蛞蝓提取物對環(huán)磷酰胺治療肝癌的增效減毒作用

黃天敏 楊映霞 張宏亮 陳俐秀 黃湘 謝金魁 黃仁彬 楊玉芳

摘 要 目的：探討蛞蝓提取物（LE）對環(huán)磷酰胺（CTX）治療肝癌的增效減毒作用。方法：將小鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，CTX組（0.02 g/kg），LE低、中、高劑量組（即LEL、LEM、LEH組，0.6、1.2、2.4 g/kg），CTX+LE低、中、高劑量聯(lián)用組（即CTX+LEL、CTX+LEM、CTX+LEH組，劑量同各單藥組），每組10只。除正常組外，其余各組小鼠均于左腋下接種小鼠肝癌細(xì)胞H22以復(fù)制荷瘤模型。接種24 h后，正常組和模型組小鼠灌胃生理鹽水，各給藥組小鼠分別灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)10 d。末次給藥后第2天，觀察各組小鼠一般情況，測定體質(zhì)量和胸腺指數(shù)（LI）、脾指數(shù)（SI），檢測抑瘤率，并采用金氏公式評估聯(lián)合用藥的效果（q）;檢測模型組、CTX組和各聯(lián)用組小鼠的白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血小板（PLT）計數(shù)以及血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）含量，并采用比色法和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法分別檢測上述各組小鼠腫瘤組織中丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）活性以及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）水平;采用免疫組化法檢測模型組、CTX組和CTX+LEM組小鼠腫瘤組織中癌基因蛋白（p53、Bcl-2、Bax）的表達(dá)水平。結(jié)果：模型組小鼠精神不佳，且出現(xiàn)多飲、多食癥狀;其體質(zhì)量、TI、SI雖較正常組無明顯異常（P>0.05），但其WBC計數(shù)、AST含量均顯著升高，ALT、BUN含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，各給藥組小鼠上述癥狀有所改善;各給藥組的瘤體質(zhì)量，CTX組的TI、SI以及各聯(lián)用組的TI均顯著降低，但LEL組、LEH組的瘤體質(zhì)量，LE單用組及各聯(lián)用組的TI、SI均顯著高于CTX組，各聯(lián)用組的瘤體質(zhì)量均顯著低于CTX組（P<0.05或P<0.01）;各給藥組的抑瘤率為29.58%～72.08%，CTX+LEL組、CTX+LEM組、CTX+LEH組的q值分別為1.03、0.97、0.86。與模型組比較，CTX組小鼠的WBC計數(shù)和AST、BUN含量，各聯(lián)用組的MDA含量，各給藥組的VEGF、TNF-α、IL-6水平以及CTX組和CTX+LEM組的Bcl-2表達(dá)水平均顯著降低，各給藥組的SOD、GSH活性以及CTX+LEM組的p53表達(dá)水平，CTX組和CTX+LEM組的Bax表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;但各聯(lián)用藥組的WBC計數(shù)和AST含量以及CTX+LEM組的ALT含量，CTX+LEH組的SOD活性和CTX+LEM組的GSH活性均顯著高于CTX組，CTX+LEH組的MDA含量，CTX+LEM組、CTX+LEH組的VEGF、TNF-α水平和各聯(lián)用組的IL-6水平均顯著低于CTX組（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：LE和CTX聯(lián)用具有相加的抑瘤作用，且LE可減少CTX致小鼠免疫功能減退、骨髓抑制等毒性反應(yīng)，具增效減毒的作用。這種作用可能與抗氧化應(yīng)激、抑制血管生成和炎癥因子分泌以及調(diào)控凋亡蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 蛞蝓提取物;肝癌;抗氧化應(yīng)激;血管生成;細(xì)胞凋亡;增效減毒;小鼠

