桂枝茯苓丸對痰濕型多囊卵巢綜合征模型大鼠的改善作用及機(jī)制研究

余璟瑋 鐘曉瑩 曾蕾 鄭泳霞

摘 要 目的：研究桂枝茯苓丸對痰濕型多囊卵巢綜合征（PCOS）模型大鼠的改善作用及可能機(jī)制。方法：將50只動(dòng)情周期規(guī)律的雌性SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組（n=10）和造模組（n=40）。造模組大鼠采用灌胃來曲唑[1 mg/（kg·d），連續(xù)21 d]的方法建立痰濕型PCOS模型。將造模成功的40只大鼠再隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組[陽性對照，0.135 g/（kg·d）]和桂枝茯苓丸低、高劑量組[4.49、17.96 g/（kg·d）]，每組10只。各藥物組大鼠均灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥30 d;空白對照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水。末次給藥結(jié)束后，采用口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)檢測大鼠灌胃葡萄糖溶液0、30、60、120 min后的血糖水平;采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清中促卵泡生成激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、睪酮（T）水平;稱定大鼠體質(zhì)量和子宮、雙側(cè)卵巢、性腺旁脂肪的質(zhì)量;采用蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠卵巢組織的形態(tài)學(xué)變化;分別采用實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法和Western blotting法檢測大鼠卵巢組織中芳香化酶（CYP19a1）和子宮組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（Glut4）的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與空白對照組比較，模型組大鼠灌胃葡萄糖溶液30、60、120 min后的血糖水平以及血清中LH、E2、T水平均顯著升高（P<0.05）;體質(zhì)量和子宮、雙側(cè)卵巢、性腺旁脂肪的質(zhì)量均顯著增加（P<0.05）;卵泡膜細(xì)胞體積明顯增大、呈圓球形;卵巢組織中CYP19a1和子宮組織中Glut4的mRNA及其蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠上述指標(biāo)水平均顯著改善（P<0.05或P<0.01）;桂枝茯苓丸低、高劑量組大鼠卵泡膜細(xì)胞層厚度和卵泡膜細(xì)胞體積也有一定改善。結(jié)論：桂枝茯苓丸能夠上調(diào)卵巢組織中CYP19a1基因及子宮組織中Glut4基因的表達(dá)，從而改善痰濕型PCOS模型大鼠糖代謝異常、減輕胰島素抵抗、下調(diào)血清雌激素水平、減輕卵巢多囊樣改變程度，最終起到治療PCOS的作用。

關(guān)鍵詞 桂枝茯苓丸;痰濕型多囊卵巢綜合征;胰島素抵抗;芳香化酶;葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the improvement effect and mechanism of Guizhi fuling pill （GZFLP） on rats with phlegm-dampness type polycystic ovary syndrome（PCOS）.METHODS： Totally fifty female SD rats with regular estrous cycle were randomly divided into blank control group （n=10） and model group （n=40）. The model group received letrozole intragastrically [1 mg/（kg·d），for 21 d ] to induce phlegm-damp PCOS rat model. Forty model rats were randomly divided into model group， metformin group [positive control， 0.135 g/（kg·d）] and GZFLP low-dose， high-dose groups [4.49， 17.96 g/（kg·d）]， with 10 rats in each group. Each medicine group was given intragastric administration， once a day， for 30 consecutive days. ?Blank control and model group were given intragastric administration of equal volume normal saline.After last medication， oral glucose tolerance test （OGTT） was used to detect the level of blood glucose in rats at 0， 30， 60 and 120 min. ELISA assay was used to detect the levels of follicle-stimulating hormone （FSH）， luteinizing hormone （LH）， estradiol （E2） and testosterone （T）; body weight， the weight of uterus， bilateral ovaries and paragonadal fat were weighed. HE staining was used to observe morphological changes of ovarian tissue sections. RT-PCR method and Western blotting assay were used to detect mRNA and protein expression of CYP19a1 in ovary and Glut4 in uterine. RESULTS： Compared with blank control group， the levels of blood glucose 30， 60， 120 min after intragastric administration of glucose solution as well as serum levels of LH， E2 and T were increased significantly in model group （P<0.05）; the body weight， the weight of uterus， bilateral ovaries and paragonadal fat were increased significantly （P<0.05）; the volume of thecal cells increased significantly and showed spherical shape; the mRNA and protein expression of CYP19a1 in ovarian tissue and Glut4 in uterine tissue were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， above indexes of administration groups were improved significantly （P<0.05 or P<0.01）; the thickness of theca cell layer and the volume of theca cells in GZFLP low-dose and high-dose groups were also improved. CONCLUSIONS： GZFLP can up-regulate the expression of CYP19a1 in ovary and Glut4 in uterus， so as to improve the abnormal glucose metabolism in phlegm-dampness type PCOS model rats， reduce insulin resistance， lower serum estrogen levels，and reduce the degree of polycystic changes in ovary， thereby playing a role in the treatment of PCOS.

