外來物種海虱在口岸檢疫中的篩查及鑒定技術(shù)

田城城，蘭文升，吳 江，溫智清，葉仕根，史衛(wèi)軍

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連 116023；2.深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心/深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院， 廣東深圳 518010)

海虱是一種以許多海洋魚類為宿主的體外寄生蟲，分類上屬于橈足亞綱(Copepoda)，魚虱科(Caligidae)[1]。該寄生蟲共有10個(gè)發(fā)育階段，每個(gè)階段都由一次退殼完成生長(zhǎng)，包括2個(gè)浮游的無節(jié)幼體階段，1個(gè)具有感染性的橈足類階段，4個(gè)由額絲連接到宿主的甲殼階段，2個(gè)成年前階段和1個(gè)成年階段[2-3]。海虱主要寄生在鮭科魚類身上，這種寄生蟲會(huì)影響宿主的生長(zhǎng)、繁殖和生存，主要以宿主的黏液和表皮細(xì)胞為食，造成魚體體表出血和潰瘍、免疫力和應(yīng)激能力下降、游動(dòng)能力受損，嚴(yán)重時(shí)可以導(dǎo)致宿主死亡[4]。研究表明，最容易受到感染的動(dòng)物是海鱒(S.trutta)和大西洋鮭(S.salar)，其次是虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、銀大麻哈魚(Oncorhynchuskisutch)和粉紅三文魚(O.gorbuscha)等[5-7]，在海水養(yǎng)殖的大西洋鮭魚，特別是高密度養(yǎng)殖，海虱是造成其他多種疫病暴發(fā)的一個(gè)原因。近年來，世界許多地區(qū)的鮭魚養(yǎng)殖業(yè)受到嚴(yán)重影響，在全球養(yǎng)殖業(yè)中，由于海虱感染引起的直接和間接年度損失估計(jì)超過1億美元[8]，包括蘇格蘭、挪威、美國、加拿大等地。在我國沿海很多省開始在海岸線發(fā)展養(yǎng)殖大西洋鮭魚產(chǎn)業(yè)，內(nèi)陸地區(qū)也已經(jīng)大規(guī)模淡水養(yǎng)殖虹鱒魚，這些都是海虱的易感動(dòng)物。目前，在我國還沒有海虱感染養(yǎng)殖魚的報(bào)道，但是，每年進(jìn)口我國的大西洋鮭魚超過3萬噸，這些進(jìn)口鮭魚如果攜帶海虱，很容易對(duì)我國鮭科魚養(yǎng)殖行業(yè)造成潛在經(jīng)濟(jì)損失，因此，入境口岸必須建立檢驗(yàn)檢疫程序，嚴(yán)格篩查和鑒定進(jìn)口鮭魚是否攜帶外來物種海虱，以便采取防止外來物種入侵的防控措施。

目前，對(duì)于海虱的鑒定主要側(cè)重于形態(tài)學(xué)，魚虱科的物種形態(tài)相似，其部分結(jié)構(gòu)肉眼難以辨別，需要借助解剖鏡或者電鏡等工具，且個(gè)體形態(tài)還受到環(huán)境因子、種類個(gè)體變異、雌雄個(gè)體差異以及發(fā)育時(shí)期等因素的影響[9]，蟲卵和早期發(fā)育狀態(tài)的幼蟲無特定形態(tài)特征，單純的形態(tài)特征難以檢出魚虱和判定物種類別。18S rDNA具有高度保守性的特點(diǎn)，該基因序列差異大小代表了物種差異大小，大量的研究表明18S rDNA在物種分類鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等領(lǐng)域，廣泛應(yīng)用其來確定物種的分類地位[10]。而迄今為止海虱的分子生物學(xué)鑒定方面的研究較少，主要在單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)、微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記[11-13]等方面有所報(bào)道。核酸體外擴(kuò)增技術(shù)能夠通過獲得的遺傳物質(zhì)實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)對(duì)象的識(shí)別，PCR擴(kuò)增18S rDNA，測(cè)序后比較物種間的差異，是病原學(xué)檢測(cè)鑒定中的常用方法。實(shí)時(shí)熒光PCR則通過熒光基團(tuán)標(biāo)記的特異性探針，可以對(duì)PCR擴(kuò)增過程實(shí)時(shí)監(jiān)控以及對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行數(shù)字化分析，監(jiān)測(cè)目標(biāo)核酸擴(kuò)增情況，該方法相比普通的PCR和常規(guī)形態(tài)學(xué)方法，具有耗時(shí)短的特點(diǎn)，良好的特異性和高靈敏度是病原篩查的優(yōu)選技術(shù)，在物種鑒定領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。本研究擬對(duì)進(jìn)口大西洋鮭魚攜帶的海虱成蟲開展形態(tài)學(xué)研究，進(jìn)一步做分子生物學(xué)分析，建立口岸檢驗(yàn)檢疫快速和實(shí)用的鑒定方法，嚴(yán)密監(jiān)控外來海虱入侵我國。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 海虱 2017年1月-2019年8月，深圳海關(guān)病毒與免疫檢驗(yàn)檢疫實(shí)驗(yàn)室截獲的347只海虱，均是從挪威進(jìn)口的大西洋鮭魚體上采集，并存放于-20℃待檢。

