牛多殺性巴氏桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

毛暢思，黨 喬，魏 星，孔令聰,3*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100093；2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林長春 130118；3.動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林長春 130118；4.遼源市動物疫病預防控制中心，吉林遼源 136220)

牛呼吸系統(tǒng)疾病(Bovine respiratory disease，BRD)已成為制約肉牛養(yǎng)殖的主要因素，危害著世界各地養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展，據(jù)統(tǒng)計全球每年因BRD造成的經(jīng)濟損失高達3億美元，其中英國每年約有190萬頭牛患BRD，死亡達15.7萬頭[1]。在我國該病主要發(fā)生在經(jīng)外地引進的育肥牛中，老百姓稱之為“爛肺病或運輸熱”，其發(fā)病率高達80%，單場病死率高達60%[2]，給我國肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，部分養(yǎng)殖戶已不敢遠距離運牛。引發(fā)BRD的病原主要為牛支原體(Mycoplasmabovis)、牛多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)和溶血曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica,Mh)，且部分混合感染的病例發(fā)病率和病死率更高[3]。時至今日，該病的發(fā)生并未減緩，相關(guān)研究推測其主要病原可通過肉牛的異地轉(zhuǎn)運而發(fā)生傳播，而我國“北牛南調(diào)，西牛東運”的肉牛育肥模式更為該病的發(fā)生和傳播提供了便利的條件[4]。某牛場經(jīng)異地引進牛后，多頭牛發(fā)病，經(jīng)抗菌藥物治療后并未好轉(zhuǎn)，亟需對主要病原進行分離鑒定并對其藥物敏感性進行檢測。為此，本研究擬對某牛場運輸后的患牛進行主要病原的分離鑒定，對藥物敏感性、致病性進行了檢測，進一步對分離菌進行脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分型，以對其主要病原是否發(fā)生克隆傳播進行確證，為我國BRD的防控提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 某肉牛養(yǎng)殖場經(jīng)“北牛南調(diào)”的臨床健康牛鼻腔拭子12份；運輸后發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病死亡病死牛2頭，無菌采集病死牛的心臟、肺臟和肝臟等臟器。

1.1.2 培養(yǎng)基與藥品 所需培養(yǎng)基，中國青島日水公司產(chǎn)品；PCR試劑、膠回收試劑等分子生物學試劑，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；細菌基因組提取試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；環(huán)丙沙星、恩諾沙星、磺胺氯氰鈉、四環(huán)素、氟苯尼考、替米考星、紅霉素、克林霉素、新諾明等藥品，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品；部分藥品由康地恩生物有限公司惠贈。

1.1.3 實驗動物 SPF級小鼠，體重20 g～25 g，購自吉林大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀檢查 對運輸后出現(xiàn)咳嗽、喘的病牛進行臨床癥狀檢查。

1.2.2 病例剖檢 對運輸后以咳嗽、喘為主要癥狀死亡的病牛進行剖檢，觀察主要臟器的病理變化，進一步制備病變較明顯臟器的病理組織切片。

1.2.3 細菌學檢查

1.2.3.1 分離培養(yǎng) 將采集的健康牛鼻腔拭子、病死牛肺臟接種于腦心浸液肉湯，置37 ℃溫箱培養(yǎng)18 h后，再接種于腦心浸液固體培養(yǎng)基和鮮血瓊脂平板，觀察細菌生長情況，菌落形態(tài)，以及是否發(fā)生溶血。同時，將病料無菌研磨后接種于改良的PPLO培養(yǎng)基，觀察其是否有牛支原體生長。

1.2.3.2 生化及分子生物學鑒定 分離菌的生化鑒定按常規(guī)方法進行。同時，采用16S rRNA引物和多殺性巴氏桿菌特異性引物kmt1及capA、capB、capD、capE、capF莢膜分型引物對疑似巴氏桿菌進行PCR擴增及莢膜分型。

