霧化吸入和腹腔注射依達(dá)拉奉對煙霧吸入性損傷肺模型大鼠保護(hù)作用的比較研究

肖長栓 劉婭平 楊景哲

摘 要 目的：比較霧化吸入和腹腔注射依達(dá)拉奉對煙霧吸入性肺損傷模型大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用。方法：將30只雄性SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組（A組）、致傷空白組（B組）、致傷腹腔注射治療組（C組）和致傷低、高劑量霧化吸入治療組（D、E組），每組6只。B～E組大鼠均被置于含松木屑的煙霧發(fā)生器中復(fù)制煙霧吸入性肺損傷模型;A組大鼠除不放松木屑外，其余操作同上。造模后30 min，C組大鼠腹腔注射依達(dá)拉奉18 mg/kg（每間隔70 min重復(fù)1次，共4次）;D、E組大鼠霧化吸入依達(dá)拉奉9、18 mg/kg（霧化吸入10 min，每間隔60 min重復(fù)1次，共4次）;A、B組大鼠不作任何處理。末次給藥后6 h，進(jìn)行大鼠動脈血?dú)夥治?，并計算大鼠肺濕干比（W/D）和肺組織含水率;采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測其血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-10含量;采用ELISA等方法檢測其肺組織中丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）含量;采用蘇木精-伊紅染色法觀察其肺組織病理改變;采用TUNEL法檢測其肺組織細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：A組大鼠肺組織未見異常;B組大鼠肺組織中可見出血及水腫，肺泡結(jié)構(gòu)難以辨認(rèn)，并可見炎癥細(xì)胞和紅細(xì)胞浸潤;C～E組大鼠肺組織上述癥狀均有不同程度改善。與A組比較，其余組大鼠動脈氧分后和吸入氧濃度比值（PaO2/FiO2）以及肺組織SOD含量均顯著降低（P<0.05）;肺含水率、W/D，血清TNF-α、IL-6、IL-10含量以及肺組織MDA、MPO、Caspase-3含量和細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.05）。與B組比較，各給藥組大鼠動脈PaO2/FiO2以及血清IL-10含量均顯著升高（P<0.05）;肺含水率、W/D，血清TNF-α、IL-6含量以及肺組織MDA、MPO、Caspase-3含量和細(xì)胞凋亡率均顯著降低，且呈劑量依賴性（P<0.05）。結(jié)論：依達(dá)拉奉對煙霧吸入性肺損傷模型大鼠具有一定的保護(hù)作用，可劑量依賴性地減少炎癥介質(zhì)和（或）細(xì)胞因子的產(chǎn)生及釋放、減輕過氧化損傷并抑制細(xì)胞凋亡，且霧化吸入較腹腔注射的效果更明顯。

關(guān)鍵詞 霧化吸入;腹腔注射;依達(dá)拉奉;吸入性肺損傷;量效關(guān)系;大鼠;保護(hù)作用;炎癥因子

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To compare the protective effect of atomization inhalation and intraperitoneal injection of edaravone on acute lung injury in smoke inhalation lung injury model rats. METHODS： Thirty male SD rats were divided into normal control group （group A）， injury group （group B）， intraperitoneal injection group （group C）， low-dose aerosol inhalation group （group D）， high-dose aerosol inhalation group （group E） according to random numble table， with 6 rats in each group. Group B-E were placed in smoke generator containing pine sawdust to induce smoke inhalation lung injury model. In group A， the operation was the same as above except that the pine sawdust was not placed. Thirty minutes after modeling， group C were injected intraperitoneally with edaravone 18 mg/kg （every 70 min， 4 times in total）. Group D and E inhaled edaravone 9， 1.8 mg/kg （every 60 min， lasting for 10 min each time， 4 times in total）. The rats were treated by no means in group A and group B. Six hours after last medication， arterial blood gas analysis was performed， and the lung wet to dry ratio （W/D） and water content of lung tissue were calculated. The levels of TNF-α， IL-6 and IL-10 in serum were detected by double antibody ELISA. The contents of MDA， MPO， SOD and Caspase-3 in lung tissue were determined by ELISA and other methods. HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue. The apoptotic rate of cells in lung tissue were determined by TUNEL assay. RESULTS： No abnormality was found in lung tissue of group A; in group B， hemorrhage and edema were found in lung tissue， alveolar structure was difficult to identify， and inflammatory cells and red blood cell infiltration were seen. Above symptoms of rats in group C-E were improved to different extent. Compared with group A， PaO2/FiO2 and SOD content of lung tissue were decreased significantly in other groups （P<0.05）; water content of lung tissue， W/D， serum contents of TNF-α， IL-6 and IL-10， the contents of MDA， MPO and Caspase-3 in lung tissue， apoptotic rate were increased significantly （P<0.05）. Compared with group B， PaO2/FiO2 and serum contents of IL-10 were increased significantly in administration groups （P<0.05）; water content of lung tissue， W/D， serum contents of TNF-α and IL-6， the contents of MDA， MPO and Caspase-3 in lung tissue， apoptotic rate were significantly decreased， in dose-dependent manner （P<0.05）. CONCLUSIONS： Edaravone has a certain protective effect on smoke inhalation lung injury model rat. It can reduce the production and release of inflammatory mediators and/or cytokines， reduce the peroxide damage and inhibit cell apoptosis in a dose-dependent manner. The effect of atomization inhalation is more obvious than that of intraperitoneal injection.