2.3 口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)

末次給藥結(jié)束后，各組大鼠禁食不禁水12 h，然后按2 g/kg（以葡萄糖量計(jì)）灌胃50%葡萄糖溶液。分別在灌胃前（0 min）和灌胃后30、60、120 min時(shí)，于大鼠尾靜脈取血，采用GOP-POD終點(diǎn)法[21]在全自動(dòng)分析儀中測定大鼠的血糖水平。

2.4 大鼠體質(zhì)量和血清中甾體激素水平檢測

口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，對所有大鼠禁食不禁水12 h，次日清晨測定其體質(zhì)量，然后腹腔注射10%水合氯醛將其麻醉，自眼眶后靜脈叢取血。將血樣以2 000 r/min離心10 min，分離血清，采用ELISA法檢測血清中FSH、LH、E2、T水平，具體操作嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 大鼠臟器質(zhì)量測定和卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察

取血后，將大鼠以頸椎脫臼處死，剖腹取出并分離子宮、雙側(cè)卵巢、性腺旁脂肪，清洗后稱定質(zhì)量并記錄。取一半卵巢組織，用10%中性福爾馬林固定液固定、石蠟包埋，常規(guī)進(jìn)行組織連續(xù)切片（厚度10 μm），再脫蠟、水化后，行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，以中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察大鼠卵巢組織的形態(tài)學(xué)變化。余下的組織置于-80 ℃冰箱中保存，待測。

2.6 大鼠卵巢組織中CYP19a1和子宮組織中Glut4的 mRNA表達(dá)水平檢測

采用RT-PCR法進(jìn)行檢測。分別稱取大鼠卵巢組織和子宮組織各約100 mg，剪碎后，采用Trizol法提取組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。經(jīng)鑒定后，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（共20 μL）：SYBR熒光染料10 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 模板4 μL，無核酸酶水2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃變性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，重復(fù)45個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析大鼠卵巢組織中CYP19a1和子宮組織中Glut4的mRNA表達(dá)水平。引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

2.7 大鼠卵巢組織中CYP19a1和子宮組織中Glut4的蛋白表達(dá)水平檢測

采用Western blotting法進(jìn)行檢測。分別取大鼠卵巢組織和子宮組織適量，加入裂解液使其充分裂解，然后以12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白煮沸5 min變性后，取30 ?g進(jìn)行SDS-PAGE，然后以恒流（100 mA，2 h）電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上;用5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h后，加入CYP19a1、Glut4、GAPDH一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;以TBST緩沖液洗膜3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 200），室溫孵育1 h;采用ECL化學(xué)試劑盒顯色后，在凝膠成像系統(tǒng)中成像。采用ImageJ V 1.8.0.112圖像分析軟件進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的灰度值之比表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠灌胃葡萄糖不同時(shí)段的血糖水平檢測結(jié)果