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To investigate the effect of increasing efficacy and decreasing toxicity of Limax extract （LE） on cyclophosphamide （CTX） in the treatment of hepatocellular carcinoma. METHODS： The mice were randomly divided into normal group， model group， CTX group （0.02 g/kg）， LE low-dose， medium-dose and high-dose groups （LEL， LEM， LEH group， 0.6， 1.2， 2.4 g/kg）， CTX+LE low-dose， medium-dose and high-dose combination groups （CTX+LEL， CTX+LEM， CTX+LEH group， the same dose as single drug group）， with 10 mice in each group. Except for normal group， other groups were inoculated with hepatoma cells H22 in the left armpit to establish tumor bearing models. After 24 h of inoculation， normal group and model group were intragastrically given normal saline， and administration groups were intragastrically given corresponding drugs， once a day， for 10 days. On the second day after the last administration， the general conditions of mice in each group were observed; the body mass， thymus index （LI）， spleen index （SI） were measured; the tumor inhibition rate was detected. The effect （q） of combination therapy was evaluated by Kings formula. The counts of WBC， RBC and PLT， serum contents of ALT， ALT， Scr and BUN were detected in model group， CTX group and combination groups， and the contents of MDA， SOD and GSH， the levels of VEGF， TNF-α and IL-6 in the tumor tissue were detected by colorimetry and ELISA in above groups. The protein expression of oncogenes （p53， Bcl-2 and Bax） were detected by immunohistochemical method in model group， CTX group and CTX+LEM group. RESULTS： The mice in the model group were in poor spirit and had symptoms of excessive drinking and eating; although the body weight， TI and SI were not significantly abnormal compared with normal group （P>0.05）， WBC count and AST content were significantly increased， ALT and BUN contents were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， above symptoms of mice were all improved in administration groups. The tumor weight of administration groups， TI and SI of CTX group and TI of combination groups were decreased significantly， but tumor weight of LEL group and LEH group， TI and SI of LE single groups and combination groups were significantly higher than CTX group; tumor weight of combination groups were significantly lower than CTX group （P<0.05 or P<0.01）. The tumor inhibition rates of administration groups were 29.58%-72.08%. The q values of CTX+LEL group， CTX+LEM group and CTX+LEH group were 1.03， 0.97 and 0.86， respectively. Compared with model group， WBC count， AST and BUN contents of CTX group， MDA contents of combination groups， VEGF， TNF-α and IL-6 levels of administration groups， the protein expression of Bcl-2 in CTX group and CTX+LEM group were decreased significantly; the activities of SOD and GSH of administration groups， the protein expression of p53 in CTX+LEM group and Bax in CTX group， CTX+LEM group were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）; WBC counts and AST contents of administration groups， ALT content of CTX+LEM group， SOD activity of CTX+LEH group and GSH activity of CTX+LEM group were all significantly higher than those of CTX group; MDA content of CTX+LEH group， VEGF and TNF-α levels of CTX+LEM group and CTX+LEH group， IL-6 levels of administration groups were all significantly lower than CTX group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： LE combined with CTX can increase the anti-tumor effect， and LE can reduce the toxicity of CTX induced immunosuppression and bone marrow suppression in mice， with effect of increasing efficacy and decreasing toxicity. The effect may be related to antioxidant stress， inhibition of angiogenesis and secretion of inflammatory factors， and regulation of apoptosis protein expression.

KEYWORDS ? Limax extract; Hepatocellular carcinoma; Antioxidant stress; Angiogenesis; Cell apoptosis; Increasing efficacy and decreasing toxicity; Mice

肝癌（Hepatocellular carcinoma）是目前我國排第4位的常見惡性腫瘤及致死病因排第3位的腫瘤。每年新發(fā)病例超全球腫瘤新發(fā)病例總數(shù)的一半，嚴(yán)重危害人們的生命健康[1-2]。肝癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其病因尚未完全闡明;加之現(xiàn)有化療藥物的安全性欠佳，可能導(dǎo)致患者機(jī)體免疫功能下降而使得治療效果受到影響[3]。由此可見，肝癌的臨床治療仍然面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，故尋找有效、安全的肝癌治療藥物備受學(xué)者關(guān)注。