KEYWORDS ? Atomization inhalation; Intraperitoneal injection; Edaravone; Smoke inhalation lung injury; Dose-effect relationship; Rats; Protective effect; Inflammation factor

近年來有數(shù)據(jù)顯示，各種火災(zāi)事故所致死亡的人員中，有75%被證實合并不同程度的吸入性損傷[1]。吸入性損傷是發(fā)生在呼吸道及肺實質(zhì)、因熱力和（或）煙霧造成的一種燒傷嚴(yán)重合并癥，具有病情危重、發(fā)病隱匿等特點[1]。研究表明，吸入性肺損傷發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，可能與熱力/煙霧等致傷因素激活肺部炎癥細(xì)胞后分泌某些炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子，導(dǎo)致失控性炎癥反應(yīng)發(fā)生，產(chǎn)生大量氧自由基，繼而啟動系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）有關(guān)，嚴(yán)重時可引發(fā)呼吸窘迫綜合征（ARDS）以及多器官功能障礙綜合征（MODF），嚴(yán)重危害人體健康[2]。對于吸入性肺損傷，臨床現(xiàn)多采用氣管切開及灌洗、機(jī)械通氣等介入綜合治療措施，但多因治療費(fèi)用昂貴、收效甚微而被人們詬病;此外，國內(nèi)外學(xué)者還進(jìn)行了相關(guān)藥物的體內(nèi)研究，但其安全性及有效性欠佳[3]。因此，尋找可靠的干預(yù)手段以有效減輕吸入性肺損傷的原發(fā)性炎癥反應(yīng)及繼發(fā)性損害成為當(dāng)前研究的熱點之一。目前，多種抗炎及抗氧化劑被廣泛應(yīng)用于動物研究和臨床治療中，其中依達(dá)拉奉是近年來較為常見的一種新型氧自由基清除劑。研究表明，該藥可通過抑制脂質(zhì)過氧化及調(diào)節(jié)炎癥因子分泌、抑制細(xì)胞凋亡等途徑來發(fā)揮神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用[4]。多項研究表明，依達(dá)拉奉在多種原因?qū)е碌募毙苑螕p傷中均顯示出積極的作用[5-6]，但將該藥用于改善煙霧吸入性肺損傷，目前國內(nèi)外報道較少。此外，依達(dá)拉奉具有較好的親脂性，且分子量小，故能較容易地透過細(xì)胞膜滲入局部組織器官及動靜脈并獲得良好的組織及血管內(nèi)藥物濃度[7]，加之霧化吸入方式可使藥物直達(dá)靶器官，因此筆者推測給藥方式的改變可能更有利于肺保護(hù)?；诖?，本研究擬通過早期霧化吸入不同劑量及腹腔注射高劑量依達(dá)拉奉對煙霧吸入性肺損傷模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，比較兩種給藥方式對煙霧吸入性肺損傷的保護(hù)作用并探討其可能機(jī)制，以期為臨床治療提供實驗依據(jù)和新思路。