1.2.3.3 致病性試驗 采用改良寇氏法對分離的3株P(guān)m進行LD50的測定。每株菌進行菌落計數(shù)，通過預實驗設置濃度為104、105、106CFU/mL 3個劑量組，每個劑量組隨機取8只小鼠，雌雄各半。每個劑量組腹腔注射不同梯度濃度菌液0.3 mL。每組小鼠隔離飼養(yǎng)，連續(xù)3 d觀察死亡情況，計算LD50值。

1.2.3.4 藥敏試驗 采用2種方法對分離菌進行藥物敏感性檢測(微量肉湯稀釋法和平皿二倍稀釋法)。試驗藥物為環(huán)丙沙星、恩諾沙星、磺胺氯氰鈉、四環(huán)素、氟苯尼考、替米考星、紅霉素、克林霉素和新諾明等9種抗菌藥物。每個試驗重復3次。Pm的藥物敏感性判定折點見表1。

表1 Pm對部分抗菌藥物敏感性判定折點

1.2.3.5 PFGE分型 參考Ahmed M.Moustafa等的方法，結(jié)合Pm脈沖場凝膠電泳試驗方法、步驟對這3株分離菌進行分型[5]。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀觀察

運輸后共12頭牛發(fā)生咳嗽、氣喘等癥狀，食欲減退，反芻遲緩，體溫升高達40 ℃～42℃，但病牛未出現(xiàn)跛行等癥狀。

2.2 病理剖檢及切片觀察

剖檢可見肺臟病變最為明顯，肺臟廣泛出血，胸膜粘連，肺組織切面呈大理石樣，胸腔可見纖維素樣滲出。其他臟器未見異常。病理切片觀察可見支氣管及周圍肺泡腔內(nèi)腔充滿大量中性粒細胞(圖1A和圖1B)，肺泡腔擴張，肺泡腔及細支氣管內(nèi)散在炎性細胞浸潤(圖1C和圖1D)，以中性粒細胞為主。間質(zhì)輕度增生。

A、B.100×；C、D.400×A,B.100×; C,D.400×

2.3 細菌學診斷

2.3.1 細菌形態(tài)及培養(yǎng)特性 病死牛的肺臟、心血觸片瑞特染色鏡檢，可見兩極濃染的短桿菌，革蘭氏染色呈陰性。分離菌在腦心浸液培養(yǎng)基生長較好，菌落呈半透明露滴狀；改良PPLO肉湯未見支原體生長。

2.3.2 生化及分子生物學鑒定 3株分離菌均能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、單奶糖和甘露糖，靛基質(zhì)反應陽性，不能發(fā)酵鼠李糖、乳糖，V-P試驗和H2S試驗陰性。采用Kmt1引物對3株分離株進行鑒定，得到460 bp的片段，結(jié)果如圖2所示，采用16S rDNA引物進行PCR擴增得到1 600 bp的目標片段，將目的片段純化、連接、轉(zhuǎn)化、篩選并測序，將測序結(jié)果用Blast軟件與GenBank已登錄序列進行比對分析，其與Pm的同源性高達99%，結(jié)果如圖3所示；進一步以3株P(guān)m抽提的基因組為模板，經(jīng)莢膜分型多重PCR擴增，均擴增出1 000 bp左右的特異條帶，其大小與capA相符，PCR結(jié)果如圖4所示。因此可以判定分離的3株P(guān)m為莢膜A型Pm，分別編號為TL0501-1、HN0510-1、HN0510-2。

M.DNA標準DL 1 000；1～3.TL0501-1、HN0510-1、HN0510-2；4.陽性對照M.DNA Marker DL 1 000; 1-3.TL0501-1,HN0510-1,HN0510-2; 4.Positive control

M.DNA標準DL 2 000；1.capA陽性對照；2.陰性對照；3-5.TL0501-1、HN0510-1、HN0510-2M.DNA Marker DL 2 000; 1.CapA positive control; 2.Negative control; 3-5.TL0501-1,HN0510-1,HN0510-2

2.3.3 小鼠致病性試結(jié)果 采用改良寇氏法測定了3株P(guān)m的LD50，TL0501-1 LD50為1.4×105，HN0510-1 LD50為2.2×105，HN0510-2 LD50為2.6×105。剖檢死亡小鼠，用瑞特染色鏡檢可見兩極濃染的短桿菌。

