雷公藤紅素對(duì)蛋氨酸-膽堿缺乏飲食致小鼠NASH的干預(yù)作用及機(jī)制研究

饒輝 盛磊 吳丹妮 吳勇 胡俊杰 鄭國(guó)華 王桂紅

摘 要 目的：研究雷公藤紅素對(duì)蛋氨酸-膽堿缺乏（MCD）飲食致小鼠非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的干預(yù)作用及可能機(jī)制。方法：將雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和雷公藤紅素低、高劑量組[0.5、1 mg/（kg·d）]，每組7只。正常對(duì)照組小鼠給予蛋氨酸-膽堿充足飲食，模型組和給藥組小鼠給予MCD飲食以復(fù)制NASH模型;與此同時(shí)，正常對(duì)照組和模型組小鼠灌胃聚氧乙烯蓖麻油，各藥物組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，灌胃體積均為0.1 mL/g，每日1次，連續(xù)4周。觀察各組小鼠肝臟形態(tài)，并采用蘇木精-伊紅染色和油紅O染色法觀察其肝組織的病理學(xué)變化;采用酶法檢測(cè)血清肝酶[天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶]、血清和肝組織中脂質(zhì)指標(biāo)[總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）]水平;采用Western blotting法檢測(cè)小鼠肝組織中核因子κB p65（NF-κB p65）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟體積縮小且顏色泛黃，表面粗糙，肝組織中可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及脂肪空泡、脂滴聚集;其血清TC、TG水平均顯著降低，血清肝酶水平以及肝組織中TG水平和NF-κB p65、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，各藥物組小鼠肝臟表面紅潤(rùn)光滑，無(wú)褐色斑點(diǎn)，肝組織中炎性細(xì)胞、脂肪空泡有所減少，脂滴覆蓋面積有所縮小;其血清TC、TG水平均顯著升高，血清肝酶水平以及肝組織中TG水平和NF-κB、TNF-α、IL-6（雷公藤紅素低劑量組除外）的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：雷公藤紅素能改善MCD飲食致NASH模型小鼠的肝損傷，其作用與減少肝組織中TG堆積、抑制炎癥相關(guān)因子表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 雷公藤紅素;蛋氨酸-膽堿缺乏飲食;非酒精性脂肪性肝炎;機(jī)制;小鼠

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the intervention effects and potential mechanism of celastrol on non-alcoholic steatohepatitis （NASH） induced by methionine-choline deficiency （MCD） diet. METHODS： Male C57BL/6J mice were randomly divided into normal control group， model group， celastrol low-dose and high-dose groups [0.5， 1 mg/（kg·d）]， with 7 mice in each group. The normal control group was given a methionine-choline sufficient diet， while the model group and administration groups were fed an MCD diet to induce NASH model. At the same time， normal control group and model group were given polyoxyethylene castor oil intragastrically; administration groups were given relevant drugs intragastrically; the volume of gavage was 0.1 mL/g， once a day， for consecutive 4 weeks. The liver morphology was observed， and the pathological changes of liver tissue were observed by HE staining and oil red O staining. The levels of serum liver enzymes （AST， ALT）， and the levels of lipid indexes （TC， TG） in serum and liver tissue were detected by enzyme method. The protein expression of NF-κB p65， TNF-α and IL-6 in liver tissue were determined by Western blotting assay. RESULTS： Compared with normal control group， the volume of the liver was reduced and the color was yellow， and the surface was rough in model group; inflammatory cell infiltration， fat vacuoles and lipid droplets aggregation were found in the liver tissue; the serum levels of TC and TG were significantly decreased， the levels of serum liver enzymes and protein expression of NF-κB p65， TNF-α and IL-6 in liver tissue were significantly increased （P<0.01）. Compared with model group， the liver surface of each administration group was ruddy and smooth without brown spots， the inflammatory cells and fat vacuoles in liver tissue were reduced， and the coverage area of lipid droplets was reduced; the levels of serum TC and TG were significantly increased， the levels of serum liver enzymes， the levels of TG and protein expression of NF-κB， TNF-α and IL-6 （except for celastrol low-dose group） in liver tissue were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Celastrol can improve the liver injury of NASH model mice induced by MCD diet， which is related to the reduction of TG accumulation in liver tissue and inhibition of the expression of inflammatory related factors.