1 材料

1.1 儀器

MHY-27127型煙霧發(fā)生器（北京美華儀科技有限公司）;ABL-800型血?dú)夥治鰞x（丹麥Radiometer公司）;PARI Turbo BOY N型系列霧化機(jī)（德國PARI GmbH公司）;ELX800UV型酶標(biāo)檢測儀（美國BioTek公司）;Centrifuge5702型離心機(jī)（德國Eppendorf公司）;CK40型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）;KD-BM型生物組織包埋機(jī)（浙江金迪科迪儀器設(shè)備有限公司）;RM2235型石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）。

1.2 藥品與試劑

依達(dá)拉奉原料藥[雙鶴藥業(yè)（商丘）有限責(zé)任公司，批號：19042011，純度：99.7%];蘇木精-伊紅（HE）染色液（安徽雷根生物技術(shù)有限公司，批號：20191010）;免疫染色強(qiáng)力通透液、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)液（北京百奧萊博科技有限公司，批號分別為20191008、20191011）;大鼠白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-10、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國R&D公司，批號分別為20180505、20180308、20180401、20180305）;大鼠丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、考馬斯亮藍(lán)蛋白檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20171213、20171214、20171212、20171224）;TUNEL檢測陽性對照制備試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司科技發(fā)展公司，批號：20171020）;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

清潔級雄性SD大鼠，60日齡，體質(zhì)量約200 g，由中國食品藥品檢定研究院提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2017-0005。所有大鼠均飼養(yǎng)于室溫22～25 ℃的環(huán)境下，并自由飲食、飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行后續(xù)實驗，并于實驗前12 h禁食、自由飲水。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

取大鼠30只，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，即正常對照組（A組）、致傷空白組（B組）、致傷腹腔注射治療組（C組）和致傷低、高劑量霧化吸入治療組（D、E組），每組6只。按如下步驟制作煙霧吸入性肺損傷模型：提前在煙霧發(fā)生器內(nèi)放入松木屑，打開電源，發(fā)煙15 min，打開致傷室進(jìn)氣口閥門和風(fēng)扇，當(dāng)報警器報警后關(guān)閉閥門;B、C、D、E組大鼠腹腔注射鹽酸氯胺酮（100 mg/kg）進(jìn)行麻醉后，放入致傷室下層，打開致傷室中間開槽式拉板，使大鼠吸入煙霧致傷5 min;關(guān)閉開槽式拉板，取出大鼠置于空氣流通處5 min，當(dāng)其呼吸和心率接近致傷前水平后再次同法致傷，共重復(fù)操作3次，整個致傷過程約持續(xù)30 min。A組大鼠除不放松木屑外，其余步驟操作與上述致傷組別相同。

參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-10]，將D、E組大鼠的給藥劑量分別設(shè)定為9、18 mg/kg;參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]，腹腔注射依達(dá)拉奉9 mg/kg效果明顯且具有劑量依賴性，故C組選擇高劑量18 mg/kg。造模后30 min，C組大鼠腹腔注射依達(dá)拉奉18 mg/kg，每間隔70 min重復(fù)1次，共4次;D、E組大鼠于自制密閉玻璃箱中分別用霧化機(jī)以0.1 mL/min霧化吸入依達(dá)拉奉9、18 mg/kg（即將依達(dá)拉奉1.8、3.6 mg分別溶于生理鹽水1 mL中制成吸入用藥液）10 min，每間隔60 min重復(fù)1次，共4次;A、B組大鼠不作任何處理。模型制作及給藥過程中無大鼠死亡等意外情況發(fā)生。

2.2 標(biāo)本采集

各組大鼠末次給藥后6 h，用血?dú)忉槼槿☆i動脈血1 mL，用于血?dú)夥治?于大鼠正中線剖開胸腹部，取腹主動脈血約5 mL，以3 000 r/min離心15 min后，分離血清，于-20 ℃冷凍保存，用于TNF-α、IL-6、IL-10含量的檢測;取血后，處死大鼠，迅速取出肺臟，選取左肺組織，于-70 ℃冷凍保存，用于MDA、MPO、SOD、Caspase-3含量的檢測;選取右肺后葉組織，置于4%甲醛溶液中固定24 h，用于病理檢查和凋亡率檢測;選取右肺前葉及中葉組織適量，用于肺濕干比（W/D）及肺組織含水率的檢測。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 血?dú)夥治龊蚖/D、肺組織含水率檢測 取頸動脈血樣本，于取樣后30 min內(nèi)使用血?dú)夥治鰞x進(jìn)行血?dú)夥治觯⒂嬎銊用}氧合指數(shù)[即動脈氧分壓和吸入氧濃度比值（PaO2/FiO2）]。取右肺前葉及中葉組織適量，用濾紙拭干表面血漬和污物，稱定濕質(zhì)量，隨后于80 ℃烘烤48 h，再稱定干質(zhì)量，計算W/D和肺組織含水率：W/D=肺濕質(zhì)量/肺干質(zhì)量，肺組織含水率=（肺濕質(zhì)量-肺干質(zhì)量）/肺濕質(zhì)量×100%。