2.4 分離菌的藥物敏感性檢測及分析

采用微量肉湯稀釋法和平皿二倍稀釋法對分離菌進行了常用藥物的敏感性檢測，結(jié)果如表2所示，3株分離菌藥物敏感性相同，均對四環(huán)素、氟苯尼較敏感，對喹諾酮類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類藥物已呈不同程度耐藥性。

表2 3株分離菌的MIC結(jié)果

2.5 脈沖場凝膠電泳分型

將3株牛A型Pm基因組酶切后進行PFGE電泳，根據(jù)條帶數(shù)和所在位置,3株分離菌具具有同一譜型，證明3株菌屬于同一克隆。

M.沙門氏菌H9812分子質(zhì)量標準；1～3.分別為TL0501-1、HN0510-1、HN0510-2M.Salmonella H9812 molecular weight Marker; 1-3.TL0501-1,HN0510-1 and HN0510-2,respectively

3 討論

近年來，隨著世界肉牛產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，牲畜的異地運輸已成為生產(chǎn)過程中必不可少的環(huán)節(jié)，極大的提高了肉牛生產(chǎn)的效率，但育肥牛的運輸作為一種壓力源，已引發(fā)了經(jīng)濟和動物福利等多方面的擔憂[6-7]。其中，BRD已被認為是經(jīng)長途運輸?shù)挠逝Ｖ卸喟l(fā)的疾病，與BRD和運輸應激之間的許多假設已被提出，相關(guān)研究認為,育肥牛在運輸過程中經(jīng)受的多重壓力導致了整體免疫水平的降低，使許多病原體趁機入侵，最終導致疾病的發(fā)生[8-9]。

國內(nèi)外相關(guān)科研工作者已對運輸后BRD展開了研究，在國外，引發(fā)該病的主要病原主要為牛支原體、牛莢膜A型多殺性巴氏桿菌和睡眠嗜血桿菌等，其中混合感染病例較多[10-11]。我國BRD的主要病原與國外略有差異，在我國主要病原是牛支原體和多殺性巴氏桿菌，其他病原的混合感染并不多見[12]。本研究對某肉牛育肥場運輸后的BRD進行跟蹤調(diào)查，并對運輸后健康牛鼻腔拭子和運輸后因BRD死亡的2頭病牛進行了剖檢和病原分離，共分離到3株牛莢膜A型Pm，3株分離菌不但具有較強的小鼠致病性，還均具有同一基因型，證明其隨著肉牛的運輸發(fā)生了克隆傳播。該研究未分離到牛支原體和溶血曼氏桿菌。

多殺性巴氏桿菌引發(fā)疾病主要依賴抗菌藥物治療，但大量研究表明，隨著抗菌藥物的使用，不同國家和地區(qū)的分離菌已對臨床常用藥物呈現(xiàn)了不同的耐藥譜，為該菌引發(fā)疾病的治療造成了困擾[13-15]。為此，本研究對3株分離菌進行了常用藥物的敏感性檢測，以期優(yōu)化臨床用藥方案，結(jié)果顯示分離菌耐藥譜相同，3株菌均對新諾明、磺胺氯氰鈉及克林霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星呈現(xiàn)了不同程度的耐藥性，僅對對替米考星、四環(huán)素和氟苯尼考較敏感。值得注意的是，該場分離菌已對喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物產(chǎn)生了抗性，而該2類藥物是獸醫(yī)臨床治療BRD的首選藥?？傊?，通過該研究證明引發(fā)BRD的主要病原可隨育肥牛的異地運輸而發(fā)生傳播，為此建議在育肥牛運輸之前，應采用敏感藥物對BRD進行預防性治療。根據(jù)引發(fā)BRD病原菌及其對臨床常用藥物產(chǎn)生耐藥性的特點，我們進一步對該病主要病原菌進行跟蹤監(jiān)測，及時篩選出敏感藥物，已達到針對性治療的目的，防止因病原菌耐藥性產(chǎn)生而造成的抗感染失敗。