新疆株豬圓環(huán)病毒3型Cap基因的序列分析及原核表達

任 敏，屈勇剛，魏 其，谷思穎，楊慧敏，吳圓圓，于會舉

(1.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003；2.巴音郭楞職業(yè)技術學院生物工程系，新疆庫爾勒 841002)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)在世界各國養(yǎng)豬業(yè)中普遍存在，對免疫器官有嚴重的侵害性，可導致機體免疫系統被抑制，對國內外養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失。豬圓環(huán)病毒3型(Porcine circovirus type 3，PCV3)是近年新發(fā)現的病毒，在美國報道本病與豬皮炎和腎病綜合征、繁殖障礙等臨床癥狀有關[1]，目前已有多個國家以及我國多個省市發(fā)現該病毒的存在[2-9]。2017年，在我國廣東省某豬場中首次鑒定到PCV3，隨后華中農業(yè)大學對全國11個省的樣本進行檢測，PCV3的陽性率高達68.6%。已有報道從中國21個省份(即廣東、廣西、安徽、重慶、福建、河北、河南、湖南、湖北、江蘇、江西、遼寧、沈陽、吉林、浙江、山東、甘肅、內蒙古、北京、四川和云南)的商業(yè)養(yǎng)豬場發(fā)現PCV3。該病給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的威脅，也給該病的防控工作帶來了巨大挑戰(zhàn)。豬圓環(huán)病毒Cap蛋白是病毒的結構蛋白，含有多個抗原表位，宿主細胞和病毒的結合與Cap蛋白密切相關。湛洋等[10]通過對PCV3 Cap結構及抗原性分析發(fā)現，PCV2和PCV3氨基酸同源性僅為30.0%，表現出很大的差異，推測PCV2和PCV3不具有交叉免疫保護的特性。本試驗通過擴增新疆株PCV3 Cap基因，在對Cap基因序列分析、二級結構和抗原表位預測的基礎上，構建原核重組質粒pET30a-PCV3-Cap，進行原核表達。通過人工誘導原核表達新疆株PCV3 Cap重組蛋白，可為日后PCV3的基因工程亞單位疫苗的研制和血清學診斷方法的建立提供生物學材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集新疆某豬場病死仔豬肝臟組織樣品，低溫冰箱保存待用。

1.1.2 主要試劑 大腸埃希氏菌感受態(tài)細胞Trans1-T1和E.coliBL21(DE3)、載體 pEASY-Blunt Simple和pET30a(+)，北京全式金生物技術有限公司產品；限制性內切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶、Prime STAR酶，寶生物工程(大連)有限公司產品；抗體His-Tag(27E8)Mouse mAb和Anti-mouse IgG、HRP-linked Antibody，Cell Signaling Technology公司產品；DNA回收試劑盒和質粒提取試劑盒，天根生化科技有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 PCR儀，杭州博日科技有限公司；凝膠成像分析系統，Molecular Imager公司產品；垂直電泳儀，Cleaver公司產品。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴增和克隆 根據GenBank中PCV3全基因組序列，設計1對擴增Cap全基因的引物，引物序列分別為P1:5'-GGAATTCCATATGTTAGAGAACGGACTTGTAACGA ATC -3'(下劃線處為NdeⅠ酶切位點)；P2: 5'-CCCAAGCTTATGAGACACAGA GCT ATATTCAGA-3'(下劃線處為Hind Ⅲ酶切位點)，預計擴增片段大小為645 bp，引物由北京華大基因科技有限公司合成。以PCV3陽性病料總核酸為模板，擴增PCV3 Cap基因，反應體系：Prime STAR酶25 μL，上、下游引物(P1、P2)各2 μL，模板2 μL，ddH2O補至50 μL；擴增程序：98 ℃ 30 s，55.4 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將回收的擴增產物克隆至pEASY-Blunt Simple載體，陽性質粒由北京華大基因科技有限公司測序鑒定，將測序鑒定正確的重組質粒命名為Blunt Simple-PCV3 Cap。