1.1.2 試劑 DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、Premix ExTaqTM(Probe qPCR)、T 載體、DNA 凝膠回收試劑盒、MiniBEST Plasmid Purification Kit等，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；QIAamp DNA Mini Kit，Qiagen公司產(chǎn)品；瓊脂糖H，Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 M450C顯微成像系統(tǒng)，德國蔡司公司產(chǎn)品；熱循環(huán)PCR儀器、微量核酸蛋白濃度分析儀(Nanodrop 2000C)，美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光PCR儀(7500型)，ABI公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 海虱通常定植在大西洋鮭魚的體表鱗片上或者鰓絲上，將從魚體上采集的海虱置于培養(yǎng)皿中，加少量生理鹽水，置于體視顯微鏡下，觀察試驗(yàn)樣本的外部形態(tài)特征，并使用M450C顯微成像系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行拍照記錄，其形態(tài)學(xué)鑒定標(biāo)準(zhǔn)參考Johnson S C等[14]對(duì)海虱形態(tài)發(fā)育的描述。

1.2.2 PCR鑒定

1.2.2.1 目的基因的擴(kuò)增及電泳分析 在NCBI上獲取19種海虱的18S rDNA序列，通過多序列比對(duì)，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。使用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒提取所有海虱樣品的基因組DNA，保存于-20 ℃。以樣品的基因組DNA為模板，以SL18S-F和SL18S-R引物對(duì)海虱的18S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括2×PCR buffer 12.5 μL，20 μmol/L的SL18S-F、SL18S-R引物各1 μL，最后加DEPC水及模板補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件經(jīng)優(yōu)化后為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察反應(yīng)結(jié)果，將PCR產(chǎn)物送至華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2.2 序列比對(duì) 使用DNA Star對(duì)擴(kuò)增的18S rDNA序列進(jìn)行序列比對(duì)，一般認(rèn)為序列同源性為99%以上認(rèn)定為一種。并根據(jù)P-距離計(jì)算序列的變異程度，序列變異在1%以內(nèi)，則認(rèn)定為同一種。參考GenBank序列數(shù)據(jù)庫(表1)，通過序列的系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)寄生蟲做確證鑒定。

表1 PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建參考序列

1.2.2.3 基于18S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析 將樣品測(cè)序后得到的樣品的18S rDNA序列與19種已發(fā)表的分屬于5個(gè)屬的魚虱科物種的18S rDNA基因序列一起構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，并選取Anthosomacrassum為外類群。用MEGA7.0軟件鄰接法(Neighbor joining，NJ)基于Kimura2-Prameter方法計(jì)算遺傳距離值，計(jì)算Bootstrap值，重復(fù)1 000次，構(gòu)建基于18S rDNA序列的分子進(jìn)化樹。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定

1.2.3.1 引物與探針的設(shè)計(jì) 通過對(duì)比海虱的18S rDNA基因序列，選取堿基序列差異較小的位點(diǎn)，利用Oligo軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物和一條探針，由華大基因生物有限公司合成(表2)。

