博斯騰湖沉積物氨氧化細菌的篩選與鑒定

馬曉林，李遠婷，田永芝，張建平，安登第

(1.新疆特殊環(huán)境物種多樣性應用與調(diào)控重點實驗室,新疆師范大學，烏魯木齊 830054；2.新疆巴音郭楞蒙古自治州環(huán)境監(jiān)測站，新疆庫爾勒 841000 )

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集 以博斯騰湖大湖區(qū)布設的17個國家基準環(huán)境監(jiān)測站位[23]中的2、6、8、11、12和14號共6個位點為研究對象(圖1)，于2015年8月以活塞式柱狀底泥采樣器(KHT0204)收集40 cm厚度沉積物樣品，以20 cm為梯度將其分為表層(0～20 cm)和深層(20～40 cm)共計12個樣品，在無菌環(huán)境下充分混勻分裝置-80 ℃保存。同時收集上覆水樣品置于無菌瓶中-4 ℃ 保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 銨鹽富集培養(yǎng)基參照李煥等[24]配方的基礎上做適當調(diào)整。磷酸二氫鈉0.75 g，磷酸氫二鉀0.25 g，硫酸銨2 g，硫酸鎂0.01g，硫酸錳0.03 g，碳酸鈉0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min，固體培養(yǎng)基加入15%的瓊脂粉。

1.2 方 法

1.2.1 水體環(huán)境因子的檢測 采用美國YSI EXO2多參數(shù)水質(zhì)分析儀現(xiàn)場監(jiān)測水體pH、溶解氧、溫度及電離度。參照國標(GB11894-89)[25]堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定總氮含量；參照國標(HJ 537-2009 )[26]蒸餾-中和滴定法測定氨氮的含量。

1.2.2 沉積物微生物的富集培養(yǎng) 稱取10 g沉積物樣品到90 mL無菌水中，加入玻璃珠于搖床震蕩3 h后靜置30 min。吸上清菌液1 mL移至50 mL銨鹽富集培養(yǎng)基中，25 ℃ 120 r/min避光培養(yǎng)30 d，從第9天起每3 d測定各培養(yǎng)液OD600值，掌握菌株的生長情況及菌液中亞硝酸鹽的含量。N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法檢驗亞硝酸鹽的生成[7]。

1.2.3 單菌的分離純化 11個(20～40 cm)沉積物樣品經(jīng)富集培養(yǎng)21 d后(此時菌液中亞硝酸鹽含量較高)取混合菌液做梯度稀釋并以涂布法接種至銨鹽培養(yǎng)基上于25 ℃培養(yǎng)。每隔3～5 d挑取單菌落畫線培養(yǎng)直至革蘭氏染色鑒定為單個菌株。將單菌株接種于液體培養(yǎng)基，期間每隔2 d取適量菌液檢測生長曲線和亞硝酸鹽含量。

1.2.4 16S rRNA基因分析 提取純化的單菌株總DNA，采用16S rRNA基因通用引物27F 和1492R擴增目的片段，PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

16S rRNA基因測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，鑒定菌種分類并提交菌株序列獲得登陸號。采用GraphPad Prism 5.01軟件進行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 上覆水中氮含量檢測

了解水體環(huán)境因素有利于分析氨氧化菌的生物脫氮能力從而更好的分離有效的氨氧化細菌。對博斯騰湖不同區(qū)域水體總氮含量檢測顯示，水質(zhì)符合國家III及IV類水標準，適用于養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)和旅游業(yè)，不能用作城鄉(xiāng)生活用水(表1)。除6號采樣點上覆水有輕度氮污染外其余位點水質(zhì)良好，該結(jié)果基本與2015年環(huán)境狀況公報一致[6]。11號采樣點氨氮含量占總氮含量的65.8%，表明外源氮的輸入偏高。通過采樣實地考察結(jié)合張明[27]對博斯騰湖面源污染現(xiàn)狀分析表明該水域外源性氮污染主要受西部沿岸農(nóng)業(yè)灌溉和北部魚蝦養(yǎng)殖雙重影響。湖泊整體溶解氧質(zhì)量濃度均值為7.8 mg/L，表明水體含氧量充足。上述結(jié)果與巴雅爾等[28]報道的湖泊環(huán)境狀況趨勢一致，亦是對博斯騰湖大湖區(qū)生態(tài)健康狀況評價的一個 補充。

表1 各采樣位點水體環(huán)境因素檢測結(jié)果Table 1 Characterization of sampling water of six sites of Bosten Lake

注：水質(zhì)標準以總氮含量判斷。

Note:Water quality standard judged by total nitrogen content.

