干擾lncRNA FLVCR1-AS1表達(dá)通過(guò)靶向調(diào)控miR-381-3p抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

石曦雯 金 賀 羅衛(wèi)民

(廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科，廣州 510800)

前列腺癌是發(fā)生于前列腺的上皮性惡性腫瘤，其主要治療方法有手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌治療等，但晚期患者無(wú)法治愈，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，靶向基因治療成為惡性腫瘤治療的新方法[1]。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)與前列腺癌形成、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，異常表達(dá)的lncRNA可通過(guò)表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等影響前列腺癌的生物學(xué)行為[2]。貓白血病病毒C亞類受體反義RNA1(feline leukemia virus subgroup C receptor antisense RNA1，F(xiàn)LVCR1-AS1)是一種lncRNA，在膽管癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，抑制FLVCR1-AS1表達(dá)可抑制膽管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[3]。沉默F(xiàn)LVCR1-AS1通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)在細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，調(diào)控前列腺癌發(fā)生與發(fā)展[5]。研究報(bào)道伊卡利汀可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-381-3p及其靶基因UBE2C表達(dá)對(duì)前列腺癌起抑制作用[6]。miR-381-3p在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-381-3p可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。但lncRNA FLVCR1-AS1在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制是否與miR-381-3p相關(guān)目前尚未闡明。本文研究FLVCR1-AS1和miR-381-3p對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及FLVCR1-AS1是否通過(guò)miR-381-3p影響細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，為前列腺癌細(xì)胞早期診斷和治療提供新思路、新方法和新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料 正常前列腺上皮細(xì)胞株 RWPE-1和前列腺癌細(xì)胞株DU145、LNCaP、22Rv1購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RNA提取試劑盒、熒光定量試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、MTT試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；BCA試劑盒、SDS-PAGE試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；Transwell小室、Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自翊圣生物公司；載體質(zhì)粒均購(gòu)自上海伯易生物科技有限公司；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；Thermo FC酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 正常前列腺上皮細(xì)胞株RWPE-1和前列腺癌細(xì)胞株DU145、LNCaP、22Rv1用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2下培養(yǎng)，1 d/次換液，待細(xì)胞融和至約80%時(shí)，加入胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2細(xì)胞處理與分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞DU145，將si-NC、si-FLVCR1-AS1、miR-NC、miR-381-3p、pcDNA、pcDNA-FLVCR1-AS1分別轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞，分別記為si-NC組、si-FLVCR1-AS1組、miR-NC組、miR-381-3p組、pcDNA組、pcDNA-FLVCR1-AS1組；將si-FLVCR1-AS1質(zhì)粒分別與anti-miR-NC、anti-miR-381-3p共轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞，分別記為si-FLVCR1-AS1+anti-miR-NC組、si-FLVCR1-AS1+anti-miR-381-3p組。具體轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofecta-mineTM2000試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3RT-qPCR檢測(cè)miR-381-3p和FLVCR1-AS1表達(dá) 提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照熒光定量試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR檢測(cè)，miR-381-3p和FLVCR1-AS1分別以U6和GAPDH為內(nèi)參，各樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，循環(huán)條件為95℃ 10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。miR-381-3p F：5′-TACTTAAAGCGAGGTTGCCCTT-3′，R：5′-GGCAAG-CTCTCTGTGAGTA-3′；U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAG-CACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；FL-VCR1-AS1 F：5′-AGGGTTCTTGGGTCTACTTCAG-3′，R：5′-TGAGGACTTGCACTCTCTAACG-3′；GAPDH F：5′-CCCCATACACAGTGTTAGCC-3′，R：5′-GAGTGATTTTCCCGTCC-3′。

1.2.4Western blot檢測(cè)CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后提取總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次；加入二抗室溫孵育90 min，TBST洗滌3次，ECL發(fā)光法染色，ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，Quantity One凝膠分析軟件處理，檢測(cè)各組蛋白條帶吸光度，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶吸光度/GAPDH條帶吸光度。各蛋白樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.5MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，37℃培養(yǎng)4 h；1 000 r/min離心10 min，棄培養(yǎng)液，每孔加150 μl DMSO振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度。細(xì)胞活性(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.6Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104個(gè)/ml。遷移實(shí)驗(yàn)：取200 μl細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上室，下室加入500 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)48 h，去除培養(yǎng)液后用棉簽擦去上層細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并拍照，結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為遷移細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel膠與培養(yǎng)液以1∶4 混勻后平鋪于Transwell小室上室，室溫下干燥凝固后，按遷移實(shí)驗(yàn)步驟操作，顯微鏡下觀察結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.7熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FLVCR1-AS1對(duì)miR-381-3p的靶向調(diào)控 構(gòu)建FLVCR1-AS1的3′UTR野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-FLVCR1-AS1和MUT-FLVCR1-AS1，用LipofectamineTM2000將WT-FLVCR1-AS1和MUT-FLVCR1-AS1分別與miR-NC和miR-381-3p共轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞，按照說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1lncRNA FLVCR1-AS1和miR-381-3p在前列腺癌細(xì)胞和正常前列腺上皮細(xì)胞中的表達(dá) 與正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1相比，前列腺癌細(xì)胞DU145、LNCaP、22Rv1中FLVCR1-AS1表達(dá)顯著升高，miR-381-3p表達(dá)顯著降低(P<0.05，表1)。提示在前列腺癌細(xì)胞中FLVCR1-AS1呈高表達(dá)，miR-381-3p呈低表達(dá)。