KEYWORDS ? Celastrol; Methionine-choline deficiency diet; Non-alcoholic steatohepatitis; Mechanims; Mice

非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver di- sease，NAFLD）是指排除過量飲酒等明確肝損傷因素，以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為特征的臨床病理綜合征[1]，其疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和脂肪性肝硬化。其中，NASH是NAFL發(fā)展為脂肪性肝硬化的重要過渡階段[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約30%～40%的NASH患者合并有肝臟纖維化，10%～15%的NASH患者可發(fā)展為肝硬化，而約9%～26%的NASH合并肝硬化的患者在隨訪的4～10年內(nèi)死亡;此外，NASH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，嚴(yán)重情況下可發(fā)展為肝癌[3-4]。目前，NASH的防治重點(diǎn)為控制飲食和加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)[5]，臨床尚無(wú)療效確切的防治藥物，現(xiàn)有藥物大多只能發(fā)揮輔助作用，且臨床應(yīng)用有所局限[1]。因此，如何有效防治NASH已成為廣受關(guān)注的肝病醫(yī)學(xué)難題[6-7]。

雷公藤紅素（Celastrol）是來(lái)源于衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. f.的一種醌甲基三萜類化合物，具有抗炎、抑制免疫、抗腫瘤等藥理作用[8]。近年來(lái)，馮澤民等[9]研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成及氧化反應(yīng)來(lái)降低HepG2細(xì)胞中三酰甘油（TG）的水平;在進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素能通過調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝來(lái)改善高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的NAFLD[10]。因此，綜合其抗炎和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用，筆者推測(cè)該化合物對(duì)NASH（即NAFLD較為嚴(yán)重的階段）具有一定的防治作用;同時(shí)，在常用的蛋氨酸-膽堿缺乏（MCD）飲食誘導(dǎo)的NASH動(dòng)物模型中，有關(guān)雷公藤紅素的治療作用及其機(jī)制也未見相關(guān)報(bào)道?；诖?，本研究通過MCD誘導(dǎo)構(gòu)建NASH小鼠模型，考察預(yù)防性使用雷公藤紅素對(duì)小鼠相關(guān)指標(biāo)的影響及可能機(jī)制，以期為該化合物防治NASH提供理論依據(jù)，促進(jìn)其資源的進(jìn)一步開發(fā)和利用。

1 材料

1.1 儀器

VCX750型超聲波破碎儀（美國(guó)Sonics公司）;CKX31型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;Trans-Blot TurboTM型全能型蛋白轉(zhuǎn)膜儀、Power Pac Basic型電泳儀、xMark型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;Allegra 64R型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）;XB220A型分析天平（瑞士Precisa公司）;GBOX型成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Syngene公司）;Vortex-Genie2型漩渦混合器（美國(guó)Scientific Industries公司）。

1.2 藥品與試劑

雷公藤紅素原料藥（成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)：PS161108-01，純度：>98%）;聚氧乙烯蓖麻油（上海阿拉丁生化科技有限公司，批號(hào)：C107105）;0.9%氯化鈉注射液（河南科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)：C16091602-1，規(guī)格：500 mL ∶ 4.5 g;作生理鹽水用）;鼠源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)：HRP-60004）;鼠源核因子κB p65（NF-κB p65）單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（美國(guó)CST公司，批號(hào)分別為6959、7074）;兔源腫瘤壞死因子α（TNF-α）多克隆抗體、兔源白細(xì)胞介素6（IL-6）多克隆抗體、通用型組織固定液（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)分別為GB13188-1、GB11117、G1101）;總膽固醇（TC）、TG、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為A111-1-1、A110-1-1、C010-2、C009-2）;BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏化學(xué)發(fā)光液、M-PERTM哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)分別為23227、34580、78501）;蛋白酶抑制劑（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)：40417）;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒（美國(guó)EpiZyme Scientific公司，批號(hào)：18D250）;四甲基乙二胺（TEMED，美國(guó)Amresco公司，批號(hào)：110-18-9）;蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、油紅O染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為G1121、G1260）;其余試劑為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為去離子水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)野生型C57BL/6J小鼠，雄性，6周齡，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018。蛋氨酸-膽堿充足（MCS）和MCD飲食均由江蘇南通特洛菲飼料科技有限公司提供。所有小鼠均飼養(yǎng)于SPF屏障環(huán)境中。本研究操作均符合湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的相關(guān)規(guī)定。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將28只小鼠隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組、模型組和雷公藤紅素低、高劑量組，每組7只。對(duì)照組小鼠給予MCS飲食，其余各組小鼠給予MCD飲食以復(fù)制NASH模型;與此同時(shí)，雷公藤紅素低、高劑量組小鼠按0.5、1 mg/（kg·d）（以聚氧乙烯蓖麻油為溶劑，劑量設(shè)置參考本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果）灌胃相應(yīng)藥物，正常對(duì)照組和模型組小鼠均灌胃聚氧乙烯蓖麻油。灌胃體積均為0.1 mL/g，每日1次，連續(xù)4周。