2.2 沉積物混合菌株富集培養(yǎng)及亞硝酸鹽含量分析

根據(jù)采樣位點上覆水及底泥溫度，將沉積物富集培養(yǎng)溫度確定為25 ℃。氨氧化細菌多為好氧細菌，生長周期長，生長緩慢[20]，根據(jù)前期試驗將培養(yǎng)時間確定為30 d。通過檢測培養(yǎng)液中亞硝酸鹽含量及變化規(guī)律有助于篩選有效的氨氧化細菌。如圖2所示，不同水域同一深度沉積物樣品混合菌液對銨態(tài)氮的響應差別較大，2、6、11和12號位點沉積物混合菌液中亞硝酸鹽含量隨培養(yǎng)時間的增加波動較大。由于亞硝酸鹽是硝化作用的中間產(chǎn)物，其含量主要受氨氧化細菌和亞硝酸氧化菌的協(xié)同作用影響[12]，上述結(jié)果表明沉積物富集培養(yǎng)液中各種氨氧化菌的協(xié)同脫氨作用明顯；同一水域，表層沉積物(0～20 cm)混合菌液對銨態(tài)氮的響應迅速且波動幅度較大。尤其是2、6和12號位點表層沉積物混合菌液亞硝酸鹽含量變化明顯且迅速(在培養(yǎng)第9天就檢測到溶液中高含量的亞硝酸鹽)，而深層沉積物對銨鹽的響應較遲緩，表明表層沉積物微生物較易受環(huán)境因素影響[29-30]。另外，值得注意的是深層沉積物中亦存在高效轉(zhuǎn)氨作用的氨氧化細菌(6號及11號位點)；沉積物混合菌液對銨態(tài)氮的響應表現(xiàn)出兩種不同的方式。一種方式表現(xiàn)為2(0～20 cm)、6 (0～20 cm)和6(20～40 cm)沉積物微生物均能在第9天～第12天內(nèi)很快產(chǎn)生亞硝酸鹽并使其達到一個峰值，進而又在第12天～第15天使其含量下降至最低水平。在27 d 的培養(yǎng)周期內(nèi)亞硝酸鹽含量出現(xiàn)兩次瞬時峰值。另一種方式表現(xiàn)為12(0～20 cm)和11(20～40 cm)號沉積物混合菌株約需要用3 d(第18天～第21天)時間積累溶液中亞硝酸鹽且在接下來3 d內(nèi)將其穩(wěn)定維持在較高水平。其中11(20～40 cm)混合菌液溶液亞硝酸鹽質(zhì)量濃度最高可達26.16 mg/L并穩(wěn)定維持6 d，隨后逐漸下降。高氨氮濃度有利于氨氧化反應的進行[31]，結(jié)合水體氨氮含量分析表明上覆水中高濃度的氨氮含量是導致11號位點沉積物微生物有效響應銨鹽的原因之一。

為了初步了解這兩種不同脫氨方式可能的原因，分析亞硝酸鹽含量表現(xiàn)為典型瞬時波動和持續(xù)累積的4個沉積物混合菌液的生長情況。從圖3中可以看出，6(0～20 cm)和6(20～40 cm)樣品混合菌株的生長情況與亞硝酸鹽的積累量沒有明顯關(guān)系。12(0～20 cm)和11(20～40 cm)樣品中亞硝酸鹽的含量隨著菌液濃度的增加而升高，其中11(20～40 cm)樣品培養(yǎng)液中亞硝酸積累量最高，說明該混合菌液中存在有效氨氧化作用的氨氧化細菌，可進一步將其分離純化。另外，研究表明深層土壤/沉積物中多數(shù)為厭氧氨氧化細菌，其對環(huán)境中無機氮的利用效率較好氧氨氧化菌更高[32-34]。11號位點深層沉積物中的氨氧化菌可能與厭氧氨氧化有關(guān)。