蛞蝓Agriolimax agrestis L.屬軟體動物門腹足綱柄眼目蛞蝓科，因其形似蝸牛卻無殼，渾身黏液，故俗稱為“鼻涕蟲”。研究表明，蛞蝓蟲體中含有多糖類和蛋白類活性成分，其活性提取物對肺腺癌細(xì)胞A549、肉瘤細(xì)胞S180、宮頸癌細(xì)胞HeLa等均具有較好的體內(nèi)外抑制作用，且毒性較低[4-5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蛞蝓提取物（Limax extract，LE）可抑制肝癌細(xì)胞H22的生長，具有一定的開發(fā)價值。

化療是目前臨床治療腫瘤的主要手段，環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）是應(yīng)用最廣泛的傳統(tǒng)化療藥物之一，但CTX可通過血液循環(huán)激活其自身代謝產(chǎn)物丙烯醛，從而對機(jī)體正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，如骨髓抑制和免疫抑制等，治療效果有限[3]。研究表明，中藥聯(lián)合化療藥物可提高抗腫瘤療效和/或減少副作用[3，6]。同時，有研究報道LE聯(lián)合化療藥物在體外對肝癌細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用[7]。為進(jìn)一步探索LE的體內(nèi)抗肝癌作用，本研究通過建立H22荷瘤小鼠模型，研究LE對CTX治療肝癌的增效減毒作用，旨在為臨床抗肝癌聯(lián)合藥物方案的選擇提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Spectra Max Plus 384型酶標(biāo)儀（香港分子儀器有限公司）;TU-180型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;7100型全自動生化分析儀（日本Hitachi公司）;XT-2000I型血細(xì)胞分析儀（日本Sysmex公司）;EG1150型病理組織包埋機(jī)（上海萊卡儀器有限公司）;FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司）;H1850R型臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）;ZNY-686型多功能提取濃縮機(jī)（青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司）;MS1型渦旋混勻器（廣州儀科技術(shù)有限公司）;HH-4型數(shù)字恒溫水浴箱（常州國華電器有限公司）;ML304T型萬分之一電子天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

蛞蝓購自廣西壯族自治區(qū)百色市靈山縣農(nóng)貿(mào)市場，經(jīng)由廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥理學(xué)教研室黃仁彬教授鑒定為腹足綱柄眼目蛞蝓科動物蛞蝓A. agrestis L. 的冰鮮蟲體，于-20 ℃凍存，備用。

注射用環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，批號：17011325，規(guī)格：0.2 g）;丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）檢測試劑盒，總蛋白定量試劑盒以及還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：C009-2、C010-2、C011-2、C013-2、20171130、20171125、20171129、20180113）;鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號：1711041）;Triton X-114試劑（北京索萊寶科技有限公司，批號：T8210）;血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號均為E20171201A）;兔抗人p53、Bcl-2、Bax單克隆抗體（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號：170705142C、170705100C、170705023D）;PV6001兔二步法檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）;磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）、Mayors蘇木精染液（武漢博士德生物工程有限公司）;氯化鈉注射液（中國大冢制藥有限公司，批號：OB79B3，規(guī)格：10 mL ∶ 0.09 g;作生理鹽水用）;甲醛、二甲苯、乙醇等試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

小鼠肝癌H22瘤株由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室提供。

1.4 動物

SPF級昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2） g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK桂2014-0003。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)，研究方案符合我國動物實(shí)驗(yàn)倫理相關(guān)指導(dǎo)原則[8]的要求。

2 方法

2.1 LE的制備

將凍存的蛞蝓于室溫下解凍1.5 h后，加入2倍量（mL/g）水，混合，勻漿。勻漿后，以2 000 r/min離心10 min，收集上清液。殘渣按上述步驟重復(fù)提取1次，合并上清液。經(jīng)鱟試劑檢測內(nèi)毒素后，加入Triton X-114試劑適量以去除內(nèi)毒素，以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液并將其置于-20 ℃冷凍過夜，再于-45 ℃冷凍干燥，得凍干粉。將上述凍干粉研磨，過20目篩，即得LE（每克蟲體可得LE凍干粉0.138 25 g），于室溫下密封保存，備用。

