應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建大腸埃希氏菌irp2基因缺失株

富國文，單春蘭，敖平星，趙 汝，高麗波，劉超英，高 洪

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201)

耶爾森氏菌強(qiáng)毒力島(Yersiniahigh-pathogeniticity island，HPI)主要含有與攝鐵有關(guān)的毒力基因簇[1]。研究表明，耶爾森氏菌HPI不僅可以通過耶爾森氏菌素(Yersiniabactin，Ybt)的鐵載體奪取宿主中的鐵元素進(jìn)而加重機(jī)體的感染，而且可在耶爾森氏菌和大腸埃希氏菌(E.coli)之間水平傳播，與致病性E.coli的毒力進(jìn)化有著密切的關(guān)系[2]。Schubert S等研究發(fā)現(xiàn)攜帶功能性HPI的腸外致病性大腸埃希氏菌與傳統(tǒng)的毒力因子菌毛、莢膜、侵襲素和其他鐵載體相比HPI具有最強(qiáng)的毒力[3]。irp2基因為HPI的標(biāo)志基因，與攝鐵功能相關(guān)，該基因表達(dá)的高分子量蛋白對Ybt的合成具有重要作用，被認(rèn)為是Ybt陽性表型表達(dá)所必需，因此，經(jīng)常通過構(gòu)建irp2基因缺失菌株來研究HPI的致病機(jī)制。

2013年，新型基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas(成簇有規(guī)則間隔短回文重復(fù))系統(tǒng)的出現(xiàn)，迅速受到全世界科研人員的關(guān)注。該系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌和古生菌中，構(gòu)成了對抗外來核酸入侵的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。CRISPR/Cas技術(shù)在過去幾年極大地提高了基因工程能力[4]。通常，CRISPR/Cas系統(tǒng)由CRISPR RNA (crRNA)和Cas蛋白組成。crRNA與靶序列互補(bǔ)，引導(dǎo)Cas蛋白進(jìn)行序列特異性識別和裂解。然后，可以通過容易出錯的非同源末端連接(NHEJ)或同源定向修復(fù)(HDR)引入基因修飾，從而產(chǎn)生精確的基因組修飾[5]，大多數(shù)原核生物使用HDR[6-8]。相比傳統(tǒng)基因工程策略，如λ-Red recombineering，CRISPR/Cas是一種可自由標(biāo)記、廣泛的、高效的基因編輯方法，更容易獲得陽性克隆[9-10]。CRISPR/Cas系統(tǒng)分為一類和二類，這兩類系統(tǒng)分別基于多蛋白效應(yīng)復(fù)合物和單一Cas蛋白。根據(jù)CRISPR/Cas系統(tǒng)的復(fù)雜性和特征蛋白，將其進(jìn)一步劃分為6種類型(Ⅰ～Ⅵ型)。其中，Ⅱ-A型CRISPR/Cas9作為細(xì)菌的遺傳工具得到了最廣泛的研究和開發(fā)[11]。本研究運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建撒壩豬致病性E.coliirp2基因缺失菌株，可以為進(jìn)一步研究HPI的致病機(jī)制及疫苗開發(fā)提供技術(shù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與實驗動物E.coliA/10菌株，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物病理學(xué)實驗室分離鑒定自腹瀉撒壩豬糞便，并證實該菌株具有致病性；大腸埃希氏菌DH5α，本實驗室保存;質(zhì)粒pTargetF(含有博萊霉素抗性)和pCas(含卡那霉素抗性)，西北農(nóng)林科技大學(xué)杜恩岐副教授饋贈；昆明小鼠，由昆明醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 2×EasyTaqPCR Super Mix、DNA標(biāo)準(zhǔn)，北京百泰克生物有限公司產(chǎn)品；SpeⅠ酶、HindⅢ酶、T4連接酶、核酸染料、瓊脂糖，50×TAE，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；博萊霉素、卡那霉素、L-阿拉伯糖，Gibco公司產(chǎn)品，使用濃度分別為25 mg/L和50 mg/L；LB培養(yǎng)基，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 1652660型電穿孔儀(Gene Pulser Xcell)、T100型PCR儀，美國伯樂有限公司產(chǎn)品；FA1004N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；YXQ-SG46-280型不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；DYCP-31BN型電泳儀、WD-9403F型凝膠成像儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；H1850R型高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 引物 根據(jù)本實驗室已測序的E.coliA/10菌株irp2基因序列設(shè)計上、下游同源臂擴(kuò)增引物arm-up和arm-down；以pTargetF質(zhì)粒基因序列為模板設(shè)計sgRNA-irp2；以pCas和pTargetF質(zhì)?；蛐蛄袨槟０逶O(shè)計鑒定引物pCas-JD和pTargetF-JD；于上游同源臂上方，下游同源臂下方設(shè)計缺失株鑒定引物Δirp2-JD；引物由擎科生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 pTargetF重組質(zhì)粒構(gòu)建 按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說明提取E.coliA/10基因組，置-20 ℃保存?zhèn)溆?。以arm-up-F、arm-up-R、arm-down-F和arm-down-R為引物，以E.coliA/10菌株基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增上、下游同源臂。以sgRNA-irp2-F和sgRNA-irp2-R為引物，以pTargetF質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增sgRNA-irp2。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察拍照，膠回收試劑盒回收，分別命名為arm-up、arm-down和sgRNA-irp2，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以sgRNA-irp2-F和arm-up-R為上、下游引物，sgRNA-irp2和arm-up為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物命名為sgRNA-irp2+arm-up。再以sgRNA-irp2-F和irp2-down-R為上、下游引物，以sgRNA-irp2+arm-up和arm-down為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察拍照，膠回收試劑盒回收，命名為sgRNA-irp2+arm-up+arm-down，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用SpeⅠ和HindⅢ酶對sgRNA-irp2+arm-up+arm-down和pTargetF質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切體系：SpeⅠ酶1 μL，HindⅢ酶1 μL，pTargetF質(zhì)粒/sgRNA-irp2+arm-up+arm-down 18 μL，buffer 5 μL，水25 μL，混勻，37 ℃水浴2 h，膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，待用。上述酶切產(chǎn)物以T4連接酶進(jìn)行連接，酶接體系：T4連接酶5 μL，pTargetF質(zhì)粒酶切產(chǎn)物1 μL，sgRNA-irp2+arm-up+arm-down酶切產(chǎn)物4 μL，16 ℃水浴1 h，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察拍照，膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，待用。將構(gòu)建的pTargetF重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，方法參見文獻(xiàn)[12]，接種于含有25 mg/L博萊霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，置-20℃保存，備用。