表2 本試驗(yàn)中所用的引物和探針序列

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以PCR擴(kuò)增鮭瘡痂魚虱的18S DNA基因序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物的基因片段進(jìn)行純化回收，純化產(chǎn)物與pMD18-T載體4 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏菌DH5α中，經(jīng)鑒定后將陽性菌液送至金維智生物有限公司測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序正確的菌株用于提取質(zhì)粒，制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。重組質(zhì)粒濃度并按公式：模板拷貝濃度(拷貝/μL)=重組質(zhì)粒質(zhì)量濃度(mg/L)×6.02×1014/(660×重組質(zhì)粒堿基數(shù))。

1.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 利用微量核酸蛋白濃度分析儀測(cè)定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，將其10倍梯度稀釋，作為已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系為2×premix ExTaq(Probe qPCR) 10 μL，20 μmol/L的上、下游引物各0.4 μL、探針0.8 μL，ROXⅡ 0.5 μL，加入模板和水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序第一步：95 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；第二步：95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。同時(shí)做3個(gè)平行樣，測(cè)定靈敏度并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.4 海虱樣品的實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定 以1.2.1中保存的所有海虱核酸樣品作為模板，按照前述反應(yīng)體系和程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，用于檢測(cè)該方法的實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1 海虱的形態(tài)學(xué)鑒定

從進(jìn)口大西洋鮭魚體上收集到347個(gè)海虱樣品均為成蟲形態(tài)，使用體視顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有如下特征：蟲體大致可以分為頭胸部、腹部和尾部3個(gè)部分(圖1A～G)。

A.背部;B.腹部;C.雌性;D.雄性 ;E.頭胸部的腹面;F.雄性的腹部和尾部;G.雌性的腹部和尾部;1.第一觸角;2.第二觸角;3.第一顎足;4.口器;5.胸叉;6.第四胸足;7.第二胸足;8.第五胸足;9.尾叉;10.尾剛毛;11.生殖節(jié);12.卵串;13.卵A.Back;B.Abdomen;C.The female;D.The male;E.Ventral part of cephalothorax;F.Abdomen and tail of male;G.Abdomen and tail of female;1.First antenna;2.Second antenna;3.First maxilliped;4.Mouthpart;5.Chest fork;6.The fourth leg;7.The second leg;8.The fifth leg;9.Caudal rami;10.Caudal rami setae;11.Genital segment;12.Egg strings;13.Eggs

頭胸部形態(tài)扁平，呈盾狀，頭與前3個(gè)胸節(jié)愈合并覆以胸甲，第4胸節(jié)沒有覆蓋胸甲，第1和第2觸角具有鄂鉤，并附有觸毛；第1和第2顎足尖端似爪，具有抓握作用，能夠牢固附著在魚體，第4對(duì)胸足異常發(fā)達(dá)，協(xié)助蟲體運(yùn)動(dòng)。腹部?jī)H有一節(jié)且寬度和長(zhǎng)度均小于頭胸部，第5胸足與生殖節(jié)愈合。尾部具有一節(jié)，末端分為2個(gè)尾叉，每個(gè)尾叉有4根尾剛毛。成蟲形態(tài)特征明顯分兩類，經(jīng)鑒別為性別差異，雌性腹部生殖節(jié)呈圓柱形，長(zhǎng)度和寬度相差不大，具有狹窄傾斜的前外側(cè)邊緣，部分個(gè)體還帶有2條卵串(圖1 C)；雄性的腹部生殖節(jié)的寬度小于長(zhǎng)度，呈卵圓型，第5對(duì)胸足有4根剛毛，位于節(jié)段中間靠近側(cè)緣的位置(圖1D)。所有樣品總體符合鮭瘡痂魚虱發(fā)育階段成蟲時(shí)期的形態(tài)特征的描述，初步判斷從大西洋鮭魚所截獲樣品為典型的海虱。但是，除了上述顯著特征差異，所截獲的海虱在個(gè)體形態(tài)、發(fā)育階段和色素沉積上仍然有一些較大的差異，所有樣品是否屬于同一類，形態(tài)學(xué)方法難以直接判斷其種屬，因此，需要借助分子生物學(xué)手段來進(jìn)一步做類屬分析。