2.2 樣本采集

末次給藥后，各組小鼠均禁食、不禁水12 h，摘取一側(cè)眼球取血。血樣于冰浴中靜置0.5 h后以2 000 r/min離心5 min，分離血清，備用。取血后頸部脫臼處死小鼠，剝離完整的肝臟，用生理鹽水洗凈后，觀察并記錄肝臟的外觀形態(tài)。隨機(jī)選取肝組織適量，置于組織固定液中固定，剩余肝組織置于-80 ℃冰箱保存，備用。

2.3 肝組織病理學(xué)觀察

取固定于組織固定液中的肝組織適量，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后切片（厚度約4 μm），分別用HE、油紅O染色后，置于顯微鏡下觀察其病理學(xué)變化。

2.4 血清和肝組織生化指標(biāo)檢測(cè)

取血清樣品和凍存的肝組織樣品各適量，按照試劑盒方法（酶法）以酶標(biāo)儀檢測(cè)各組小鼠血清中AST、ALT水平以及血清和肝組織中TC、TG水平，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。

2.5 肝組織中NF-κB p65、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)

采用Western blotting法檢測(cè)。取凍存的肝組織適量，加入適量蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，超聲（頻率：20 kHz，功率：750 W）10 s破碎，冰浴裂解0.5 h，以1 000 r/min離心8 min，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白含量。取蛋白于95 ℃加熱變性5 min，取變性后的蛋白樣品120 μg行SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h;分別加入NF-κB p65、TNF-α、IL-6一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于 4℃孵育過夜;用TBST溶液清洗8 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 3 000）和GAPDH抗體（稀釋度為1 ∶ 8 000），室溫孵育1 h;用TBST溶液清洗8 min×3次，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光液顯色后，于成像分析系統(tǒng)上成像并使用Image J 1.8.0軟件分析。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參（GAPDH）條帶的灰度值比值作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。上述操作重復(fù)3～5次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 雷公藤紅素對(duì)小鼠肝臟形態(tài)及肝組織病理學(xué)變化的影響

正常對(duì)照組小鼠肝臟表面光滑，鮮紅，有光澤;HE染色顯示，肝細(xì)胞排列整齊且形態(tài)正常;油紅O染色未見脂滴聚集。模型組小鼠肝臟體積明顯縮小，表面粗糙，顏色泛黃，無(wú)光澤，綴有褐色斑點(diǎn);HE染色顯示，其肝組織中可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)可見許多大的脂肪空泡聚集，脂肪化嚴(yán)重;油紅O染色顯示，其肝組織中有大量脂滴聚集。與模型組比較，經(jīng)雷公藤紅素預(yù)處理后，各藥物組小鼠肝臟表面光滑、紅潤(rùn)，無(wú)褐色斑點(diǎn);HE染色顯示，其肝組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和脂肪空泡均有所減少或縮小;油紅O染色顯示，其肝組織中脂滴覆蓋面積有所縮小，詳見圖1。

3.2 雷公藤紅素對(duì)小鼠血清AST、ALT水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中AST、ALT水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各藥物組小鼠血清中AST、ALT水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.3 雷公藤紅素對(duì)小鼠血清和肝組織中TC、TG水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中TC、TG水平均顯著降低（P<0.01），肝組織中TG水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各藥物組小鼠血清中TC、TG水平均顯著升高，肝組織中TG水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且其血清TC、TG水平和肝組織TG水平分別有隨劑量增加而升高或降低的趨勢(shì)，詳見表2。

3.4 雷公藤紅素對(duì)小鼠肝組織中NF-κB p65、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織中NF-κB p65、TNF-α、IL-6的蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，各藥物組小鼠肝組織中NF-κB p65、TNF-α的蛋白表達(dá)水平以及雷公藤紅素高劑量組小鼠肝組織中IL-6的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、表3。