在灌胃葡萄糖溶液前（0 min時(shí)），各組大鼠之間血糖水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在灌胃葡萄糖溶液30、60、120 min時(shí)，與空白對照組比較，模型組大鼠血糖水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，二甲雙胍組和桂枝茯苓丸低、高劑量組大鼠血糖水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與二甲雙胍組比較，桂枝茯苓丸高劑量組大鼠的血糖水平在灌胃葡萄糖溶液120 min時(shí)顯著降低（P<0.05）。與桂枝茯苓丸低劑量組比較，桂枝茯苓丸高劑量組大鼠的血糖水平在各個(gè)時(shí)段差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠灌胃葡萄糖溶液不同時(shí)段的血糖水平檢測結(jié)果見表2。

3.2 大鼠血清中甾體激素水平檢測結(jié)果

各組大鼠血清中FSH水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與空白對照組比較，模型組大鼠血清中LH、E2、T水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組和桂枝茯苓丸低、高劑量組大鼠血清中LH、E2、T水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且各藥物組之間上述指標(biāo)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠血清中FSH、LH、E2、T水平檢測結(jié)果見表3。

3.3 大鼠體質(zhì)量和臟器質(zhì)量的檢測結(jié)果

與空白對照組比較，模型組大鼠的體質(zhì)量以及子宮、性腺旁脂肪質(zhì)量均顯著增加（P<0.05）。與模型組比較，二甲雙胍組和桂枝茯苓丸低、高劑量組大鼠的體質(zhì)量以及子宮、性腺旁脂肪質(zhì)量均顯著降低（P<0.05），且各藥物組之間上述指標(biāo)水平差異無統(tǒng)計(jì)意義（P>0.05）。各組大鼠體質(zhì)量以及卵巢、子宮、性腺旁脂肪質(zhì)量檢測結(jié)果見表4。

3.4 大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

空白對照組大鼠卵泡膜細(xì)胞層無增厚，卵泡膜細(xì)胞體積較小、呈梭形;模型組和二甲雙胍組大鼠卵泡膜細(xì)胞層均明顯增厚，卵泡膜細(xì)胞體積明顯增大、呈圓球形;桂枝茯苓丸低、高劑量組大鼠的卵泡膜細(xì)胞層亦有所增厚，但與模型組、二甲雙胍組相比較薄，卵泡膜細(xì)胞體積也介于空白對照組和模型組、二甲雙胍組之間。各組大鼠卵巢組織HE染色結(jié)果見圖1。

3.5 大鼠卵巢組織中CYP19a1和子宮組織中Glut4的mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果

與空白對照組比較，模型組大鼠卵巢組織中CYP19a1和子宮組織中Glut4的mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，桂枝茯苓丸低、高劑量組大鼠卵巢組織中CYP19a1和子宮組織中Glut4的mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且各藥物組之間上述指標(biāo)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠卵巢組織中CYP19a1和子宮組織中Glut4的mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果見表5。

3.6 大鼠卵巢組織中CYP19a1和子宮組織中Glut4的蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果

與空白對照組比較，模型組大鼠卵巢組織中CYP19a1和子宮組織中Glut4的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，桂枝茯苓丸低、高劑量組和二甲雙胍組大鼠卵巢組織中CYP19a1和子宮組織中Glut4的蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），并且桂枝茯苓丸的作用具有量效關(guān)系（P<0.05）。與桂枝茯苓丸低劑量組比較，二甲雙胍組和桂枝茯苓丸高劑量組上述指標(biāo)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組大鼠卵巢組織中CYP19a1和子宮組織中Glut4的蛋白表達(dá)電泳圖見圖2，蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果見表6。