1.2.2 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的irp2基因缺失 以E.coliA/10菌株制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，方法參見文獻(xiàn)[12]。將pCas電轉(zhuǎn)化E.coliA/10感受態(tài)細(xì)胞，接種于50 mg/L卡那霉素的LB平板，30 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落，以pCas-JD-F和pCas-JD-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。挑取pCas陽性克隆菌接種于含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)至OD 600nm為0.2時，向搖瓶中加入終濃度為10 mmol/L的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)pCas載體上λ-Red蛋白的表達(dá)，繼續(xù)搖至OD 600 nm≈0.5時回收菌體，同上方法制備電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞。電轉(zhuǎn)化pTargetF重組質(zhì)粒，接種于含有50 mg/L卡那霉素和25 mg/L博萊霉素的LB平板上，30 ℃過夜培養(yǎng)，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。挑取陽性轉(zhuǎn)化子接種于含有50 mg/L卡那霉素和0.5 mmol/L IPTG的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃過夜培養(yǎng)，取100 μL培養(yǎng)菌液稀釋后涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB平板上，在30 ℃培養(yǎng)12 h。隨機(jī)挑取單克隆菌落，接種于含有25 mg/L博萊霉素的液體LB中，篩選不能生長的單克隆菌。挑取該單克隆菌接種于無抗性的液體LB中，在37 ℃培養(yǎng)8 h～12 h，稀釋涂板，隨機(jī)挑取單克隆菌，接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，篩選不能生長的克隆菌。挑取上述步驟篩選出的單克隆菌，以Δirp2-JD-F和Δirp2-JD-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物送昆明擎科生物科技有限公司測序，正確的菌株命名為E.coliΔirp2-A/10。

1.2.3 生長曲線測定 挑取E.coliA/10與E.coliΔirp2-A/10菌株單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，調(diào)整OD 600 nm≈0.5，分別按1∶100的比例接入20 mL的LB培養(yǎng)基中，150 r/min，37 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔1 h測定OD600 nm，繪制生長曲線。

1.2.4 LD50的測定 將E.coliA/10與E.coliΔirp2-A/10菌株用LB培養(yǎng)基稀釋至2.5×1010、2.5×109、2.5×108、2.5×107、2.5×106CFU/mL共5個稀釋度。試驗用小鼠共分為3組，E.coliA/10組50只，每個稀釋度10只；E.coliΔirp2-A/10組50只，每個稀釋度10只；對照10只組注射LB液體培養(yǎng)基，各組小鼠按照0.1 mL/只的劑量進(jìn)行腹腔注射。注射后24 h記錄各組死亡數(shù)量，用Reed-Muench法計算半數(shù)致死量。

