不同提取方法對食蟹猴糞便中結(jié)腸小袋蟲PCR檢測的影響

賀會(huì)利，謝永平*，龐彬輝，毛素梅，曾 飛

(1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001；2.廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001；3.廣西桂東靈長類開發(fā)實(shí)驗(yàn)有限公司，廣西梧州 543100)

食蟹猴(machin)屬于靈長目(Primate)猴科(Cercopithecidae)獼猴屬(Macaca)。由于其遺傳基因與人類的遺傳基因相似度可達(dá)98.5%，同時(shí)具有體型較小、性格溫順等優(yōu)點(diǎn)，因此常被作為國內(nèi)外重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究模型[1]。隨著世界科學(xué)研究中對試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度要求不斷提高，對試驗(yàn)用猴的需求增多的同時(shí)對質(zhì)量的要求也越來越高，但一些國家限制了食蟹猴的出口，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的流通數(shù)量不斷減少，這加速了廣西食蟹猴養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。在各種疫病中，寄生被認(rèn)為是最重要的問題[3]。食蟹猴感染寄生蟲后對自身造成了生理、生化以及免疫學(xué)指標(biāo)的變化，對試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成一定的干擾，為了提高實(shí)驗(yàn)猴質(zhì)量和養(yǎng)殖場的經(jīng)濟(jì)效益，必須加強(qiáng)對猴群寄生蟲的控制與凈化。

結(jié)腸小袋蟲(Balantioidescoli，B.coli)屬于纖毛蟲門、動(dòng)基裂綱、毛口目、小袋蟲科、小袋蟲屬，1857年首次從人體的糞便中發(fā)現(xiàn)該蟲體[4]。B.coli發(fā)育的過程中有滋養(yǎng)體和包囊兩種形態(tài)。滋養(yǎng)體主要以橫二分裂法增殖，蟲體極易變形，在不利的環(huán)境中形成包囊，包囊可在室溫條件下存活2月之久[5]，包囊不易受環(huán)境壓力影響，是病原體的傳播階段。由于結(jié)腸小袋蟲產(chǎn)生蛋白水解酶，會(huì)損傷結(jié)腸黏膜，蟲體利用損傷部位侵入腸壁[6]，寄生在動(dòng)物腸道，導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體腹瀉、結(jié)腸充血、出血、潰瘍和穿孔等，結(jié)腸小袋蟲是一種危害較大的人畜共患寄生性原蟲，必須給予足夠的重視[7]。目前認(rèn)為豬是主要的傳播源，主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，可感染包括人在內(nèi)的30多種動(dòng)物，人感染后可造成腸道潰瘍，甚至可轉(zhuǎn)移至呼吸道、尿生殖道、盆腔等部位寄生，造成壞死性肺、尿道感染、子宮陰道炎癥、膀胱炎等[8]。

糞便檢查對于診斷寄生蟲病有著非常重要的意義，對糞便樣品進(jìn)行人工鏡檢法是目前寄生蟲檢測常用的方法，但由于標(biāo)本量多，鏡檢速度較慢，易對操作者造成眼疲勞，并且存在一定的生物安全問題，因此常規(guī)的糞便檢查方法亟待改善[9]。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)因其較高的敏感性、特異性及能夠提供病原體在體內(nèi)存在的直接證據(jù)，在其診斷中展示了廣闊的應(yīng)用前景[10]。人們能直接從DNA分子水平上來對寄生蟲進(jìn)行相關(guān)研究，從而避開了顯微鏡觀察的過程。因此，獲得高質(zhì)量的總DNA就成為這些研究的必要前提。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集和處理 廣西地區(qū)食蟹猴飼養(yǎng)場新鮮的腹瀉猴糞樣品，采集后立即鏡檢，確定是否有結(jié)腸小袋蟲滋養(yǎng)體和包囊。