1.2.2 PCV3 Cap基因序列分析 使用MegAlign和MEGA 6.06軟件將本試驗所獲Cap基因核苷酸序列與國內外PCV3參考序列進行序列分析，序列比對用clustal W算法，構建系統發(fā)育樹用Neighbor-joining方法。

1.2.3 Cap蛋白結構及抗原表位預測 根據對Cap蛋白二級結構、親水性/疏水性、可及性、可塑性和抗原指數的預測與分析，并結合軟件BepiPred 2.0的結果對Cap蛋白抗原表位進行了預測。

1.2.4 pET30a-PCV3-Cap 重組質粒的構建 將1.2.1中獲得的Blunt Simple-PCV3 Cap和pET-30a(+)載體用NdeⅠ和Hind Ⅲ進行雙酶切，質粒24 μL，NdeⅠ和Hind Ⅲ限制性內切酶各4 μL，10 mol/L buffer 8 μL，用ddH2O補足50 μL。37 ℃ 酶切1.5 h，酶切產物用瓊脂糖凝膠電泳驗證，純化回收目的片段。按照T4 DNA連接酶試劑盒使用說明進行連接并轉化Trans1-T1感受態(tài)細胞。進行PCR和測序鑒定，將測序正確的重組質粒命名為pET30a-PCV3-Cap。

1.2.5 pET30a-PCV3-Cap誘導表達 將構建好的pET30a-PCV3-Cap重組質粒轉化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，然后均勻涂布到LB平板上(含50 μg/mL的硫酸卡那霉素)，之后倒置于37 ℃培養(yǎng)箱過夜，挑取單克隆，接種到4 mL的LB培養(yǎng)基中(含50 μg/mL的硫酸卡那霉素)，待培養(yǎng)至OD 600 nm為0.5～0.8，向試管培養(yǎng)液中加入終濃度0.2 mmol/L IPTG，之后分別置于15 ℃、37 ℃誘導表達16 h。

1.2.6 SDS-PAGE分析鑒定誘導表達 取誘導后的培養(yǎng)物12 000 r/min離心5 min，去除上清液，加入PBS重懸沉淀，最后加入SDS-PAGE上樣緩沖液于100 ℃下加熱樣品10 min，然后離心取上清電泳。制膠兩塊，80 V、30 mA電泳，待溴酚藍帶遷移至離凝膠底部1 cm，取出一塊凝膠用考馬斯亮藍染色液染色，隨后轉入脫色液中，脫色至背景清晰，另一塊用做Western blot鑒定。

1.2.7 Western blot鑒定 用濕轉法將蛋白轉印至NC膜，在含有50 g/L脫脂奶粉的平皿中室溫搖床上封閉2 h，鼠抗His標簽抗體(His-Tag Mouse mAb)用TBST按1∶1 000稀釋，作為一抗孵育膜2 h，抗鼠IgG抗體(Anti-mouse IgG,HRP-linked Antibody)用TBST按1∶3 000稀釋，作為二抗孵育膜1 h。進行Western blot鑒定，驗證重組蛋白的抗原性。

2 結果

2.1 目的基因擴增結果

以陽性病料總核酸為模板，P1和P2為引物，擴增出與預期大小一致的特異性條帶，為645 bp，并獲得Cap基因序列，登錄號QGM49266.1(圖1)。

M.DNA 標準DL 2 000;1.陰性對照；2.樣品M.DNA Marker DL 2 000;1.Negative control；2.Samples

2.2 PCV3 Cap基因序列分析

本試驗PCV3 Cap基因核苷酸序列與國內外參考序列對比分析，進化樹結果顯示分為兩個分支，本試驗China-Xinjiang株與俄羅斯株在同一分支，而與中國廣東株及其他國家的Cap基因序列不在同一分支(圖2)。核苷酸同源性分析可見，同源性為98.0%～98.6%，與瑞典株同源性最高98.6%，與泰國株最低98.0%(表1)。China-Xinjiang與其他國家毒株相比，一共有7個氨基酸突變位點(24、27、29、56、75、77和150)，可以看出各毒株氨基酸差異不大(表2)。