2.2 PCR鑒定

2.2.1 PCR擴(kuò)增 根據(jù)數(shù)據(jù)庫中海虱的序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)口大西洋鮭魚攜帶的所有海虱樣品均能擴(kuò)增出1條明亮清晰大小約為1 700 bp的條帶，與預(yù)計(jì)PCR產(chǎn)物大小一致，且條帶單一(圖2)。表明本試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物能對(duì)采集樣品的18S rDNA片段得到有效擴(kuò)增，然后將所有擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陰性對(duì)照;2～11.部分海虱樣品M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control;2-11.Partial samples of sea lice

2.2.2 多序列比對(duì)及Blast比對(duì) 使用MegAlign軟件分別對(duì)347個(gè)樣品獲得的測(cè)序序列進(jìn)行多序列比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中286個(gè)樣品序列完全一致，其余61個(gè)樣品序列完全一致，歸類為序列1和序列2兩類，其結(jié)果如圖3所示，兩類序列共有65個(gè)堿基變異位點(diǎn)，序列間總相似度為96.01%。分別將兩類序列在GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示，序列1和序列2分別與鮭瘡痂魚虱(Lepeophtheirussalmonis,LS)和長(zhǎng)魚虱(Caliguselongatus,CE)具有最高同源性。

陰影部分表示序列之間差異位點(diǎn)The shadow parts indicate the different sites between the sequences

2.2.3 基于18s rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 將兩類海虱的18S rDNA序列和在NCBI上獲得的19種海虱的18S rDNA序列構(gòu)建基于鄰接法的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)果表明，本研究通過PCR擴(kuò)增獲得的序列1和序列2的分別與鮭瘡痂魚虱(Lepeophtheirussalmonis)和長(zhǎng)魚虱(Caliguselongatus)聚為一簇，分屬于魚虱科的不同屬。在進(jìn)化樹中屬于同一科的物種聚于同一大支，每個(gè)科中同一屬聚于同一分支，在進(jìn)化樹中可以體現(xiàn)出不同科、屬的進(jìn)化關(guān)系。表明來自于挪威的進(jìn)口大西洋鮭魚受到兩種海虱的感染，主要是鮭瘡痂魚虱，占截獲樣品總數(shù)的82.42%，另一類病原為長(zhǎng)魚虱，占截獲樣品總數(shù)的17.58%。兩類都是在我國沒有報(bào)道的寄生蟲類群，為典型的外來物種。

圖4 基于18S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定

重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒通過公式計(jì)算得知濃度為3.2×107拷貝/μL，經(jīng)10倍梯度稀釋后，以2.94×100拷貝/μL～2.94×107拷貝/μL的重組質(zhì)粒為擴(kuò)增模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，不同濃度梯度重組質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線見圖5，在40個(gè)循環(huán)內(nèi)最低檢出濃度為2.94拷貝/μL；以起始模板濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)自動(dòng)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6，相關(guān)系數(shù)R2為0.998，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為:y=-3.33logx+35.38，由此可見，模板濃度與Ct值之間存在較好的線性關(guān)系，該方法具有良好的重復(fù)性和靈敏度。

1～8.2.94×107拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒～2.94×100拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒1-8.2.94×107 copy/μL-2.94×100 copy/μL

圖6 標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)所有樣品的核酸鑒定，無論鮭瘡痂魚虱還是長(zhǎng)魚虱樣品均能夠得到陽性結(jié)果(圖7)，與PCR鑒定結(jié)果一致，表明建立的快捷檢測(cè)方法對(duì)兩類海虱都能夠有效檢出。當(dāng)樣品為無明顯形態(tài)特征的蟲卵或者幼蟲時(shí)，由于具有很高的靈敏性，有效降低漏檢率，且整個(gè)過程操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，僅需70 min即可完成，可以使用該方法作為初篩技術(shù)，檢測(cè)結(jié)果為陽性的樣品可以進(jìn)一步做測(cè)序鑒定，是PCR的有效替代技術(shù)。

1.陽性對(duì)照;2.LS樣品;3.CE樣品;4.陰性對(duì)照1.Positive control; 2.LS sample; 3.CE sample; 4.Negative control