4 討論

PCOS作為婦科常見的內(nèi)分泌紊亂綜合征，是復(fù)雜的多因素疾病，與遺傳基因、生活方式、心理因素等均有聯(lián)系[22]。根據(jù)PCOS的臨床特征與表現(xiàn)，該病屬于祖國醫(yī)學(xué)“閉經(jīng)”“癥瘕”“不孕”等范疇，與腎、肝、脾三臟相關(guān)。脾腎陽虛、溫煦氣化失?？芍滤悍e聚而成痰濕之邪，肝失疏泄無法通調(diào)水道則加劇痰濕阻塞胞宮，形成癥瘕，最終導(dǎo)致不孕[23]。一般認(rèn)為，胰島素抵抗是PCOS的核心病理、生理特征之一，大約50%～75%的PCOS患者均患有不同程度的胰島素抵抗[24]。目前，臨床治療PCOS主要使用降低雄激素水平、促排卵和胰島素增敏劑等類型為主的藥物[25-26]。近年來，中醫(yī)藥在PCOS治療上的應(yīng)用越來越受關(guān)注。研究證實(shí)，桂枝茯苓丸對大鼠卵巢趨化因子——細(xì)胞因子誘導(dǎo)性中性白細(xì)胞趨化因子（CINC）的分泌有直接促進(jìn)作用，同時(shí)還能減輕卵巢多囊樣改變、改善血流供應(yīng)，從而促進(jìn)排卵、恢復(fù)卵巢功能，對PCOS有一定的改善作用[27]。

本研究采用灌胃來曲唑的方法進(jìn)行痰濕型PCOS造模，主要是基于芳香化酶是雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化的限速酶，而來曲唑是一種芳香化酶抑制劑，給藥后可使體內(nèi)雄激素水平升高，并進(jìn)展成為多囊卵巢[28]。結(jié)果顯示，造模后，大鼠卵巢形態(tài)學(xué)改變明顯，體質(zhì)量以及卵巢、子宮、性旁腺脂肪質(zhì)量均顯著增加，血清中甾體激素LH、E2、T水平均顯著降低，這與痰濕型PCOS患者的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果相似[29]，因此可以認(rèn)為來曲唑造模大鼠符合痰濕型PCOS的表現(xiàn)。二甲雙胍作為臨床上常用的胰島素增敏劑，可抑制肝糖原異生和葡萄糖的輸出，提高外周組織對胰島素的敏感性，抑制胰島素分泌，進(jìn)而減輕胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[30]。因二甲雙胍同時(shí)也是臨床治療PCOS的常用藥物之一，故本研究以其為陽性對照藥物。

由本研究結(jié)果可看出，桂枝茯苓丸與二甲雙胍不僅能夠明顯降低痰濕型PCOS模型大鼠的體質(zhì)量以及卵巢、子宮、性腺旁脂肪的質(zhì)量，還能降低其血清中甾體激素（LH、E2、T）水平以及糖耐量實(shí)驗(yàn)中各測試時(shí)段的血糖水平。這提示桂枝茯苓丸具有與二甲雙胍相似的功效，即通過調(diào)節(jié)機(jī)體糖代謝水平，降低痰濕型PCOS模型大鼠體質(zhì)量及性腺旁脂肪的質(zhì)量，提高機(jī)體對胰島素的敏感性，緩解高胰島素血癥;同時(shí)，可使甾體激素水平接近正常值，從而改善內(nèi)分泌紊亂及代謝異常，最終達(dá)到恢復(fù)卵巢功能的作用[16，31]。但本研究中各組大鼠血清中FSH水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與造模方法相關(guān)，由于PCOS的發(fā)病過程受多種因素調(diào)控影響，故難以用一種特定的造模方法完全模擬臨床上PCOS患者的發(fā)病過程和代謝水平的改變[29]，這也是本研究的不足之一。

在本研究中，與空白對照組比較，痰濕型PCOS模型大鼠的卵巢增大，卵巢內(nèi)卵泡呈多囊樣改變，卵泡膜細(xì)胞體積增大、細(xì)胞層增厚，病理表現(xiàn)與臨床痰濕型PCOS患者相符[29]。經(jīng)藥物干預(yù)后，桂枝茯苓丸組大鼠卵泡膜細(xì)胞層雖有增厚，但較模型組和二甲雙胍組薄，卵泡膜細(xì)胞體積也介于空白對照組和模型組、二甲雙胍組之間。以上結(jié)果說明，與二甲雙胍比較，桂枝茯苓丸更能減輕大鼠卵巢多囊樣改變的程度，加快其排卵功能的恢復(fù)，治療痰濕型PCOS的效果更佳。