2.3.2 血清中IL-6、IL-10、TNF-α含量檢測 取血清標(biāo)本，采用雙抗體夾心ELISA法以酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10含量，嚴(yán)格按照各試劑盒說明書操作。

2.3.3 肺組織中MDA、MPO、SOD、Caspase-3含量檢測 取左肺組織適量，用濾紙拭干表面血漬和污物，剪碎并充分研磨，按質(zhì)量體積比1 ∶ 9的比例加入4 ℃生理鹽水，制備組織勻漿。取勻漿液適量，以考馬斯亮藍(lán)蛋白測定法檢測肺組織勻漿液中蛋白的濃度后，分別采用鄰聯(lián)茴香胺供氫法、硫代巴比妥酸法、黃嘌呤氧化酶法、ELISA法以酶標(biāo)儀于460、532、550、450 nm處檢測各組大鼠肺組織中MPO、MDA、SOD、Caspase-3含量，嚴(yán)格按照各試劑盒說明書操作。

2.3.4 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 取固定于4%甲醛溶液中的右肺后葉組織適量，依次經(jīng)脫水、石蠟包埋后切片（厚度約5 μm），再經(jīng)HE染色后置于顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織的病理改變情況。

2.3.5 肺組織細(xì)胞凋亡率檢測 采用TUNEL法檢測。取固定于4%甲醛溶液中的右肺后葉組織適量，依次經(jīng)脫水、石蠟包埋后切片（厚度約5 μm）;進(jìn)行TUNEL染色，再經(jīng)免疫染色強(qiáng)力通透液浸泡、冰上促滲2 min后，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）沖洗3次;加入脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)液適量，于37 ℃反應(yīng)60 min，用PBS沖洗3次。每只大鼠隨機(jī)選取5個非重疊的高倍鏡視野（×400倍）觀察，記錄凋亡細(xì)胞數(shù)（凋亡細(xì)胞染色后熒光增強(qiáng)）和細(xì)胞總數(shù)，計算肺組織細(xì)胞凋亡率：肺組織細(xì)胞凋亡率=肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)/肺組織細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料均以x±s表示，并進(jìn)行方差齊性（Hartley法）及正態(tài)分布（Shapiro-Wilk法）檢驗。符合正態(tài)分布且方差齊時采用方差分析，不符合正態(tài)分布且方差不齊時采用非參數(shù)檢驗;組間兩兩比較采用SNK法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠動脈PaO2/FiO2、W/D和肺組織含水率比較

與A組比較，B、C、D、E組大鼠動脈PaO2/FiO2均顯著降低，W/D和肺組織含水率均顯著升高（P<0.05）。與B組比較，C、D、E組大鼠動脈PaO2/FiO2均顯著升高，且D、E組顯著高于C組，E組顯著高于D組（P<0.05）;肺組織含水率、W/D均顯著降低，且D、E組顯著低于C組，E組顯著低于D組（P<0.05），詳見表1（表中，1 mmHg=0.133 kPa）。

3.2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10含量比較

與A組比較，B、C、D、E組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10含量均顯著升高（P<0.05）。與B組比較，C、D、E組大鼠血清中IL-10含量均顯著升高，且D、E組顯著高于C組，E組顯著高于D組（P<0.05）;TNF-α、IL-6含量均顯著降低，且D、E組顯著低于C組，E組顯著低于D組（P<0.05），詳見表2。

3.3 各組大鼠肺組織中MDA、MPO、SOD含量的比較

與A組比較，B、C、D、E組大鼠肺組織中MDA、MPO含量均顯著升高，SOD含量顯著降低（P<0.05）。與B組比較，C、D、E組肺組織中MDA、MPO含量均顯著降低，且D、E組顯著低于C組，E組顯著低于D組（P<0.05）;SOD含量均顯著升高，且D、E組顯著高于C組，E組顯著高于D組（P<0.05），詳見表3。