2.3 單菌的分離純化及氨氧化作用的檢測

從亞硝酸含量最高的11(20～40 cm)混合菌液中分離純化出30株單菌分析其氨氧化能力。最終篩選出兩株有效脫氨作用的氨氧化細菌(BSL4.6和BSL4.10)。 如圖4所示，純化菌株在培養(yǎng)的第2天～第4天進入指數(shù)生長期，隨后進入平臺期。溶液中亞硝酸鹽含量隨菌液濃度的增加而升高，即第2天～第6天成指數(shù)增長，隨后逐漸緩慢積累至平臺期直至培養(yǎng)到第18天時，兩個株菌均呈現(xiàn)二次生長趨勢，此時溶液中亞硝酸鹽濃度有所下降，表明菌株可能利用溶液中的亞硝酸鹽為底物生長。

2.4 單菌16S rRNA基因序列分析及形態(tài)鑒定

以單菌總DNA為模板擴增16S rRNA基因序列，產(chǎn)物測序后經(jīng)BLAST分析表明，菌株BSL4.6與赤紅球菌屬(Rhodococcus)的多個菌株相似率為100%；BSL4.10與彎曲芽孢桿菌屬(Bacillus)多個菌株相似率為100%。革蘭氏染色結(jié)果進一步顯示BSL4.6為球狀革蘭氏陽性菌，BSL4.10為桿狀革蘭氏陽性菌。綜上所述，初步鑒定菌株BSL4.6屬于赤紅球菌(Rhodococcusruber)，菌株BSL4.10屬于彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)并獲得登錄號如表2所示。本研究中菌株BSL4.6和BSL4.10能利用銨鹽為唯一氮源生長且能將銨鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，因此鑒定其為氨氧化細菌。

表2 菌株的分類Table 2 Identification of strains

3 討 論

氣候變化和人類活動加劇了博斯騰湖富營養(yǎng)化程度，尤其是近年來農(nóng)業(yè)灌溉和漁業(yè)養(yǎng)殖導致西部沿岸水體礦化度明顯偏高[35]。研究表明，在富營養(yǎng)化水體中氨氧化細菌通常在氨氧化過程中發(fā)揮主導作用[36]。因此，本文著重以博斯騰湖西部沿岸4個、北部和南部沿岸各1個位點共6個水域的水體和沉積物為對象，開展水環(huán)境因子及氨氧化細菌活性的相關(guān)研究。

湖泊沉積物氨氧化細菌的組成及氨氧化能力主要受水體鹽度、溶解氧、溫度、pH及無機鹽等因素影響[37-39]。其中，氨氮濃度的增加會導致氨氧化細菌種群豐度的增大，而菌群豐度大小可以大致反映硝化勢的高低[40]。以日本淡水湖泊北浦湖為例，由于沿湖周邊農(nóng)業(yè)灌溉和養(yǎng)殖活動，導致水體氨氮濃度極大增高，促進了沉積物中氨氧化菌群豐富度及活性[41]。本研究結(jié)果顯示，博斯騰湖大湖區(qū)水體基本為中度營養(yǎng)，外源性氨氮輸入量峰值出現(xiàn)在湖泊西岸11號位點，原因是由灌溉排水和北部魚蝦養(yǎng)殖輸入大量礦物鹽[35]。同時，對6個采樣點表層(0～20 cm)和深層(20～40 cm)共12個沉積物樣品中氨氧化菌群在高銨鹽濃度下的活性分析發(fā)現(xiàn)，11號水域沉積物菌群氧化銨鹽為亞硝酸鹽的能力最強，表明該菌群中存在有效的氨氧化細菌。上述結(jié)果與前人報道一致，即在氨氮濃度較高的水域，氨氧化細菌的豐度及氨氧化作用更明顯[42]。

