lncRNA MIR4435-2HG通過靶向miR-873-5p調控小兒神經母細胞瘤細胞生物學功能①

倪文昌 金 泉 王麗艷 查運紅

(武漢市第三醫(yī)院兒科，武漢 430000)

神經母細胞瘤是兒童常見顱外實體瘤之一，占兒童癌癥相關死亡人數的15%[1]。其臨床表現廣泛，部分良性腫瘤不經化療可自行消退，其他轉移性疾病甚至對高強度治療耐藥，即使接受強化治療，最具侵襲性的神經母細胞瘤患者存活率仍低于40%[2]。神經母細胞瘤進展的機制仍有待進一步研究。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)被定義為長度超過200個核苷酸的轉錄本，與包括神經母細胞瘤在內的癌癥進展密切相關[3]。研究表明，lncRNA MIR4435-2HG可促進前列腺癌細胞遷移和侵襲[4]。上調MIR4435-2HG可提高胃癌細胞增殖、遷移、侵襲能力及小鼠的致瘤性[5]。對DNA甲基化和基因表達譜的綜合分析發(fā)現，MIR4435-2HG是導致膠質瘤進展的致癌lncRNA[6]。miR-873-5p可作為結直腸癌的腫瘤抑制因子抑制結直腸癌細胞生長、增殖、遷移和侵襲，影響細胞周期，并促進其凋亡[7]。但MIR4435-2HG和miR-873-5p對神經母細胞瘤生物學功能的影響尚未闡明。研究顯示，lncRNA有多個miRNA響應元件，如MIR4435-2HG靶向miRNA-487a促進肝癌細胞增殖[8，9]。本文探討神經母細胞瘤中MIR4435-2HG和miR-873-5p的靶向調控作用，考察MIR4435-2HG在神經母細胞瘤組織及其相應組織正常脊髓背根神經節(jié)中的表達，及其對神經母細胞瘤SK-N-SH細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，并結合miR-873-5p闡明潛在的作用機制[10]。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞與主要試劑 神經母細胞瘤SK-N-SH細胞、人臍靜脈內皮細胞HUVEC購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，MEM培養(yǎng)基、F12K培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000購自美國invitrogen公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；RT-qPCR相關檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；si-MIR4435-2HG、pcDNA-MIR4435-2HG、miR-873-5p、anti-miR-873-5p、熒光素酶報告載體購自上海GenePharma公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司；細胞核相關抗原(nuclear associated antigen Ki67，Ki-67)、細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved Caspase-3)、活化的多聚ADP-核糖聚合酶(Cleaved poly ADP-ribose polymerase，Cleaved PARP)、基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotease-2，MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京中杉金橋公司。

1.1.2組織標本來源 34例組織標本來源于武漢市第三醫(yī)院2015年6月～2019年6月因神經母細胞瘤接受手術治療的患者，新鮮標本取材后立即置于液氮中凍存用于qPCR檢測。所有患者經病理學確診為神經母細胞瘤，患者或家屬知情同意。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與轉染 人臍靜脈內皮細胞HUVEC加入含有10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基，SK-N-SH細胞加入含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2孵育，每周換液2～3次，1∶3進行細胞傳代。選取對數生長期SK-N-SH細胞，以適當密度接種于6孔板，待細胞生長至70%融合時，利用Lipofectamine 2000試劑將si-MIR4435-2HG、pcDNA-MIR4435-2HG、miR-873-5p、anti-miR-873-5p及其陰性對照轉染至SK-N-SH細胞，轉染48 h后收集細胞檢測。

1.2.2qPCR檢測lncRNA MIR4435-2HG和miR-873-5p表達 按照說明書進行，采用TRIzol試劑提取組織或細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，進行qPCR反應，引物序列：lncRNA MIR4435-2HG F：5′-TGATAAAGGGCTCTGAAAGC-3′，R：5′-CACGATGCCTTCACCAGTGT-3′；miR-873-5p F：5′-TGTGCATTTGCAGGAACTTGT-3′，R：5′-GGGAACTCATCAGTCT-CCTGTTC-3′；U6 F：5′-ACACCAAGCAGTCCGAAG-AG-3′，R：5′-ACAAAATTTCTCACGCCGGT-3′。2-ΔΔCt法計算lncRNA MIR4435-2HG和miR-873-5p表達。