表1 FLVCR1-AS1和miR-381-3p在前列腺癌細(xì)胞和正常前列腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)Tab.1 Expressions of FLVCR1-AS1 and miR-381-3p in prostate cancer cells and normal prostate epithelial

2.2干擾FLVCR1-AS1表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞增殖的影響 與si-NC組(1.02±0.09)相比，si-FLVCR1-AS1組DU145細(xì)胞中FLVCR-AS1表達(dá)(0.43±0.04)降低(P<0.05)，細(xì)胞活性、CyclinD1表達(dá)降低，p21、p27表達(dá)升高(P<0.05，表2、圖1)。提示干擾FLVCR1-AS1表達(dá)可抑制前列腺癌DU145細(xì)胞增殖。

圖1 干擾FLVCR1-AS1表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Interfering with expression of FLVCR1-AS1 on expressions of proliferation-related proteins in pros-tate cancer DU145 cellsNote:Compared with si-NC group,*.P<0.05.

表2 干擾FLVCR1-AS1表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞增殖的影響Tab.2 Effect of interference with FLVCR1-AS1 expression on proliferation of prostate cancer DU145

2.3干擾FLVCR1-AS1表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與si-NC組相比，si-FLVCR1-AS1組DU145細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著減少，MMP-2、MMP-9、MMP-14表達(dá)顯著降低(P<0.05，圖2、3)。提示干擾FLVCR1-AS1表達(dá)可抑制前列腺癌DU145細(xì)胞遷移和侵襲。

圖2 干擾FLVCR1-AS1表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞遷移、侵襲的影響(×200) Fig.2 Effect of interference with FLVCR1-AS1 expre-ssion on migration and invasion of prostate cancer DU145 cells(×200)

圖3 干擾FLVCR1-AS1表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Interfering with expression of FLVCR1-AS1 on expressions of migrative and invasive related proteins in prostate cancer DU145 cellsNote:Compared with si-NC group,*.P<0.05.

2.4miR-381-3p過(guò)表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響 與miR-NC組(0.99±0.09)相比，miR-381-3p組DU145細(xì)胞miR-381-3p表達(dá)(2.48±0.25)顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞活性顯著降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)顯著降低，p21表達(dá)水平顯著升高(P<0.05，表3、圖4、5)。提示miR-381-3p過(guò)表達(dá)可抑制前列腺癌DU145細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

圖4 miR-381-3p過(guò)表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞遷移、侵襲的影響Fig.4 Effect of miR-381-3p overexpression on migration and invasion of prostate cancer DU145 cells

圖5 miR-381-3p過(guò)表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of miR-381-3p overexpression on expressions of proliferation,migration and invasion related proteins in prostate cancer DU145 cellsNote:Compared with si-NC group,*.P<0.05.

表3 miR-381-3p過(guò)表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞增殖的Tab.3 Effect of miR-381-3p overexpression on prolif-eration of prostate cancer DU145

2.5lncRNA FLVCR1-AS1靶向調(diào)控miR-381-3p表達(dá) Targetscan軟件預(yù)測(cè)顯示FLVCR1-AS1與miR-381-3p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖6)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC組(1.02±0.09)、(1.00±0.08)相比，miR-381-3p組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-FLVCR1-AS1的DU145細(xì)胞熒光素酶活性(0.38±0.04)顯著降低(P<0.05),而轉(zhuǎn)染MUT-FLVCR1-AS1的DU145細(xì)胞熒光素酶活性(0.99±0.09)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與pcDNA組(1.01±0.09)相比，pcDNA-FLVCR1-AS1組miR-381-3p表達(dá)(0.41±0.04)顯著降低，與si-NC組(1.00±0.09)相比，si-FLVCR1-AS1組miR-381-3p表達(dá)(2.53±0.25)顯著升高(P<0.05)。提示FLVCR1-AS1可靶向調(diào)控miR-381-3p表達(dá)。

圖6 FLVCR1-AS1序列中存在與miR-381-3p互補(bǔ)的核苷酸序列Fig.6 Sequence of FLVCR1-AS1 contains a nucleotide sequence complementary to miR-381-3p