3.4 肺組織病理切片觀察結(jié)果

A組大鼠肺組織未見水腫及出血，肺泡腔結(jié)構(gòu)完整、清晰，壁均勻且光滑，肺泡腔內(nèi)無炎癥細(xì)胞浸潤;B組大鼠肺組織可見出血及水腫，肺泡結(jié)構(gòu)難以分辨且壁厚，伴有程度不一的萎縮及擴(kuò)張，腔內(nèi)可見較多炎癥細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤;C組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)仍不清晰，形狀尚不規(guī)則、大小不一致，仍有一定程度的萎縮及擴(kuò)張，肺泡腔內(nèi)尚有一定數(shù)量的炎癥細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤;D組大鼠肺組織出血、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤程度均較C組輕，肺組織輕度水腫、少量出血，肺泡結(jié)構(gòu)清楚、大小較一致、形狀較規(guī)則;E組大鼠肺組織未見出血，水腫程度較D組進(jìn)一步減輕，肺泡大小一致、形態(tài)較規(guī)則，腔內(nèi)紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞浸潤程度最輕，詳見圖1。

3.5 肺組織細(xì)胞凋亡率和Caspase-3含量比較

與A組比較，B、C、D、E組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率和Caspase-3含量均顯著升高（P<0.05）;與B組比較，C、D、E組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率和Caspase-3含量均顯著降低，且D、E組顯著低于C組，E組顯著低于D組（P<0.05），詳見表4。

4 討論

嚴(yán)重?zé)齻l(fā)生后，由于患者早期無特異性癥狀，醫(yī)護(hù)人員往往更加關(guān)注其大面積體表燒傷而忽視其呼吸道損傷，一旦錯過最佳治療時機(jī)，將極易造成患者肺通氣及換氣功能共同受損，從而誘發(fā)和加重全身多臟器功能障礙，危及其生命[3]。盡管目前醫(yī)療水平有了較大提高，但對吸入性肺損傷仍缺乏有效的治療手段[3]。如果能及時有效地對吸入性肺損傷進(jìn)行早期干預(yù)、保護(hù)臟器組織細(xì)胞及功能，無疑對后續(xù)治療具有重要意義。依達(dá)拉奉是一種最初應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的氧自由基清除劑，有資料顯示，該藥可通過減少細(xì)胞色素聚集、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡通路的方式來改善缺血性腦損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能癥狀[4，11];此外，依達(dá)拉奉還可通過減少炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子的產(chǎn)生及釋放對小腸缺血再灌注及海水淹溺所致肺損傷發(fā)揮積極的保護(hù)作用[12-13]。吸入性肺損傷可誘導(dǎo)并放大炎癥反應(yīng)，啟動細(xì)胞凋亡程序，造成肺組織細(xì)胞凋亡及肺功能障礙，其中所產(chǎn)生的氮、氧自由基（ONOO-、·OH等）可使肺組織中脂質(zhì)及蛋白發(fā)生氧化、硝化/亞硝化反應(yīng)，破壞組織完整性[1，7，14];而依達(dá)拉奉可通過把單電子轉(zhuǎn)移給自由基轉(zhuǎn)化為依達(dá)拉奉基團(tuán)的方式來阻斷上述過氧化過程[15]。此外，依達(dá)拉奉親脂性較好，容易透過細(xì)胞膜[7];加之霧化吸入可使藥物直達(dá)靶器官，故筆者推測該給藥方式可能優(yōu)于臨床現(xiàn)有的靜脈、肌內(nèi)注射。同時，鑒于已有文獻(xiàn)[8-10]，腹腔注射依達(dá)拉奉9 mg/kg即對吸入性肺損傷模型大鼠有肯定的改善作用，且這種作用呈劑量依賴性，因此筆者暫未將腹腔注射依達(dá)拉奉9 mg/kg設(shè)為陽性對照，而是選擇效果更明顯的腹腔注射劑量18 mg/kg與霧化吸入（9、18 mg/kg）進(jìn)行比較，同時通過檢測炎癥、過氧化、細(xì)胞凋亡等相關(guān)指標(biāo)來探索其治療大鼠吸入性肺損傷的機(jī)制。