4 討論

NAFLD是一種常見的慢性肝臟疾病，大約有1/3的單純脂肪變性的NAFLD患者會(huì)發(fā)生NASH[11]。目前，NASH的造模方法各異，不同的動(dòng)物模型中NASH的發(fā)病機(jī)制略有不同，生理病理特征也相差甚遠(yuǎn)，但都能模仿NASH患者部分顯著性生理或病理學(xué)改變[12]。本研究采用了MCD飲食方法來(lái)建立小鼠NASH模型，此法誘發(fā)的病理改變與人類NASH相似[4]。與其余飲食模型相比，MCD模型更能模仿人類嚴(yán)重NASH的病理學(xué)改變，且造模2～3周即可形成NASH[11]。關(guān)于MCD飲食模型的“二次打擊學(xué)說”認(rèn)為，蛋氨酸和膽堿的缺乏會(huì)導(dǎo)致極低密度脂蛋白（VLDL）的合成和分泌受損，而VLDL是將肝細(xì)胞內(nèi)TG運(yùn)出的主要載體物質(zhì)，因此使得TG滯留在肝細(xì)胞中沉積，構(gòu)成了“第一次打擊”，從而誘發(fā)肝脂肪變性[13];與此同時(shí)，蛋氨酸和膽堿的缺乏也會(huì)導(dǎo)致肝內(nèi)抗氧化屏障受損，促使脂質(zhì)過氧化發(fā)生，從而加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步使肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，構(gòu)成了“第二次打擊”[14-15]。許多研究表明，NF-κB炎癥信號(hào)通路在NASH的發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，其激活也加速了脂肪肝向NASH的轉(zhuǎn)變[16-19]。本研究在小鼠體內(nèi)成功復(fù)制了NASH模型，HE、紅油O染色均顯示，模型組小鼠肝臟體積明顯縮小，表面粗糙且顏色泛黃，肝組織中可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和脂肪堆積。與此同時(shí)，模型組小鼠肝組織中TG水平的顯著升高提示其肝細(xì)胞內(nèi)TG的聚集，炎癥因子NF-κB p65、TNF-α、IL-6的高表達(dá)提示NF-κB炎癥信號(hào)通路的激活，血清中高水平的AST、ALT反映了較為嚴(yán)重的肝損傷。但本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血清中TC、TG水平均有所下降，與人類NAFLD代謝表型不符，這也提示MCD飲食模型存在一定的缺陷。

雷公藤紅素作為中藥雷公藤的活性成分，由于其突出的抗腫瘤和抗炎作用成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[20]。有研究表明，雷公藤紅素能通過影響脂代謝和NF-κB炎癥信號(hào)通路來(lái)防治蛋白激酶B（Akt）/肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體c-Met共表達(dá)誘導(dǎo)的小鼠肝細(xì)胞癌（HCC），而NASH是HCC的重要誘發(fā)因素之一[21-22]，據(jù)此筆者推測(cè)雷公藤紅素可能具有防治NASH的作用。基于此，本研究以MCD飲食小鼠為研究對(duì)象，初步考察了雷公藤紅素對(duì)NASH相關(guān)指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示，與模型組比較，雷公藤紅素各劑量組小鼠肝臟表面光滑、紅潤(rùn)，肝組織內(nèi)脂肪泡面積縮小，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和脂質(zhì)聚集均有所減少;與模型組比較，雷公藤紅素各劑量組小鼠血清中TC、TG水平均顯著升高，血清中AST、ALT水平和肝組織中TG水平均顯著降低，肝組織中炎癥因子NF-κB p65、TNF-α、IL-6（低劑量組除外）的蛋白表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào)。這提示雷公藤紅素能改善肝細(xì)胞內(nèi)TG堆積，抑制炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-6的表達(dá)，減輕肝損傷。

綜上所述，雷公藤紅素能改善MCD飲食致NASH模型小鼠的肝損傷，其作用與減少肝組織中TG堆積、抑制炎癥相關(guān)因子表達(dá)有關(guān)。本研究為該化合物防治NASH提供了理論依據(jù)。由于目前尚無(wú)療效確切的藥物用于防治NASH[1]，故暫未找到兼具抗炎、降脂作用的單一藥物作為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)綜合比較雷公藤紅素的效果;此外，后續(xù)亦有待對(duì)該化合物防治NASH的具體分子機(jī)制進(jìn)行更為深入的探討。

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（收稿日期：2020-05-27 修回日期：2020-08-31）

（編輯：張?jiān)拢?/p>