2.2 造模

將小鼠肝癌H22瘤株復(fù)蘇，按文獻(xiàn)方法[9]接種于小鼠腹腔，體內(nèi)傳代至第4代。抽取上述第4代接種肝癌H22瘤株小鼠第7天時的腹水，用生理鹽水稀釋，制成密度為2×107個/mL的腫瘤細(xì)胞懸液。于小鼠左腋皮下迅速單次接種該細(xì)胞懸液0.2 mL，并以接種后小鼠左腋下出現(xiàn)肉眼可見的瘤組織（大約于注射后6 d時）為造模成功。

2.3 分組與給藥

將小鼠隨機(jī)分為9個組，即正常組，模型組，CTX組（0.02 g/kg，以生理鹽水制成相應(yīng)藥液，劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)方法[10]），LE低、中、高劑量聯(lián)用組（即LEL、LEM、LEH組，0.6、1.2、2.4 g/kg，以提取物質(zhì)量計;以生理鹽水制成相應(yīng)藥液，劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)方法[10]），CTX+LE低、中、高劑量聯(lián)用組（即CTX+LEL、CTX+LEM、CTX+LEH組，劑量及其設(shè)置依據(jù)同各單藥組），每組10只。除正常組小鼠接種等體積生理鹽水外，其余組小鼠均按“2.2”項(xiàng)下方法接種腫瘤細(xì)胞懸液以復(fù)制荷瘤模型。接種24 h后，正常組和模型組小鼠均灌胃生理鹽水（0.2 mL/10 g），各給藥組小鼠分別腹腔注射CTX或/和灌胃LE（腹腔注射和灌胃體積均為0.2 mL/10 g，各聯(lián)用組總給藥體積為0.4 mL/10 g），每日1次，連續(xù)10 d。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 抑瘤作用指標(biāo) 末次給藥后第2天，觀察小鼠一般情況，稱取其體質(zhì)量并于眼球取血適量后，將其處死，剝脫瘤塊，稱取瘤體質(zhì)量并計算抑瘤率：抑瘤率（%）=（C-T）/C×100%（式中，C為模型組小鼠的平均瘤體質(zhì)量，T為各給藥小鼠的平均瘤體質(zhì)量）。采用金氏公式[11]來評估聯(lián)合用藥的效果（q）：q=EAB/[EA+（1-EA）EB]（式中，EA是A藥的抑瘤率，EB是B藥的抑瘤率，EAB是A、B兩藥聯(lián)合使用時的抑瘤率）。當(dāng)q為0.85～1.15時，表示兩藥作用相加;當(dāng)q>1.15時，表示兩藥作用協(xié)同;當(dāng)q<0.85時，表示兩藥作用拮抗[11]。剖取小鼠胸腺和脾臟，稱其質(zhì)量，計算胸腺指數(shù)（TI）、脾指數(shù)（SI）：TI或SI（mg/10 g）=胸腺或脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

2.4.2 肝、腎功能和骨髓抑制指標(biāo) 對聯(lián)合用藥與單用CTX的治療作用進(jìn)行比較。取正常組、模型組、CTX組和CTX+LEL、CTX+LEM、CTX+LEH組小鼠的血樣適量，使用血細(xì)胞計數(shù)儀檢測其白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血小板（PLT）計數(shù);另取血樣適量，分離血清后，使用全自動生化分析儀檢測小鼠血清中ALT、AST、Scr、BUN的含量，嚴(yán)格按相應(yīng)試劑盒說明書方法操作。