1.2.3MTT檢測SK-N-SH細胞增殖 轉染后的SK-N-SH細胞經胰酶消化后，1×104個/ml接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后加入MTT溶液100 μl，培養(yǎng)4 h，加入DMSO 200 μl劇烈反應10 min，酶標儀測定490 nm處SK-N-SH細胞吸光度(OD)，計算細胞存活率(%)=(OD對照組-OD實驗組)/OD對照組×100%。

1.2.4流式細胞術檢測SK-N-SH細胞凋亡 離心后收集SK-N-SH細胞1×105個，根據Annexin V-FITC 凋亡試劑盒說明書操作，加入500 μl緩沖液重懸細胞，依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，混勻，室溫避光反應15 min，流式細胞術測定細胞凋亡。

1.2.5Western blot檢測Ki-67、CDK2、Cleaved Cas-pase-3、Cleaved PARP、MMP-2和MMP-9蛋白表達 采用RIPA裂解液提取SK-N-SH細胞總蛋白，吸取20 μg蛋白樣品，10%SDS-PAGE電泳分離，轉移至PVDF膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Ki-67、CDK2、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、MMP-2、MMP-9一抗，4℃孵育過夜，次日采用TBST充分漂洗，加入二抗孵育2 h，TBST充分漂洗，ECL顯影，以β-actin為內參計算蛋白表達。

1.2.6Transwell檢測SK-N-SH細胞遷移和侵襲 在SK-N-SH細胞遷移實驗中，調整細胞密度為5×105個/ml，吸取100 μl接種于Transwell小室上室，下室加入500 μl含血清培養(yǎng)基，37℃孵育24 h，無菌棉簽拭去多余細胞甲醛固定15 min，結晶紫染色15 min，顯微鏡下觀察、計數。在SK-N-SH細胞侵襲實驗中，將Matrigel膠與無血清培養(yǎng)基以1∶5 充分混合，吸取100 μl于小室上室，37℃靜置3～4 h。其余操作同上。

1.2.7雙熒光素酶報告實驗檢測lncRNA MIR4435-2HG與miR-873-5p靶向關系 采用starBase網站預測lncRNA MIR4435-2HG與miR-873-5p的靶向結合關系，發(fā)現二者含有互補核苷酸序列。分別建立含有miR-873-5p結合位點的MIR4435-2HG 3′UTR區(qū)野生型(WT-MIR4435-2HG)與突變型(MUT-MIR4435-2HG)報告基因的質粒，利用Lipofectamine 2000試劑將其與miR-873-5p、miR-con共轉染，轉染48 h后測定雙熒光素酶活性。

2 結果

2.1lncRNA MIR4435-2HG和miR-873-5p在神經母細胞瘤組織和正常脊髓背根神經節(jié)中的表達 RT-qPCR結果顯示，與正常脊髓背根神經節(jié)相比，神經母細胞瘤組織MIR4435-2HG表達顯著升高，miR-873-5p表達顯著降低(P<0.05，表1)；與HUVEC細胞相比，SK-N-SH細胞MIR4435-2HG表達顯著升高，miR-873-5p表達顯著降低(P<0.05，表2)。

表1 lncRNA MIR4435-2HG和miR-873-5p在神經母細胞瘤組織和正常脊髓背根神經節(jié)的表達Tab.1 Expressions of lncRNA MIR4435-2HG and miR-873-5p in neuroblastoma tissues and normal spinal dorsal root

表2 lncRNA MIR4435-2HG和miR-873-5p在HUVEC細胞和SK-N-SH細胞中的表達Tab.2 Expressions of lncRNA MIR4435-2HG and miR-873-5p in HUVEC and SK-N-SH

