂奶粉中封閉1 h。然后分別加CyclinD1(1∶800)、Cleaved-caspase-3(1∶1 000)和COL11A1(1∶500)一體，4 ℃孵育過夜。再加山羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h。最后加化學發(fā)光試劑，避光顯影，曝光拍照。以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

1.2.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測COL11A1 mRNA表達 細胞接種和分組處理時間同“1.2.4”。Trizol試劑提取各組細胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行擴增。擴增程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。COL11A1上游5′-GTCGGCAAGTCGA-TGCTCG-3′，下游5′-GCTCGAAAGCTCGCAACGTGCT-3′;β-actin上游5′-GTGCAAGCTGTGCCGCACG-3′，下游5′-CGCAACGTGCGTACAACAGT-3′。2-△△Ct法計算COL11A1 mRNA相對于β-actin的相對表達水平。

2 結果

2.1 FTY720聯(lián)合順鉑對HGC27/DDP細胞增殖的影響 與NC組比較，F(xiàn)TY720組和FTY720+DDP組HGC27/DDP細胞存活率和CyclinD1蛋白表達降低(P<0.05)，DDP組HGC27/DDP細胞存活率和CyclinD1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與DDP組或FTY720組比較，F(xiàn)TY720+DDP組HGC27/DDP細胞存活率和CyclinD1蛋白表達降低(P<0.05)。見圖1、表1和表2。

圖1 Western blot檢測CyclinD1蛋白表達

表1 FTY720聯(lián)合順鉑對HGC27/DDP細胞 增殖的影響(n=9)

表2 FTY720聯(lián)合順鉑對HGC27/DDP細胞CyclinD1 蛋白表達的影響(n=9)

2.2 FTY720聯(lián)合順鉑對HGC27/DDP細胞凋亡的影響 與NC組比較，F(xiàn)TY720組和FTY720+DDP組HGC27/DDP細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達升高(P<0.05)，DDP組HGC27/DDP細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與DDP組或FTY720組比較，F(xiàn)TY720+DDP組HGC27/DDP細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達升高(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 FTY720聯(lián)合順鉑對HGC27/DDP細胞凋亡的影響注：A.流式細胞儀檢測細胞凋亡，B.Western blot檢測Cleaved-caspase-3蛋白表達

表3 FTY720聯(lián)合順鉑對HGC27/DDP細胞 凋亡的影響(n=9)

2.3 FTY720聯(lián)合順鉑對HGC27/DDP細胞COL11A1基因表達的影響 與NC組比較，F(xiàn)TY720組和FTY720+DDP組HGC27/DDP細胞中COL11A1 的mRNA和蛋白表達降低(P<0.05)，DDP組HGC27/DDP細胞中COL11A1 的mRNA和蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與DDP組或FTY720組比較，F(xiàn)TY720+DDP組HGC27/DDP細胞中COL11A1 的mRNA和蛋白表達降低(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 Western blot檢測COL11A1蛋白表達

表4 FTY720聯(lián)合順鉑對HGC27/DDP細胞 COL11A1基因表達的影響(n=9)

2.4 COL11A1低表達對HGC27/DDP細胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組比較，si-COL11A1組HGC27/DDP細胞存活率、COL11A1和CyclinD1蛋白表達降低(P<0.05)，凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達升高(P<0.05)。見圖4、表5。

圖4 Western blot檢測COL11A1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表達

表5 COL11A1低表達對HGC27/DDP細胞增殖和凋亡的影響(n=9)

2.5 COL11A1高表達逆轉(zhuǎn)FTY720聯(lián)合順鉑對HGC27/DDP細胞的抗腫瘤作用 與pcDNA-NC+FTY720+DDP組比較，pcDNA-COL11A1+FTY720+DDP組HGC27/DDP細胞存活率、COL11A1和CyclinD1蛋白表達升高(P<0.05)，凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達降低(P<0.05)。見圖5、表6。