1.1.2 試劑 糞便基因組DNA提取試劑盒、通用型柱式基因組DNA提取試劑盒、蛋白酶K、酚、氯仿、異戊醇、2×TaqMasterMix (Dye)、DNA Marker DL 2000、磷酸鹽緩沖液(PBS)、TE緩沖液、十二烷基硫酸鈉(SDS)、酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶異戊醇(24∶1)、無水乙醇，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，上海捷瑞生物工程有限公司產(chǎn)品；BIOWEST凝膠瓊脂，GENE公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器 PCR儀，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，自Bio-Rad公司產(chǎn)品；超微量核酸蛋白分析儀，五洲東方公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的結(jié)腸小袋蟲序列(登錄號：MG837094.1)，利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)PCR引物，具體引物信息見表1。引物由廣州華大基因科技有限公司合成。

表1 引物

1.2.2 糞便中結(jié)腸小袋蟲DNA的提取 應(yīng)用3種不同的商品化的試劑盒，按照試劑盒說明書提取樣品中的DNA，經(jīng)典酚-氯仿法參考李霞[11]等人的操作方法進(jìn)行提取。每種方法每個(gè)樣品重復(fù)3次，提取的DNA置于-20℃保存，用于核酸含量以及分子檢測。

1.2.3 DNA含量的測定 采用核酸核酸蛋白分析儀分別對通用型柱式基因組DNA提取試劑盒，植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，糞便基因組DNA提取試劑盒和經(jīng)典酚-氯仿法4種方法抽提的DNA含量進(jìn)行測定，重復(fù)3次。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 以DNA為模板，應(yīng)用上述PCR引物(xmc-F/xmc-R，本實(shí)驗(yàn)室保存)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR體系為25 μL，分別為2×TaqMasterMix 13 μL、ddH2O 7 μL、引物各1 μL、模板DNA 3 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 45 s，65℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.5 電泳及測序 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在15 g/L 的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，然后將有目的條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、克隆、測序，準(zhǔn)確后用試劑盒進(jìn)行提取質(zhì)粒。

2 結(jié)果

2.1 核酸含量測定結(jié)果

采用核酸核酸蛋白分析儀分別對通用型柱式基因組DNA提取試劑盒，植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，糞便基因組DNA提取試劑盒和經(jīng)典酚-氯仿法4種方法抽提的DNA含量進(jìn)行測定，均值分別為25.6、32.9、42.05、12.3 ng/μL。

2.2 DNA電泳檢測結(jié)果

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠瓊脂電泳，如圖1所示，獲得了以下結(jié)果。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.通用型柱式基因組DNA提取試劑盒；2.植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)；3.糞便基因組DNA提取試劑盒；4.經(jīng)典酚-氯仿法；5.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000；1.Universal genomic DNA kit；2.Plant genomic DNA kit；3.Stool genomic DNA kit；4.The phenol-chloroform extraction method；5.Negative control

2.3 臨床應(yīng)用結(jié)果

利用糞便抽提試劑盒對68份廣西地區(qū)采集的腹瀉糞便進(jìn)行DNA提取，12份為結(jié)腸小袋蟲陽性，與鏡檢結(jié)果進(jìn)行對比驗(yàn)證，結(jié)果顯示兩者的符合率為100%(圖2)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1～22.臨床樣品檢測編號；23.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000；1-22.Clinical samples；23.Negative control