2.2沉默MIR4435-2HG抑制SK-N-SH細胞增殖，誘導其凋亡 MTT檢測結果顯示，與si-con組相比，沉默MIR4435-2HG明顯降低SK-N-SH細胞存活率(P<0.05)。流式細胞術檢測結果發(fā)現，相比于si-con組，沉默MIR4435-2HG顯著提高SK-N-SH細胞凋亡率(P<0.05)，Western blot檢測結果表明，同si-con組相比，沉默MIR4435-2HG明顯降低細胞Ki-67、CDK2蛋白表達，并提高Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP蛋白水平(P<0.05)。見圖1、表3。

表3 沉默MIR4435-2HG對SK-N-SH細胞增殖和凋亡的影響Tab.3 Effect of silencing MIR4435-2HG on SK-N-SH cell proliferation and

圖1 沉默MIR4435-2HG對SK-N-SH細胞增殖凋亡、凋亡相關蛋白表達的影響Fig.1 Effect of silencing MIR4435-2HG on SK-N-SH cell proliferation apoptosis and expressions of apoptosis-related proteins

2.3沉默MIR4435-2HG抑制SK-N-SH細胞遷移和侵襲 Transwell檢測結果顯示，與si-con組相比，沉默MIR4435-2HG顯著降低SK-N-SH細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達，細胞遷移和侵襲數降低減少(P<0.05，表4、圖2)。

圖2 Western blot檢測MMP-2和MMP-9蛋白表達Fig.2 Western blot detection of MMP-2 and MMP-9 proteins expressionsNote:1.NC；2.si-con;3.si-MIR4435-2HG.

表4 沉默MIR4435-2HG對SK-N-SH細胞遷移和侵襲的影響Tab.4 Effect of silencing MIR4435-2HG on SK-N-SH cell migration and

2.4MIR4435-2HG靶向調控miR-873-5p表達 star-Base預測發(fā)現，lncRNA MIR4435-2HG與miR-873-5p部分核苷酸序列可形成互補配對(圖3)。雙熒光素酶報告實驗表明，與miR-con組相比，miR-873-5p明顯降低WT-MIR4435-2HG熒光素酶相對活性(P<0.05)，而不影響MUT-MIR4435-2HG熒光素酶相對活性(表5)。與si-con組相比，si-MIR4435-2HG組miR-873-5p表達顯著上升，pcDNA-MIR4435-2HG組比pcDNA組顯著降低(P<0.05，表6)。

表5 雙熒光素酶報告實驗Tab.5

表6 lncRNA MIR4435-2HG對miR-873-5p表達的影響Tab.6 Effect of lncRNA MIR4435-2HG on miR-873-5p

圖3 lncRNA MIR4435-2HG與miR-873-5p靶向關系預測Fig.3 Targeting relationship prediction of lncRNA MIR4435-2HG and miR-873-5p

2.5轉染miR-873-5p抑制SK-N-SH細胞增殖、遷移、侵襲并誘導其凋亡 與miR-con組相比，SK-N-SH細胞轉染miR-873-5p可明顯降低細胞存活率、遷移數、侵襲數和Ki-67、CDK2、MMP-2、MMP-9蛋白表達，并顯著提高細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表達(P<0.05，表7、圖4A)。

表7 轉染miR-873-5p對SK-N-SH細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響Tab.7 Effect of transfection of miR-873-5p on SK-N-SH cell proliferation,migration,invasion and

2.6干擾miR-873-5p表達部分逆轉沉默lncRNA MIR4435-2HG對SK-N-SH細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與si-MIR4435-2HG和anti-miR-con共轉染組相比，si-MIR4435-2HG和anti-miR-873-5p共轉染可明顯提高SK-N-SH細胞存活率、遷移數、侵襲數、Ki-67、CDK2、MMP-2和MMP-9蛋白表達，顯著降低細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表達(P<0.05，表8、圖4B、C)。

圖4 Western blot檢測SK-N-SH細胞Ki-67、CDK2、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、MMP-2和MMP-9蛋白表達Fig.4 Western blot detection of Ki-67,CDK2,Cleaved Caspase-3,Cleaved PARP,MMP-2 and MMP-9 proteins expressions in SK-N-SH cells