3 討論

本研究首次報(bào)道進(jìn)口大西洋鮭魚有攜帶外來物種海虱入境的風(fēng)險(xiǎn)。海虱是一種橈足類海水動(dòng)物寄生蟲，主要分布于北大西洋和北太平洋的野生和養(yǎng)殖的大西洋鮭魚上，尤其鮭瘡痂魚虱，給大西洋鮭魚養(yǎng)殖場(chǎng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。如何控制海虱感染鮭魚已被水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)列為首要任務(wù)之一[15]。本研究鑒定了來自于挪威的大西鮭魚上寄生的海虱，鑒定結(jié)果顯示魚體攜帶有兩種海虱，分別是鮭瘡痂魚虱和長(zhǎng)魚虱，其中占比較高的物種是鮭瘡痂魚虱。且在18S DNA水平上，無論是鮭瘡痂魚虱還是長(zhǎng)魚虱都未出現(xiàn)分型，與基于CO1分型研究的結(jié)果一致[16]。Stone J等[17]報(bào)道了在挪威海域的確分布有這兩個(gè)海虱，并且在蘇格蘭地區(qū)對(duì)這2種海虱開展過防治研究。根據(jù)Treasurer J W等[18]的描述，鮭瘡痂魚虱主要侵染大西洋鮭魚的頭部和背部，而長(zhǎng)魚虱主要在腹鰭和尾部有較高的比例，并不存在太大的寄生空間競(jìng)爭(zhēng)，因此，這兩個(gè)物種可以共同生存在同一個(gè)體上，并都可以對(duì)大西洋鮭造成相同的病情。本研究收集的進(jìn)口鮭瘡痂魚虱在形態(tài)上與我國黃、渤海發(fā)現(xiàn)的5種瘡痂魚虱較為相似，它們之間是否有相同的感染性目前還未知。我國目前正在大量淡水養(yǎng)殖虹鱒，而且沿海也已經(jīng)引種大西洋鮭，開始海洋養(yǎng)殖。雖然在國內(nèi)養(yǎng)殖的虹鱒上還未見海虱感染報(bào)道，但是，有報(bào)道1990年在臺(tái)灣的莫桑比克羅非魚上發(fā)現(xiàn)了與長(zhǎng)魚虱同屬Caligusepidemicus[19]的寄生蟲感染，目前，來自于挪威大西洋鮭魚攜帶的2種海虱存在感染國內(nèi)養(yǎng)殖鮭鱒魚的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)時(shí)空分布特點(diǎn)和易感物種分析，海虱一旦侵入我國，將會(huì)對(duì)我國的海水鮭魚養(yǎng)殖業(yè)造成損失，因此，識(shí)別和監(jiān)控外來海虱入侵至關(guān)重要。

本研究獲得的樣品均為成蟲，但海虱有10個(gè)發(fā)育階段，每個(gè)階段形態(tài)差異都較大，在成年前期Ⅰ，雌雄個(gè)體還有極大差別[2]。海虱蟲體較小，成蟲體長(zhǎng)約為6 mm～11 mm，使用肉眼和普通顯微鏡難以辨識(shí)。在進(jìn)口大西洋鮭魚的魚體上有可能攜帶蟲卵或者正處于甲殼階段的幼體，這些階段的海虱個(gè)體小，形態(tài)差異大，如果僅用形態(tài)學(xué)方法篩查，存在遺漏的風(fēng)險(xiǎn)，本研究采用形態(tài)學(xué)鑒定和輔以分子生物學(xué)手段，能在基因水平篩查和鑒定海虱屬種。本研究基于18S rDNA基因序列建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，最低檢測(cè)為2.94拷貝/μL，耗時(shí)短，僅需70 min即可完成檢測(cè)，能夠快捷地鑒定海虱，可以作為一種快速的初篩方法，設(shè)計(jì)的引物和探針對(duì)兩種海虱有相同的擴(kuò)增效率，可以同步篩查兩種海虱。與Jonhard E等[20]基于圓鰭魚(Cyclopteruslumpus)線粒體細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ(COI)建立檢測(cè)胃液中的鮭瘡痂魚虱實(shí)時(shí)熒光PCR相比，針對(duì)性更強(qiáng)，靈敏度更高。建立的PCR，配合測(cè)序技術(shù)，可以精準(zhǔn)鑒定海虱的類屬，為預(yù)警進(jìn)口大西洋鮭魚上攜帶的海虱入侵我國提供了實(shí)用的鑒定方法和技術(shù)支持。