本研究病理切片結(jié)果顯示，致傷后，大鼠肺組織水腫明顯，腔內(nèi)可見炎癥細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移，表示煙霧吸入性肺損傷模型建立成功。經(jīng)藥物干預(yù)后，各藥物組大鼠肺損傷均有不同程度的改善，肺組織充血水腫減輕，毛細(xì)血管通透性降低，炎癥細(xì)胞數(shù)量減少，且有劑量依賴趨勢。這表明，與依達(dá)拉奉腹腔注射比較，霧化吸入方式給藥可更有效地減輕模型大鼠肺水腫及炎癥反應(yīng)，且高劑量效果更好。

煙霧、熱力等致傷因素?fù)p傷呼吸道后可致肺部單核巨噬細(xì)胞過度活化，產(chǎn)生及釋放大量炎癥介質(zhì)及促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6等），啟動炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺組織水腫，造成肺血流比例失常，使組織缺少充分的灌注及氧合，從而加重肺水腫與氣道梗阻，形成惡性循環(huán)[14，16]。其中，TNF-α是重要的促炎因子，不僅可增加外周血中多形核白細(xì)胞（PMN）的趨化能力，還可促使骨髓白細(xì)胞被釋放至循環(huán)系統(tǒng)，活化血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而啟動、延續(xù)、放大局部及全身炎癥反應(yīng);TNF-α激活內(nèi)皮細(xì)胞后，后者進(jìn)一步誘導(dǎo)多種炎癥細(xì)胞分泌IL-6等細(xì)胞因子，加重肺水腫及炎癥反應(yīng)程度[17]。IL-6是炎癥細(xì)胞調(diào)控因子，當(dāng)急性肺損傷發(fā)生后，其外周血含量非常高，并可大量活化炎癥細(xì)胞、上調(diào)黏附分子及其他細(xì)胞因子水平，產(chǎn)生級聯(lián)“瀑布”效應(yīng)，進(jìn)一步加強(qiáng)炎癥反應(yīng)。TNF-α、IL-6能較好地體現(xiàn)肺組織的損傷程度，是炎癥性疾病中多臟器功能衰竭及死亡的重要標(biāo)志，故可將其作為評價肺損傷治療效果的可靠指標(biāo)[18]。IL-10是一種可拮抗多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子對組織破壞作用的重要抗炎因子。炎癥反應(yīng)發(fā)生后，體內(nèi)多種免疫細(xì)胞被激活，合成并分泌IL-10，其可抑制單核巨噬細(xì)胞和PMN分泌并釋放TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2，對炎癥反應(yīng)中的器官組織有積極的保護(hù)作用[19]。有研究表明，依達(dá)拉奉可以明顯減輕重度燙傷大鼠肺部炎癥反應(yīng)，顯著改善肺水腫及氧合情況[20]。另有報道稱，吸入性肺損傷大鼠腹腔注射依達(dá)拉奉，可減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生及釋放，減輕肺水腫程度，提高動脈氧分壓[10]?；诖?，本研究通過檢測動脈PaO2/FiO2、W/D、肺組織含水率來評估大鼠肺組織炎癥反應(yīng)后其肺水腫及肺微血管損傷的情況，通過檢測TNF-α、IL-6含量來反映其肺組織炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度，通過測定血清中IL-10的含量來間接反映其機(jī)體抗炎能力。結(jié)果顯示，B、C、D、E組大鼠動脈PaO2/FiO2均較A組顯著降低，W/D、肺組織含水率以及血清中TNF-α、IL-6、IL-10含量均較A組顯著升高（其中B組IL-10含量也升高的原因可能與吸入性肺損傷發(fā)生早期致傷因素可活化多種免疫細(xì)胞，使機(jī)體自身抗炎能力得到一定程度的改善有關(guān)[19]）;經(jīng)藥物干預(yù)后，C、D、E組大鼠動脈PaO2/FiO2、血清中IL-10含量均較B組顯著升高，W/D、肺組織含水率以及血清中IL-6、TNF-α含量均較B組顯著降低，且呈劑量依賴性。這提示在煙霧吸入致肺損傷中，霧化吸入較腹腔注射依達(dá)拉奉能更有效地減輕模型大鼠肺水腫、改善氧合、降低炎癥及細(xì)胞因子水平，且在一定范圍內(nèi)用藥劑量越高效果越好。