2.4.3 腫瘤組織中MDA含量和SOD、GSH活性 對聯(lián)合用藥與單用CTX的治療作用進(jìn)行比較。取模型組、CTX組和CTX+LEL、CTX+LEM、CTX+LEH組小鼠的腫瘤組織適量，置于冰盤上，用4 ℃生理鹽水清洗，用濾紙吸干后，用生理鹽水于冰浴上制成10%的組織勻漿，于4 ℃下以3 500～4 000 r/min離心10 min。取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，采用比色法以全自動生化分析儀測定MDA含量和SOD、GSH活性，嚴(yán)格按相應(yīng)試劑盒說明書方法操作。

2.4.4 腫瘤組織中VEGF、TNF-α、IL-6水平 對聯(lián)合用藥與單用CTX的治療作用進(jìn)行比較。取模型組、CTX組和CTX+LEL、CTX+LEM、CTX+LEH組小鼠的腫瘤組織適量，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備腫瘤組織勻漿，以 ? ? 3 000 r/min離心10 min。取上清液，采用ELISA法以酶標(biāo)儀檢測VEGF、TNF-α、IL-6水平，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書方法操作。

2.4.5 腫瘤組織中癌基因蛋白的表達(dá) 采用免疫組化法對抑瘤率最高的聯(lián)合用藥組與單用CTX的治療作用進(jìn)行比較。取模型組、CTX組和CTX+LEM組小鼠腫瘤組織適量，行常規(guī)切片（厚度約3 μm），脫蠟，經(jīng)乙醇梯度水化，用3%過氧化氫溶液孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;行抗原修復(fù)后，加入p53、Bcl-2、Bax一抗（稀釋度均為1 ∶ 50），4 ℃孵育過夜;PBS清洗3次，加入二步法檢測試劑50 μL，室溫孵育15 min;PBS清洗3次，以DAB試劑顯色;經(jīng)水洗、蘇木精復(fù)染、脫水、封片后，使用倒置顯微鏡觀察。p53、Bcl-2、Bax均定位于細(xì)胞核，故以細(xì)胞核中出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒者為陽性表達(dá)，不著色或著色淺而不顯著者為陰性。采用Image J 1.48軟件分析上述蛋白陽性表達(dá)的平均積分光密度（IOD）值，用以表示蛋白表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料均采用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 LE或CTX單用及兩者聯(lián)用對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用

模型組小鼠精神不佳，且伴有多飲、多食的癥狀，但體質(zhì)量、TI、SI與正常組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，各給藥組小鼠精神狀態(tài)良好，皮毛順，飲水量、進(jìn)食量正常，且各給藥組的小鼠瘤體質(zhì)量，CTX組的TI、SI以及各聯(lián)用組的TI均顯著降低;但LEL組、LEH組的瘤體質(zhì)量，各LE單用組及各聯(lián)用組的TI、SI均顯著高于CTX組，各聯(lián)用組的瘤體質(zhì)量均顯著低于CTX組（P<0.05或P<0.01）。各給藥組的抑瘤率為29.58%～72.08%，CTX+LEL組、CTX+LEM組、CTX+LEH組的q值分別為1.03、0.97、0.86，提示兩藥聯(lián)用時抑瘤作用相加，詳見表1。

3.2 LE與CTX聯(lián)用對H22荷瘤小鼠肝、腎功能和骨髓抑制的影響

與正常組比較，模型組小鼠的WBC計數(shù)、AST含量均顯著升高，ALT、BUN含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，CTX組小鼠的WBC計數(shù)和AST、BUN含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），而各聯(lián)用藥組小鼠上述各指標(biāo)均無顯著變化（P>0.05）;與CTX組比較，各聯(lián)用藥組小鼠的WBC計數(shù)和AST含量以及CTX+LEM組小鼠的ALT含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.3 LE與CTX聯(lián)用對H22荷瘤小鼠腫瘤組織中MDA含量和SOD、GSH活性的影響

與模型組比較，各聯(lián)用組小鼠腫瘤組織中的MDA含量均顯著降低，各給藥組的SOD、GSH活性均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與CTX組比較，CTX+LEH組的MDA含量顯著降低，CTX+LEH組的SOD活性和CTX+LEM組的GSH活性均顯著升高（P<0.05），詳見表3。