表1 PCV3 Cap核苷酸序列同源性分析

表2 PCV3 Cap氨基酸突變位點

圖2 PCV3 Cap基因遺傳進化樹

2.3 Cap蛋白結構及抗原表位預測結果

用Kyte-Doolittle方法分析了Cap結構蛋白的親水性，結果表明，在氨基酸序列的187位的W處為最大值1.633，疏水性最強，在18位的R處為最小值4.356親水性最強，表現為親水性的區(qū)域是5-31、33-46、53-78、81-83、95-104、114-147、155-160、168-181、191-203和205-209aa，總體來看，PCV3 Cap氨基酸的大部分為親水性氨基酸，所以整個多肽鏈表現為親水性(圖3)。根據對信號肽及跨膜區(qū)域的預測，結果顯示無信號肽和跨膜區(qū)域(圖4和圖5)。

圖3 PCV3 Cap氨基酸序列的疏水性/親水性分析

圖4 PCV3 Cap氨基酸序列信號肽的預測

圖5 PCV3 Cap氨基酸序列跨膜區(qū)域預測

用Chou-Farplus方法分析PCV3 Cap蛋白的二級結構，發(fā)現有3個α 螺旋區(qū)域(0-8、59-72、106-109aa) ，有8個β 折疊區(qū)域(25-31、44-51、73-94、114-123、134-137、162-167、178-193、203-214aa)(圖6)。

圖6 PCV3 Cap蛋白二級結構預測

用Emini方法預測了結構蛋白的可及性區(qū)域為8-26、31-34、37-44、54-60、68-73、78-80、97-101、119-146、167-178、191-197aa，以10-20、22-24、40、56、130和140殘基周圍可及性程度相對較高，可能位于PCV3 Cap蛋白表面(圖7)。而氨基酸殘基8-21、32-38、39-44、52-59、95-101、115-120、122-133、135-142、146-149、153-162、168-172、175-178、192-199、201-204，可能具有一定的柔韌性(圖8)。

圖7 PCV3 Cap蛋白表面可及性分析

圖8 PCV3 Cap蛋白柔性區(qū)域分析Fig.8 Protein flexible region analysis of PCV3 Cap

用Jameson-Wolf方法預測了蛋白的抗原指數，2-9、5-47、53-61、70-75、95-103、109-114、120-150、155-161、168-172、174-179和191-209aa為抗原指數較高區(qū)域(圖9)。

圖9 PCV3 Cap蛋白抗原指數分析

綜上多種方法對PCV3 Cap蛋白的預測結果，得出PCV3 Cap蛋白抗原的B細胞表位區(qū)域可能在11-17、37-41、54-60、97-101、119-134、138-140、142-146、155-160、170-172、175-181和192-202aa，或者在它們附近。

2.4 pET30a-PCV3-Cap雙酶切鑒定結果

重組質粒pET30a-PCV3-Cap經限制性內切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ進行雙酶切后，經10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，得到預期大小的2個片段(圖10)。

M.DNA 標準DL 8 000;1.pET30a-PCV3-Cap質粒；2～3.pET30a-PCV3-Cap雙酶切產物
M.DNA Marker DL 8 000;1.pET30a-PCV3-Cap plasmid；2-3.Products of pET30a-PCV3-Cap of double enzyme digestion

圖10 pET30a-PCV3-Cap雙酶切鑒定結果
Fig.10 Identification result of recombinant plasmid pET30a-PCV3-Cap withNdeⅠ andHind Ⅲ

2.5 pET30a-PCV3-Cap重組質粒PCR鑒定結果

以重組質粒pET30a-PCV3-Cap為模板，P1和P2為引物，擴增出與預期大小一致的特異性條帶，為645 bp(圖11)。

M.DNA 標準DL 2 000;1～3.pET30a-PCV3-Cap中Cap擴增片段；4.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000;1-3.PCR products of the pET30a-PCV3-Cap；4.Negative control

2.6 pET30a-PCV3-Cap的原核表達

含重組質粒pET30a-PCV3 Cap的BL21(DE3)經終濃度0.2 mmol/L IPTG 15 ℃、37 ℃誘導16 h后，按1.2.6的方法處理蛋白，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳檢測。結果顯示，全菌破菌離心后上清中無目的條帶，在沉淀中出現目的蛋白條帶，大小約32 ku。表明重組pET30a-PCV3-Cap蛋白主要以包涵體形式存在(圖12)。