3 討論

近年來隨著動(dòng)物醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的大力發(fā)展，對實(shí)驗(yàn)猴的需求量增加，同時(shí)對其等級質(zhì)量要求也在提高，廣西因其優(yōu)越的地理位置及環(huán)境，成為全國人工養(yǎng)殖量最多的食蟹猴養(yǎng)殖基地，對其但隨著試驗(yàn)猴集約化養(yǎng)殖程度的提高，寄生蟲感染狀況也日益凸顯，食蟹猴感染寄生蟲后對自身造成了生理、生化及免疫學(xué)指標(biāo)的變化，對試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成一定的干擾[12]。研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)用猴結(jié)腸小袋蟲感染率為3.27%[13]。結(jié)腸小袋蟲感染動(dòng)物機(jī)體后可使自身免疫力下降，導(dǎo)致結(jié)腸小袋蟲的大量繁殖，造成飼料的轉(zhuǎn)化率下降，并且容易繼發(fā)細(xì)菌或病毒感染，加重病情，嚴(yán)重時(shí)可致動(dòng)物死亡，并傳播感染其他動(dòng)物，給養(yǎng)殖業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。

在非損傷性取樣材料中，動(dòng)物糞便作為分析樣品，提取其DNA進(jìn)行遺傳分析和分子生態(tài)學(xué)研究具有較好的實(shí)際意義和應(yīng)用價(jià)值[14]。自1992年糞便DNA分析技術(shù)逐步發(fā)展起來，發(fā)展了多種糞便DNA提取方法，也證實(shí)了糞便DNA分析技術(shù)的穩(wěn)定性和可行性[15]。但仍存在很多問題，首先，由于糞便材料的特殊性，糞便中動(dòng)物細(xì)胞分布不均，糞便中DNA含量少，容易降解[16]，并且其成分比較復(fù)雜，含有大量末消化的食物殘?jiān)?、膽堿等雜質(zhì)成分[17]，因糞便中干擾因素多，增加了樣品DNA的提取和基因擴(kuò)增的難度，甚至增加基因分型的錯(cuò)誤率等[18]。其次，物種和個(gè)體之間的差異導(dǎo)致各種提取方法通用性不好，致使試驗(yàn)中存在擴(kuò)增成功率低。再次，從糞便中提取總DNA的方法眾多，采用不同的提取方法獲得的DNA含量和純度也不同[19]。提取結(jié)果受到多重因素的影響，如樣品的采集的方法、保存的條件等等，忽視其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)，都會(huì)給試驗(yàn)結(jié)果帶來不利影響甚至導(dǎo)致試驗(yàn)失敗，進(jìn)而影響后續(xù)試驗(yàn)，這是阻礙糞便DNA提取技術(shù)推廣的主要原因。故基因組DNA的成功提取及穩(wěn)定的PCR反應(yīng)體系的建立成為開展該方面研究的前提。因此，針對不同的動(dòng)物應(yīng)選取不同的提取程序，并加以適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。選擇構(gòu)建一套效果好、通用性好、性價(jià)比高的糞便樣品總DNA提取方法相當(dāng)重要，可以大大推進(jìn)糞便DNA診斷技術(shù)的推廣。

為了比較不同抽提方法對結(jié)腸小袋蟲DNA的提取效率和質(zhì)量及對結(jié)腸小袋蟲PCR檢測的影響，本試驗(yàn)采用3種商品化基因組DNA提取試劑盒和經(jīng)典酚-氯仿法，分別對糞便樣品進(jìn)行DNA提取，測定濃度，作為模板，進(jìn)行PCR檢測，觀察不同抽提方法提取DNA的擴(kuò)增效果。結(jié)果顯示，4種提取方法均能擴(kuò)增出目的條帶，糞便抽提試劑盒的PCR擴(kuò)增效果最好，通過此方法獲得的DNA含量達(dá)到42.05 ng/μL。王宏等[20]通過采用糞便基因組DNA提取試劑盒對獼猴的新鮮水樣糞便進(jìn)行基因組DNA的提取，測得DNA質(zhì)量濃度也達(dá)到40 mg/L以上。單磊等[21]也證實(shí)商品化的抽提試劑盒具有一定的優(yōu)越性。同時(shí)利用糞便抽提試劑盒對68份廣西地區(qū)采集的腹瀉糞便進(jìn)行DNA提取，進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示陽性率為17.65%(12/68)，與鏡檢結(jié)果相一致。