3.4 LE與CTX聯(lián)用對H22荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF、TNF-α、IL-6水平的影響

與模型組比較，各給藥組小鼠腫瘤組織中的VEGF、TNF-α、IL-6水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與CTX組比較，CTX+LEM組、CTX+LEH組的VEGF、TNF-α水平以及各聯(lián)用組的IL-6水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表4。

3.5 LE與CTX聯(lián)用對H22荷瘤小鼠腫瘤組織中p53、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

與模型組比較，CTX+LEM組小鼠腫瘤組織中p53和各給藥組Bax蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，各給藥組Bcl-2蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與CTX組比較，CTX+LEM組p53、Bax蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），詳見圖1、表5。

4 討論

腫瘤的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，治療方案的個體化差異大，傳統(tǒng)化療藥物往往無法取得滿意的療效，且其不良反應(yīng)更是讓部分患者難以耐受[12];隨著抗腫瘤中藥和化療藥物聯(lián)合治療在臨床上的應(yīng)用越來越多，研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥可增強(qiáng)化療藥物的療效并降低不良反應(yīng)、細(xì)胞耐藥的發(fā)生率[13]。因此，從中藥篩選出可以減少化療藥物的毒性作用、又可以增加抗腫瘤療效的藥物顯得十分重要。基于LE本身具備一定的抗腫瘤活性，同時毒性低、安全性高的特點(diǎn)[7]，本研究初步探索了其與CTX聯(lián)合用藥治療肝癌的效果。結(jié)果顯示，各給藥組小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長均受到不同程度的抑制，提示CTX或LE單用及兩者聯(lián)用均表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性;此外，當(dāng)CTX與不同劑量LE聯(lián)合用藥時，q值在0.85～1.15范圍內(nèi)，提示兩藥聯(lián)合的抑瘤作用相加。

胸腺和脾臟作為機(jī)體重要的中樞免疫器官，與機(jī)體免疫表達(dá)密切相關(guān);如果胸腺和脾臟功能受到不良影響，可能使免疫調(diào)節(jié)失衡，產(chǎn)生一系列免疫性疾病，故機(jī)體免疫功能的變化可由TI和SI反映[14]。與模型組比較，CTX組小鼠TI和SI均下降，不同劑量LE單用組TI未見明顯改變，不同劑量聯(lián)用組的TI下降，而其余各給藥組的SI均未見明顯變化;與CTX組比較，不同劑量聯(lián)用組小鼠的TI和SI均明顯升高。上述結(jié)果提示，LE可有效防止CTX治療肝癌小鼠時引起的免疫抑制，并維持和提高其免疫功能。此外，大多數(shù)的抗腫瘤藥物在起到治療作用的同時，通常伴有骨髓抑制的毒副作用，其中WBC、RBC、PLT與骨髓抑制密切相關(guān)[15]。本研究顯示，與模型組比較，CTX組小鼠的WBC計數(shù)明顯降低，但RBC計數(shù)和PLT計數(shù)未見明顯變化。這提示荷瘤小鼠出現(xiàn)骨髓抑制，但各指標(biāo)有所差異，可能與粒細(xì)胞在機(jī)體的生存周期較短、紅細(xì)胞和血小板的生存周期較長有關(guān)[16]。與CTX組比較，各劑量聯(lián)用組的WBC計數(shù)明顯改善，提示聯(lián)合用藥可以減少CTX治療時所產(chǎn)生的骨髓抑制毒性。此外，本研究結(jié)果還顯示，與模型組比較，CTX組小鼠血清中AST和BUN含量均顯著降低，但各聯(lián)用組小鼠的肝、腎功能指標(biāo)均無明顯變化，提示聯(lián)合用藥未增加化療藥物的肝、腎毒副作用。