深層沉積物取樣較困難，故對湖泊沉積物氨氧化菌的研究大都集中在表層(0～30 cm范圍)。受水體營養(yǎng)因素及環(huán)境條件影響，表層沉積物氨氧化菌無論從菌群豐度和氨氧化能力上均表現(xiàn)出較為迅速的環(huán)境響應[43]，尤其在高濃度銨鹽壓力下表層氨氧化細菌的豐度和氨氧化效果都有所增加[42]。與上述結(jié)果類似，本研究結(jié)果表明大部分采樣位點表層沉積物對銨鹽的響應更為迅速，波動幅度大。2、6、11和12號位點在檢測初期均顯示出較高的亞硝酸鹽積累量，但其響應強度及波動幅度因水域不同而有所差異。對于湖泊深層沉積物氨氧化菌的報道多集中于菌群結(jié)構(gòu)組成及豐度的環(huán)境因子響應方面，而對氨氧化活性的研究鮮有報道。本研究表明淡水湖泊深層沉積物 (20～40 cm)亦存在較高活性的氨氧化細菌群，其利用銨鹽生成亞硝酸鹽的量遠遠高于表層沉積物?？赡艿脑蚴牵罕韺映练e物氨氧化菌群結(jié)構(gòu)更復雜，具有協(xié)同響應作用；深層沉積物結(jié)構(gòu)較單一且富含大量厭氧氨氧化菌，其在高氨氮濃度壓力下其氧化作用尤為明顯[34]。隨后將進一步檢測各位點不同深度沉積物氨氧化菌群組成及豐度以明確其產(chǎn)生高氨氧化活性的原因。

由于培養(yǎng)條件嚴苛、分離純化難度大，生長周期長等原因，從自然界中獲得可培養(yǎng)的氨氧化細菌種類有限，而從深層沉積物中獲得可培養(yǎng)的具有活性的氨氧化細菌更少。對太湖富營養(yǎng)湖區(qū)氨氧化菌群結(jié)構(gòu)多樣性分析發(fā)現(xiàn)，沉積物氨氧化細菌群落主要包括亞硝化單胞菌(Nitrosomonas) 和亞硝化螺菌(Nitrosospira) 兩大屬[15]。與之不同，本研究從11號深層沉積物中分離的兩株氨氧化細菌分別為赤紅球菌屬(Rhodococcus)和彎曲芽孢桿菌屬(Bacillus)。與氨氧化細菌的特性一致[44]，這兩株菌均能以銨鹽為唯一氮源將其轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，且這一活性隨著菌株濃度的增加而升高，尤其在培養(yǎng)的第2天至第4天，隨后溶液中的亞硝酸含量一直較穩(wěn)定的維持較高水平，表明這兩株菌均為氨氧化細菌。后續(xù)實驗將分別詳細鑒定菌株的理化性質(zhì)、氨氧化活性及其環(huán)境響應特性，為干旱內(nèi)陸湖泊的原位修復做好菌種資源儲備。

4 結(jié) 論

中度營養(yǎng)化的干旱內(nèi)陸淡水湖泊博斯騰湖沉積物中富含氨氧化細菌。從水平分布來看，西部水域11號位點沉積物氨氧化細菌活性高于其他水域，水體高氨氮含量是導致該結(jié)果的原因之一。從垂直分布來看，表層沉積物氨氧化菌群對氨氮的響應迅速，亞硝酸鹽積累量波動明顯，混合菌群表現(xiàn)出協(xié)同脫氨作用；深層沉積物亦存在高效的氨氧化細菌群，其對銨鹽響應雖相對遲緩，但反應強烈且穩(wěn)定(11、12號位點)。從11(20～40 cm)混合菌株中分離純化得到兩株(BSL4.6和BSL4.10)可培養(yǎng)的具有明顯活性的氨氧化細菌，分別鑒定其為赤紅球菌(Rhodococcusruber)和彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)。據(jù)此，本研究豐富了對博斯騰湖沉積物氨氧化細菌功能的認識，為干旱內(nèi)陸淡水湖泊氮污染修復提供了菌種 儲備。