在正常生理狀態(tài)下，SOD廣泛分布在機(jī)體各個組織器官內(nèi)，其作用為抑制化學(xué)性趨化因子活化、阻斷炎癥通路，是反映機(jī)體清除氧自由基能力的可靠指標(biāo);MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物之一，其水平高低反映了氧自由基攻擊組織細(xì)胞的嚴(yán)重程度及體內(nèi)氧自由基的水平;MPO可反映組織細(xì)胞內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤的嚴(yán)重程度[21-22]。林思寧等[15]報道，依達(dá)拉奉可有效提高顱腦創(chuàng)傷后腦組織中SOD的含量，降低MDA、MPO的含量。本研究結(jié)果顯示，與A組比較，B、C、D、E大鼠肺組織中MPO、MDA含量均顯著升高，SOD含量均顯著降低，提示模型大鼠氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡;經(jīng)藥物干預(yù)后，C、D、E組大鼠肺組織中MPO、MDA含量均顯著降低，SOD含量均顯著升高，且呈劑量依賴性。這提示給藥后模型大鼠抗氧化能力增強(qiáng)，且對于煙霧吸入性肺損傷，霧化吸入較腹腔注射依達(dá)拉奉的抗氧化作用更明顯，且存在一定的量效關(guān)系。

煙霧吸入性損傷發(fā)生后，局部炎癥細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6和大量自由基，導(dǎo)致胞膜鈣失衡，細(xì)胞色素C等凋亡啟動因子自細(xì)胞線粒體中釋放，誘發(fā)Caspases的級聯(lián)反應(yīng)，最終使下游凋亡執(zhí)行因子Caspase-3激活，從而誘發(fā)廣泛的細(xì)胞凋亡，使肺損傷進(jìn)一步加重[23-24]。Caspase-3標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆的階段，故檢測肺組織細(xì)胞凋亡率及其中Caspase-3的含量可反映吸入性損傷肺組織的細(xì)胞凋亡情況[25]。有研究表明，對于脂多糖導(dǎo)致的肺損傷，依達(dá)拉奉可通過下調(diào)Caspase-3的表達(dá)來有效抑制大鼠肺組織細(xì)胞凋亡[26]。本研究結(jié)果表明，與A組比較，B、C、D、E組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率和Caspase-3含量均顯著升高;經(jīng)藥物干預(yù)后，C、D、E組大鼠肺組織上述指標(biāo)均較A組顯著降低，且上述變化E組>D組>C組。這提示對于吸入性肺損傷，依達(dá)拉奉具有明顯的抗凋亡作用，且高劑量霧化吸入效果較好。

綜上所述，依達(dá)拉奉對煙霧吸入性肺損傷模型大鼠具有一定的保護(hù)作用，可劑量依賴性地減少炎癥介質(zhì)和（或）細(xì)胞因子的產(chǎn)生及釋放、減輕過氧化損傷并抑制細(xì)胞凋亡，且霧化吸入較腹腔注射給藥的效果更明顯。但因條件所限，有關(guān)依達(dá)拉奉對于吸入性肺損傷在抗炎、抗氧化、抗凋亡等方面的具體作用機(jī)制及相互關(guān)聯(lián)尚未完全闡明;另外，臨床治療所需具體劑量、濃度及給藥方式的優(yōu)劣等還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] TAN A，SMAILES S，F(xiàn)RIEBEL T，et al. Smoke inhalation increases intensive care requirements and morbidity in paediatric burns[J]. Burns，2016，42（5）：1111-1115.

[ 2 ] YANG T，ZHANG J，SUN L，et al. Combined effects of a neutrophil elastase inhibitor （sivelestat sodium） and a free radical scavenger （edaravone） on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats[J]. Inflamm Res，2012，61（6）：563-569.

[ 3 ] 馮勝娟，賈赤宇，劉真，等.重度煙霧吸入性損傷發(fā)病機(jī)制及治療研究進(jìn)展[J].中華燒傷雜志，2016，32（2）：122- 125.

[ 4 ] LIN H，MA X，WANG BC，et al. Edaravone ameliorates compression-induced damage in rat nucleus pulposus cells[J]. Life Sci，2017. DOI：10.1016/j.lfs.2017.09.024.

[ 5 ] ZHANG Z，LUO Z，BI A，et al. Compound edaravone alleviates lipopolysaccharide （LPS）-induced acute lung injury in mice[J]. Eur J Pharmacol，2017. DOI：10.1016/j.ejphar.2017.05.047.