3 討論

腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性是腫瘤化療失敗的主要原因[8]，降低腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性對于提高腫瘤化療療效和改善患者預后具有重要意義。FTY720是一種新型免疫抑制藥物，可與西羅莫司、環(huán)孢素等聯(lián)合應用增強免疫抑制作用，且能夠抑制多種腫瘤細胞的生長[9-10]。有報道，F(xiàn)TY720可有效增強吉西他濱對人肺癌細胞株增殖的抑制作用及凋亡促進作用，為非小細胞肺癌的治療提供了新方法[11-12]。FTY720通過下調(diào)趨化因子受體CCR4表達降低調(diào)節(jié)性T細胞的遷移能力來抑制小鼠結腸癌的發(fā)展[13]。FTY720可誘導乳腺癌細胞凋亡，為乳腺癌的治療提供了新思路[14]。目前，F(xiàn)TY720對胃癌耐藥細胞增殖、凋亡等惡性生物學行為的影響還未知。

圖5 Western blot檢測COL11A1、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達

表6 COL11A1高表達逆轉(zhuǎn)FTY720聯(lián)合順鉑對HGC27/DDP細胞的抗腫瘤作用(n=9)

細胞的異常增殖可誘發(fā)腫瘤。CyclinD1是細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，可促進細胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變，加速細胞增殖[15]。誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的一種途徑。caspase-3是caspase級聯(lián)反應關鍵調(diào)控蛋白，活化后可放大caspase級聯(lián)反應，促進細胞凋亡[16]。本研究顯示，F(xiàn)TY720作用耐順鉑胃癌細胞HGC27/DDP后，細胞存活率和CyclinD1蛋白表達降低，凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達升高，提示FTY720可能通過抑制CyclinD1表達降低HGC27/DDP細胞增殖，促進Cleaved-caspase-3蛋白表達誘導細胞凋亡，提示FTY720可改善胃癌細胞對順鉑的耐藥性。FTY720與順鉑共同作用HGC27/DDP細胞后，細胞存活率、凋亡率及CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達的變化更加明顯，提示FTY720可增強順鉑對胃癌耐藥細胞增殖抑制劑的凋亡促進作用。

COL11A1是纖維膠原蛋白家族的重要成員之一，在前列腺癌[17]、喉鱗狀細胞癌[18]等多種腫瘤中表達異常，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。研究顯示，干擾COL11A1表達可降低卵巢癌順鉑耐藥細胞的遷移、侵襲和克隆形成能力，降低卵巢癌順鉑耐藥細胞的耐藥性[19]。Li等[20]研究顯示，COL11A1在胃癌中發(fā)揮致癌基因作用，其表達升高促進胃癌細胞生長和侵襲，是胃癌治療的潛在靶標。然而，目前尚不清楚COL11A1對胃癌細胞耐藥性的影響還未知。本研究顯示，抑制COL11A1表達可降低耐順鉑胃癌細胞HGC27/DDP的增殖能力并促進細胞凋亡，提示COL11A1可能是改善胃癌細胞對順鉑耐藥性的作用靶點。FTY720可抑制耐順鉑胃癌細胞HGC27/DDP中COL11A1的mRNA和蛋白表達，而FTY720聯(lián)合DDP對HGC27/DDP細胞中COL11A1的mRNA和蛋白表達的抑制作用更加明顯，提示FTY720聯(lián)合DDP可能通過抑制細胞中COL11A1表達增強胃癌耐藥細胞對順鉑的敏感性。本研究還顯示，COL11A1過表達降低了FTY720聯(lián)合DDP對HGC27/DDP細胞增殖的抑制作用以及凋亡的促進作用，進一步說明了FTY720聯(lián)合DDP通過下調(diào)COL11A1表達降低胃癌耐藥細胞對順鉑的耐藥性。

綜上所述，F(xiàn)TY720聯(lián)合DDP可抑制胃癌耐順鉑細胞的增殖，并促進細胞凋亡，其可能通過下調(diào)COL11A1表達降低胃癌耐順鉑細胞對順鉑的耐藥性，為通過逆轉(zhuǎn)胃癌順鉑耐藥細胞的耐藥性來改善胃癌化療療效提供了新思路。