2 結(jié)果

2.1 pTargetF重組質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

本試驗中用于敲除irp2基因的arm-up大小為500 bp。arm-down大小為481 bp，其前端帶有與arm-up末端互補(bǔ)的15個堿基序列，用于連接arm-up；末端帶有HindⅢ酶切位點，用于連接pTargetF質(zhì)粒。sgRNA大小為139 bp，其前端帶有SpeⅠ酶切位點，用于連接pTargetF質(zhì)粒；末端帶有與arm-up前端互補(bǔ)的15個堿基序列，用于相互連接arm-up。PCR擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，各目的片段大小符合預(yù)期(圖1A)。

利用重疊PCR擴(kuò)增的方法，首先將sgRNA與arm-up進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物再用同樣的方法與arm-down連接；接合后片段大小應(yīng)為1 120 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，目的片段大小符合預(yù)期(圖1B)。

pTargetF質(zhì)粒經(jīng)SpeⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，回收2 224 bp處產(chǎn)物(圖1 C)與sgRNA-irp2+arm-up+arm-down的雙酶切產(chǎn)物以T4連接酶連接，電轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，于含有25 mg/L博萊霉素的LB平板上長出單克隆菌落。提取質(zhì)粒后以pTargetF-JD-F和pTargetF-JD-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物大小204 bp，符合預(yù)期(圖1D)，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 pCas質(zhì)粒介導(dǎo)的irp2基因缺失

E.coliA/10轉(zhuǎn)入pCas質(zhì)粒，在含有卡那霉素的LB平板上長出單克隆菌，以pCas-JD-F和pCas-JD-R為上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小340 bp，符合預(yù)期(圖1E)。電轉(zhuǎn)入pTargetF重組質(zhì)粒后，在含有卡那霉素和博來霉素的LB平板上有單克隆菌長出。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，隨機(jī)挑取的3個單克隆菌在含有博萊霉素的LB液體培養(yǎng)基中均不生長，表明pTargetF質(zhì)粒被消除。消除pTargetF質(zhì)粒的單克隆菌37 ℃過夜培養(yǎng)涂板后，隨機(jī)挑取的8個單克隆菌中有2個不能在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中生長，pCas質(zhì)粒被消除。以位于同源臂上下游的缺失株鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物大小1 267 bp，符合預(yù)期(圖1F)。目的條帶測序結(jié)顯示irp2基因6 109 bp被刪除，表明E.coliA/10 irp2基因缺失菌株構(gòu)建成功。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;A：1.靶向irp2的sgRNA；2.下游同源臂；3.上游同源臂500 bp；B：sgRNA連接上下游同源臂；C：pTargerF酶切產(chǎn)物2 224 bp；D：pTargerF鑒定產(chǎn)物；E：pCas轉(zhuǎn)化鑒定產(chǎn)物；F：1.A/10菌株；2.Δirp2-A/10菌株鑒定產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000;A:1.sgRNA-irp2；2.Arm-down(481bp)；3.Arm-up(500 bp)；B:sgRNA-irp2+up-arm+down-arm；C:Plasmid enzyme digestion product of pTargerF；D:pTargerF plasmid identification product；E:pCas identification product(340 bp)；F:1.E.coli A/10 strain；2.Identification product of irp2 deletion strain

2.3 irp2基因缺失對菌株生長的影響

E.coliA/10和E.coliΔirp2-A/10菌株在37 ℃、150 r/ min的LB培養(yǎng)基中的生長曲線見圖2。兩者在各測試點生長速率差異不顯著(P>0.05)，表明irp2基因缺失對該菌株在LB培養(yǎng)基中的增殖無顯著影響。

圖2 E.coli A/10與E.coli Δirp2-A/10菌株生長曲線

2.4 irp2基因缺失對菌株致病力的影響

小鼠半數(shù)致死量測定結(jié)果見表2。irp2基因缺失前E.coliA/10的LD50為9.57×107CFU/mL，缺失后為5.20×108CFU/mL，表明irp2基因缺失降低了原菌株的致病力。