[ 6 ] UCHIYAMA M，TOJO K，YAZAWA T，et al. Edaravone prevents lung injury induced by hepatic ischemia-reperfusion[J]. J Surg Res，2015，194（2）：551-557.

[ 7 ] ZHENG J，CHEN X. Edaravone offers neuroprotection for acute diabetic stroke patients[J]. Ir J Med Sci，2016，185（4）：819-824.

[ 8 ] 肖長栓，劉群，張建明，等.依達(dá)拉奉對吸入性肺損傷大鼠肺保護(hù)作用的實驗研究[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，19（2）：101-103.

[ 9 ] KOIZUMI T，TANAKA H，SAKAKI S，et al. The therapeutic efficacy of edaravone in extensively burned rats[J]. Arch Surg，2006，141（10）：992-995.

[10] 王正冠，李芮冰，徐舒敏，等.葛根素聯(lián)合依達(dá)拉奉對煙霧所致吸入性肺損傷大鼠的治療作用[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2015，40（1）：66-70.

[11] 曹籍文，黃云麗，陳君.依達(dá)拉奉腹腔注射對大鼠缺血性腦損傷的治療作用及其機(jī)制探討[J].山東醫(yī)藥，2019，59（30）：8-12.

[12] 陳卓，山淇，李宏.依達(dá)拉奉對海水淹溺性大鼠急性肺損傷治療作用的影響[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2019，16（23）：16-20.

[13] 鄒鋒，郭乃良，馬國平，等.依達(dá)拉奉對大鼠小腸缺血-再灌注所致肺損傷的保護(hù)作用[J].臨床麻醉學(xué)雜志，2017，33（4）：374-376.

[14] SUN GZ，GAO FF，ZHAO ZM，et al. Endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in the penumbra aggravates secondary damage in rats with traumatic brain injury[J]. Neural Regen Res，2016，11（8）：1260-1266.

[15] 林思寧，李建民，劉俊杰，等.依達(dá)拉奉對大鼠顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元凋亡的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2018，53（5）：676-679.

[16] 付忠華，江政英，孫威，等.霧化吸入重組人角質(zhì)細(xì)胞生長因子2 對重度煙霧吸入性損傷兔肺組織的作用[J].中華燒傷雜志，2018，34（7）：466-475.

[17] STROMPS JP，F(xiàn)UEHS P，DEMIR E，et al. Intraalveolar TNF-α in combined burn and inhalation injury compared with intra alveolar interleukin-6[J]. J Burn Care Res，2015，36（2）：e55-e61.

[18] 王大為，劉琪，陳興，等.富氫生理鹽水對煙霧吸入所致大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用[J].山東醫(yī)藥，2014，54（2）：20-22.

[19] SAWADA H. Clinical efficacy of edaravone for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis[J]. Expert Opin Pharmacother，2017，18（7）：735-738.

[20] FANG Y，F(xiàn)U XJ，GU C，et al. Hydrogen-rich saline protects against acute lung injury induced by extensive burn in rat model[J]. J Burn Care Res，2017，32（3）：82-89.

[21] QIN T，LEI LY，LI N，et al. Edaravone improves survival and neurological outcomes after CPR in a ventricular fibrillation model of rats [J]. Am J Emerg Med，2016，34（10）：1944-1949.

[22] 李開智，楊森林，姜暉，等.依達(dá)拉奉對心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用及機(jī)制研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2020，30（1）：13-20.

[23] GUO Y，YOU Y，LV D，et al. Inducible nitric oxide synthase contributes to insulin resistance and cardiac dysfunction after burn injury in mice[J]. Life Sci，2019. DOI：10. 1016/j.lfs.2019.116912.

[24] 曹麗萍，溫彥芳，曹昌魁，等.血必凈對百草枯中毒大鼠肺組織Caspase-3 表達(dá)及血漿炎癥因子的影響[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2018，27（10）：1121-1125.

[25] JEDDI S，ZAMAN J，ZADEH-VAKILI A，et al. Involvement of inducible nitric oxide synthase in the loss of cardioprotection by ischemic postconditioning in hypothyroid rats[J]. Gene，2016，580（2）：169-176.

[26] 劉月英，郭憲民，李波，等.依達(dá)拉奉對急性肺損傷大鼠肺組織凋亡的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2017，34（37）：4482-4484.

（收稿日期：2020-07-16 修回日期：2020-11-03）

（編輯：張元媛）