氧化應(yīng)激與腫瘤的產(chǎn)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系，大量研究都涉及了氧化應(yīng)激引起的損傷及其參與細(xì)胞增殖、凋亡等過程[17-18]。MDA是脂類氧化最終產(chǎn)物，反映了機(jī)體氧化受損程度;SOD和GSH可清除氧自由基，減少或修復(fù)細(xì)胞損傷，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的功能[19]。本研究結(jié)果顯示，各聯(lián)用組小鼠腫瘤組織中MDA含量均較模型組顯著降低，且CTX+LEH組顯著低于CTX組;各給藥組的SOD、GSH活性均較模型組顯著升高，且CTX+LEH組的SOD活性、CTX+LEM組的GSH活性均顯著高于CTX組，提示CTX+LEM組和CTX+LEH組表現(xiàn)出更明顯的抗氧化應(yīng)激作用，說明聯(lián)合用藥可能通過加強(qiáng)抗氧化應(yīng)激作用來抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

VEGF、TNF-α、IL-6等血管生成因子在參與血管生成過程中起到關(guān)鍵作用，而肝癌作為血管依賴性惡性腫瘤，其生長和轉(zhuǎn)移與血管生成密切相關(guān)[20]。有研究指出，VEGF與其受體結(jié)合，可通過誘導(dǎo)正常內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和趨化來增加血管的通透性，從而促進(jìn)新生血管的形成和腫瘤細(xì)胞的生長[21]。炎癥與癌癥之間的功能關(guān)系已被廣泛研究，炎癥微環(huán)境被認(rèn)為在肝癌發(fā)展的不同階段都發(fā)揮著重要的作用[22-23]。有報道稱，作為炎性細(xì)胞因子的TNF-α和IL-6在肝癌組織中呈高表達(dá)，使用CTX治療肝癌可改變腫瘤生長的微環(huán)境，并有效地抑制炎癥的發(fā)生，從而減少TNF-α和IL-6的分泌，延緩或阻斷腫瘤的生長[24]。本研究結(jié)果顯示，各給藥組小鼠腫瘤組織中VEGF、TNF-α、IL-6水平均顯著降低，且CTX+LEM組、CTX+LEH組的VEGF、TNF-α水平以及各聯(lián)用組的IL-6水平均顯著低于CTX組，與上述文獻(xiàn)結(jié)果基本一致。這提示聯(lián)合用藥可以顯著地抑制VEGF、TNF-α、IL-6的分泌，其中CTX+LEM組、CTX+LEH組的抑制作用更強(qiáng)，表明CTX聯(lián)合LE治療可以增強(qiáng)CTX抑制血管生成因子分泌的作用。

腫瘤細(xì)胞凋亡在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，許多受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和眾多不同基因均參與了腫瘤細(xì)胞凋亡的激活，并分別調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡[25]。這些基因包括具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用的p53、Bax和具有抑制細(xì)胞凋亡作用的Bcl-2等。p53可上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡，改變線粒體的滲透性，從而影響下游促凋亡基因的功能[26]。本研究結(jié)果顯示，與模型組和CTX組相比，CTX+LEM組p53、Bax表達(dá)水平顯著升高而Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低，且CTX+LEM組p53、Bax蛋白的表達(dá)水平均顯著高于CTX組，而Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著低于CTX組，提示聯(lián)合用藥可能增強(qiáng)CTX促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，CTX聯(lián)合LE治療肝癌模型小鼠可以增加CTX的抗肝癌作用，這可能與聯(lián)合用藥具有更強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激、抑制血管生成和炎癥因子分泌以及調(diào)控凋亡蛋白表達(dá)有關(guān)，且聯(lián)合用藥毒性較小。本文結(jié)果可能為LE抗肝癌的作用機(jī)制提供新的思路，提示LE可能是一種潛在的治療肝癌的藥物，但尚需進(jìn)一步研究探討其具體作用機(jī)制。

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（收稿日期：2020-05-15 修回日期：2020-09-25）

（編輯：張元媛）