表2 親本株與irp2缺失株LD50的測定

3 討論

毒力島是細(xì)菌編碼重要的毒力、抗生素耐藥性和其他輔助功能的基因組成員，在細(xì)菌基因轉(zhuǎn)移中也具有重要作用，HPI是其中之一。HPI首先發(fā)現(xiàn)于耶爾森氏菌，含有編碼攝取、合成鐵載體耶爾森氏菌素(Ybt)的基因及其調(diào)節(jié)基因，是決定此菌致病性和毒力大小的重要因素之一。之后的研究發(fā)現(xiàn)，HPI也存在于其他腸桿菌中，大腸埃希氏菌、枸櫞酸桿菌 、沙門氏菌、克雷伯菌等[13]。Paauw A等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，Ybt不僅通過對三價鐵的高親和力，還通過激活免疫細(xì)胞減少活性氧的產(chǎn)生來促進(jìn)細(xì)菌生長。Magistro G等[15]研究了HPI和鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動性之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HPI中的irp2或ybtA基因缺失對腸致病性大腸埃希氏菌的運(yùn)動能力有顯著影響。Tu J等[16]對禽致病性大腸埃希氏菌研究發(fā)現(xiàn)，敲除HPI中的irp2和fyuA基因，該菌對DF-1細(xì)胞的黏附能力減弱，雛雞的致病性降低。這些研究表明，除了獲取鐵的功能外，HPI還在許多過程中發(fā)揮作用，而本研究獲得的irp2基因缺失菌株可以為進(jìn)一步研究其致病機(jī)制提供試驗材料。

在細(xì)菌致病機(jī)制的研究中，廣泛使用基因編輯的方法。Red同源重組是E.coli基因編輯的傳統(tǒng)方法,但該系統(tǒng)存在明顯的不足,如操作步驟復(fù)雜、重組率低等，極大地降低了敲除的效率。相較于傳統(tǒng)方法,改進(jìn)后的兩步同源重組方法操作相對簡單、周期短，成為E.coli基因敲除中最為常用的方法之一。但該方法對DNA片段的濃度要求高，達(dá)不到要求的菌株會失敗，影響打靶效率，且會留下外源片段[17]。本實驗室長期使用該方法構(gòu)建大腸埃希氏菌基因缺失菌株，但成功率低。而近年來出現(xiàn)的ZFN和TALEN技術(shù)雖然先后被用于E.coli的基因編輯，但由于設(shè)計繁瑣、過度依賴于目標(biāo)序列及其上、下游序列、高脫靶率和較大的細(xì)胞毒性等因素未得到廣泛應(yīng)用[18]。

與以上基因編輯工具相比，CRISPR/Cas系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢：首先，CRISPR/Cas可以高效的斷裂目標(biāo)序列；其次，可以結(jié)合λ-Red重組酶，實現(xiàn)精確、高效、無標(biāo)記的基因編輯[19]。Jiang Y等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas系統(tǒng)進(jìn)行E.coli基因編輯時，同時在pTargetF重組質(zhì)粒中引入同源臂，在pCas質(zhì)粒中引入λ-Red重組酶，效率顯著高于其他方式。因此本研究中，首先將靶向irp2基因的sgRNA與上、下游同源臂進(jìn)行連接。在引物的設(shè)計過程中，應(yīng)綜合考慮片段之間的連接和酶切位點的位置。將pCas和pTargetF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌后，IPTG誘導(dǎo)pCas質(zhì)粒上靶向pTarget F重組質(zhì)粒中pMB1的sgRNA-pMB1的表達(dá)，pTarget F重組質(zhì)粒上的NGG20快速的錨定細(xì)菌基因組上的NGG20，進(jìn)行雙鏈斷裂和重組修復(fù)，從而高效獲得突變體。該過程引起pTarget F質(zhì)粒的丟失，雖然不能達(dá)到100%的消除，但效率比較高[19]。在本試驗中隨機(jī)挑取的3個單克隆菌均未表現(xiàn)出博萊霉素抗性。pCas為溫度敏感型質(zhì)粒，37 ℃條件下培養(yǎng)會自行丟失。在本試驗中隨機(jī)挑取10個單克隆菌，有2個消除成功。生長曲線測定結(jié)果表明，在LB培養(yǎng)基中irp2基因缺失對菌株的生長無顯著影響，這可能與大腸埃希氏菌還有其他獲取鐵的方式有關(guān)，如腸菌素、沙門氏菌素、氣桿菌素等。小鼠半數(shù)致死量測定結(jié)果表明，irp2基因缺失后，菌株的致病力降低，這與Paauw A等[14]的研究結(jié)果相一致，但其確切的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究采用CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)對臨床分離的撒壩豬致病性E.coli中的irp2基因進(jìn)行編輯，成功獲得了缺失菌株E.coliΔirp2-A/10，可以為進(jìn)一步研究irp2基因在該菌株致病中的作用提供試驗材料，同時也為利用該技術(shù)開展E.coli基因功能研究和疫苗開發(fā)提供參考。