2.6抑制miR-381-3p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)干擾FLVCR1-AS1表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用 與si-NC組(1.01±0.09)相比，si-FLVCR1-AS1組DU145細(xì)胞miR-381-3p表達(dá)(2.56±0.25)顯著升高，細(xì)胞活性顯著降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)顯著降低，p21表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與si-FLVCR1-AS1+anti-miR-NC組(2.59±0.26)相比，si-FLVCR1-AS1+anti-miR-381-3p組DU145細(xì)胞miR-381-3p表達(dá)(1.63±0.16)顯著降低，細(xì)胞活性顯著升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加，CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)顯著升高，p21表達(dá)顯著降低(P<0.05,表4、5，圖7、8)。提示抑制miR-381-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾FLVCR1-AS1表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

表4 抑制miR-381-3p表達(dá)對(duì)干擾FLVCR1-AS1表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞增殖的影響Tab.4 Effect of inhibition miR-381-3p expression on interference with FLVCR1-AS1 expression on proliferation of prostate cancer DU145

圖7 抑制miR-381-3p表達(dá)對(duì)干擾FLVCR1-AS1表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞遷移、侵襲的影響Fig.7 Inhibition of miR-381-3p expression interference with FLVCR1-AS1 expression on migration and invasion of prostate cancer DU145 cellsNote:Compared with si-NC group,*.P<0.05;compared with si-FLVCR1-AS1+anti-miR-NC group,#.P<0.05.

表5 抑制miR-381-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾FLVCR1-AS1表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的作用Tab.5 Inhibition of miR-381-3p expression reversed effect of interference with FLVCR1-AS1 expression on proliferation,migration and invasion-associated protein expressions in prostate cancer DU145

圖8 抑制miR-381-3p表達(dá)對(duì)干擾FLVCR1-AS1表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of inhibition of miR-381-3p expression on interference with FLVCR1-AS1 expression on proliferation,migration and invasion-associated protein expressions in prostate cancer DU145 cellsNote:1.si-NC;2.si-FLVCR1-AS1;3.si-FLVCR1-AS1+anti-miR-NC;4.si-FLVCR1-AS1+anti-miR-381-3p.

3 討論

近年我國(guó)前列腺癌發(fā)病率逐漸上升，前列腺癌病情隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已發(fā)生轉(zhuǎn)移。前列腺癌的分子靶向治療已取得重大進(jìn)展，闡明前列腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制有助于前列腺癌治療[8]。大量研究表明lncRNA參與調(diào)控多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。敲低lncRNA FLVCR1-AS1表達(dá)可通過(guò)miR-513/YAP1通路抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程[9]。FLVCR1-AS1通過(guò)miR-155促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲，說(shuō)明FLVCR1-AS1具有抑癌作用[10]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)LVCR1-AS1在前列腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，干擾FLVCR1-AS1表達(dá)后CyclinD1表達(dá)顯著降低，p21、p27表達(dá)顯著升高，MMP-2、MMP-9、MMP-14表達(dá)顯著降低，細(xì)胞活性和遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低。CyclinD1是細(xì)胞周期中正向調(diào)節(jié)因子，p21和p27是細(xì)胞周期素依賴性激酶的抑制因子，與細(xì)胞增殖相關(guān)[11,12]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)家族成員MMP-2、MMP-9、MMP-14與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)[13]。本研究結(jié)果說(shuō)明干擾FLVCR1-AS1表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。FLVCR1-AS1可作為前列腺癌分子治療的新靶點(diǎn)和診斷、預(yù)后新的生物標(biāo)志物。

研究報(bào)道m(xù)iR-381-3p在乳頭狀甲狀腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[14]。過(guò)表達(dá)miR-381-3p通過(guò)下調(diào)FGF7抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，前列腺癌細(xì)胞中miR-381-3p呈低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-381-3p可降低細(xì)胞活性和遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)，降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)，提高p21表達(dá)。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-381-3p可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。表明miR-381-3p在前列腺癌中起抑制作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LVCR1-AS1靶向調(diào)控miR-381-3p表達(dá)，抑制miR-381-3p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)干擾FLVCR1-AS1表達(dá)對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。說(shuō)明FLVCR1-AS1可能通過(guò)調(diào)控miR-381-3p表達(dá)影響前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，干擾FLVCR1-AS1表達(dá)可通過(guò)上調(diào)miR-381-3p表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，F(xiàn)LVCR1-AS1和miR-381-3p均參與前列腺癌進(jìn)展，可通過(guò)調(diào)控其表達(dá)控制前列腺癌的惡性進(jìn)展，為前列腺癌的診斷、治療和預(yù)后改善提供新的分子生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。