CYP19a1基因位于染色體15q21.2區(qū)位上，其編碼產(chǎn)物芳香化酶P450在雄激素代謝中發(fā)揮著重要作用，是催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的關(guān)鍵酶[32-33]。相關(guān)研究證實(shí)，CYP19a1基因突變、表達(dá)下調(diào)或芳香化酶的活性降低均可直接造成卵巢性的高雄激素血癥和增加PCOS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。如Yu YY等[34]觀察到在PCOS患者卵巢組織中由于啟動(dòng)子高甲基化，CYP19a1的mRNA及其蛋白表達(dá)均受到抑制，從而引起雄激素過多和促性腺激素分泌異常，而這一過程在PCOS的發(fā)病中起關(guān)鍵作用;再如Wang H等[35]進(jìn)行病例對照研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，CYP19a1基因中常見的遺傳變異可預(yù)測PCOS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，如該基因的Arg（264）Cys變體會影響芳香酶的活性，導(dǎo)致雄烯二酮向雌激素的轉(zhuǎn)化增加，證明CYP19a1基因與PCOS的病理發(fā)展過程相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)，痰濕型PCOS模型大鼠卵巢組織中CYP19a1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，灌胃桂枝茯苓丸后大鼠卵巢組織中CYP19a1 mRNA和蛋白表達(dá)水平又顯著升高，說明桂枝茯苓丸可通過上調(diào)卵巢組織中CYP19a1基因的表達(dá)，增加其體內(nèi)mRNA和蛋白水平，從而促進(jìn)激素轉(zhuǎn)化、降低雄激素水平、調(diào)節(jié)激素紊亂，達(dá)到治療痰濕型PCOS的目的。

Glut4被稱為胰島素敏感性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由SLC2A4基因編碼，共含有509個(gè)氨基酸，可存在于子宮內(nèi)膜中，是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體，通過調(diào)控機(jī)體類固醇激素水平，從而影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、分化、分泌和凋亡[36-37]。已有研究顯示，肥胖型PCOS患者伴有顯著的胰島素抵抗水平升高及Glut4活性降低，胰島素抵抗可導(dǎo)致Glut4葡萄糖信號的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)異常、局部細(xì)胞受損，進(jìn)而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜功能異常，并增加了胚胎著床失敗和流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)[5];而Glut4的功能障礙也會進(jìn)一步加劇胰島素抵抗，各種因素之間相互作用產(chǎn)生惡性循環(huán)，加速PCOS病情的發(fā)展[38]。Sato K等[39]發(fā)現(xiàn)，過高的T水平可通過骨骼肌中的絲氨酸/蘇氨酸（Akt）等途徑影響Glut4蛋白正常的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)，是PCOS發(fā)病的病理過程之一。在本研究中，與模型組比較，桂枝茯苓丸低、高劑量組大鼠子宮組織中Glut4 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示桂枝茯苓丸能通過上調(diào)Glut4 mRNA和蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)葡萄糖攝取、改善胰島素抵抗，從而改善痰濕型PCOS機(jī)體子宮內(nèi)膜容受性，有利于恢復(fù)生殖功能和避免長期代謝綜合征，達(dá)到治療PCOS的目的。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了桂枝茯苓丸可能通過上調(diào)卵巢組織中CYP19a1和子宮組織中Glut4的mRNA及蛋白的表達(dá)，從而改善痰濕型PCOS模型大鼠的糖代謝異常、減輕胰島素抵抗、下調(diào)血清雌激素水平、減輕卵巢多囊樣改變程度，最終起到治療PCOS的作用。但由于PCOS具有發(fā)病機(jī)制多樣性、臨床表現(xiàn)異質(zhì)性和復(fù)雜性的特點(diǎn)，在一定程度上限制了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，故桂枝茯苓丸治療PCOS的具體作用機(jī)制有待后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證和完善。

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（收稿日期：2020-04-14 修回日期：2020-12-04）

（編輯：林 靜）