M.蛋白分子質量標準; 1.全菌破菌離心后上清;0.空載體對照；2.15 ℃誘導16 h菌體裂解離心后沉淀；3.37 ℃誘導16 h菌體裂解離心后沉淀M.Protein molecular weight Marker;1.Supernatant of bacterial lysate;0.Blank vector control；2.Bacterial precipitate of pET30a-PCV3-Cap at 16 h after induction by IPTG at 15 ℃；3.Bacterial precipitate of pET30a-PCV3-Cap at 16 h after induction by IPTG at 37 ℃

2.7 Western blot鑒定

如圖13所示，DAB顯色可觀察到一條大小為32 ku的清晰條帶，表明抗His標簽抗體與pET30a-PCV3-Cap重組蛋白可以發(fā)生特異性反應。

M.蛋白分子質量標準;1.重組質粒菌pET30a-PCV3-Cap/BL21誘導后菌體裂解產物M.Protein molecular weight Marker;1.Expression product of Cap gene in E.coli BL21 transformed with pET30a-PCV3-Cap

3 討論

2016年，Phan T G等[11]的團隊發(fā)表了關于利用原核表達重組PCV3 Cap蛋白包被ELISA板建立檢測PCV3抗體的間ELISA方法。2018年，Deng J等[12]根據PCV3-Cap蛋白的生物學特性，從中截取了Cap的部分基因進行表達，從而建立了間接ELISA方法。與PCR相比，ELISA具有更大的優(yōu)勢，因為它只需要較短的操作時間且檢測速度快，因此能夠及時判定豬群中PCV3的感染情況。

本試驗得到的新疆株PCV3 Cap基因序列與俄羅斯株在同一分支，而與中國廣東株及其他國家的Cap序列不在同一分支。基因同源性分析看出同源性為98.0%～98.6%，與瑞典株同源性最高(98.6%)，與泰國株最低(98.0%)，氨基酸序列突變位點分析有7個突變位點，證明新疆株PCV3與中國廣東株及其他國家毒株有差異。

因此，在本試驗進行了新疆株PCV3 Cap基因的原核表達，通過蛋白預測，結果顯示在N末端沒有核定位信號(NLS)，也沒有跨膜區(qū)域，大部分區(qū)域為親水性，推測得出PCV3 Cap蛋白抗原的B細胞表位區(qū)域可能在11-17、37-41、54-60、97-101、119-134、138-140、142-146、155-160、170-172、175-181和192-202aa，或者在它們附近。以上結果證實，Cap是可用于檢測PCV3特異性抗體的合適靶抗原。經過對比分析發(fā)現，PCV3 Cap的NLS序列的N末端富含有大腸埃希氏菌中的低使用的密碼子編碼的精氨酸殘基，所以先進行密碼子優(yōu)化后再進行原核表達。我們選擇了目的基因表達量大而且成本低的大腸埃希氏菌原核表達系統，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳發(fā)現全菌破菌離心后上清中無目的條帶，在沉淀中出現大小約32 ku的目的蛋白條帶，說明重組pET30a-PCV3-Cap蛋白主要以包涵體形式存在，Western blot分析反應抗His標簽抗體與pET30a-PCV3-Cap重組蛋白可以發(fā)生特異性反應，說明所獲得的重組蛋白具有良好的反應原性。

一項全國性的回顧性血清學調查表明，PCV3在2015年首次被發(fā)現，并且自那時起在中國廣泛傳播。PCV3與豬皮炎腎病綜合征和繁殖障礙以及心臟和多系統炎癥有關[1,11]。然而，在沒有任何臨床癥狀的健康豬中也檢測到PCV3。必須在豬體建立PCV3感染模型，以評估其對養(yǎng)豬業(yè)的重要性。2015年-2017年中期PCV3的陽性率從22.35%增加到51.88%，表明PCV3普遍存在并且中國豬的患病率在增加[13]。為了能夠及時判定新疆豬群中PCV3的感染情況，建立ELISA方法十分必要。