表8 干擾miR-873-5p和沉默lncRNA MIR4435-2HG對SK-N-SH細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響Tab.8 Effects of interference with miR-873-5p and silencing lncRNA MIR4435-2HG on proliferation,migration,invasion and apoptosis of SK-N-SH

3 討論

神經母細胞瘤是一種發(fā)生于交感神經系統的胚胎癌，是嬰兒出生后1年內最常見惡性腫瘤。在15歲以下兒童中，神經母細胞瘤約占所有惡性腫瘤的8%。盡管多種治療方法對神經母細胞瘤有效，但患者5年存活率僅為70%，尤其是高危神經母細胞瘤患者的治愈率仍低于40%[11]。且患者生活受到終身的嚴重影響，是家庭和公眾健康的巨大負擔和挑戰(zhàn)，但神經母細胞瘤的發(fā)病機制尚未闡明。

最近報道指出，lncRNA在神經母細胞瘤的發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用，如XIST、RMRP、MAGI2-AS3等[12-14]。本研究發(fā)現，MIR4435-2HG在神經母細胞瘤中表達上調，已有研究表明，MIR4435-2HG在前列腺癌、肝癌、胃癌等腫瘤組織中表達上調，已被證實為胃癌、肝癌等的致癌lncRNA，可促進癌癥進展[5，9]。MIR4435-2HG在肺癌組織中高表達，并與組織學分級和淋巴結轉移相關，其下調可抑制肺癌細胞增殖和體內外侵襲，高表達MIR4435-2HG可促進肺癌細胞增殖與侵襲[15]。本研究中，與正常脊髓背根神經節(jié)相比，神經母細胞瘤組織中MIR4435-2HG表達上調，MIR4435-2HG在神經母細胞瘤細胞中表達上調。提示MIR4435-2HG可能參與神經母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展。沉默MIR4435-2HG可明顯降低SK-N-SH細胞存活率、細胞遷移數、侵襲數、Ki-67、CDK2、MMP-2和MMP-9蛋白表達，顯著提高細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白水平，說明沉默其表達可抑制神經母細胞瘤細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡，MIR4435-2HG在神經母細胞瘤中可能充當致癌基因，與既往研究結論一致[5,9,16]。

研究表明，miRNA失調影響包括神經母細胞瘤在內的人類癌癥的生物學過程[16-19]。miR-873-5p是miRNA家族成員，已被證實在部分人類癌癥中具有抑癌作用[20]。Li等[21]學者檢測到結直腸癌細胞中miR-873-5p呈低表達，miR-873-5p過表達可抑制結直腸癌細胞遷移、侵襲和上皮-間質轉化。miR-873-5p是一種腫瘤抑制因子，可抑制結腸癌細胞增殖、集落形成和侵襲，阻止結腸癌細胞體內外轉移[22]。胃癌組織中miR-873-5p表達下降，過表達miR-873-5p可降低胃癌細胞活力，導致細胞凋亡和細胞周期阻滯[23]。本實驗RT-qPCR檢測結果顯示，神經母細胞瘤組織和細胞中miR-873-5p表達下調。SK-N-SH細胞中轉染miR-873-5p可明顯降低細胞存活率、遷移數、侵襲數和Ki-67、CDK2、MMP-2、MMP-9蛋白表達，并顯著提高細胞凋亡率、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表達，與既往研究結論相同。miR-873-5p在神經母細胞瘤中同樣為抑癌基因，抑制神經母細胞瘤細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡。為進一步探索MIR4435-2HG影響神經母細胞瘤生物學功能的分子機制，本研究采用生物學信息工具預測MIR4435-2HG與miR-873-5p存在靶向結合位點，推測MIR4435-2HG可能通過靶向調控miR-873-5p發(fā)揮作用。雙熒光素酶報告和RT-qPCR實驗證實miR-873-5p是MIR4435-2HG的功能性靶基因之一。另外，共轉染si-MIR4435-2HG和anti-miR-873-5p發(fā)現，干擾miR-873-5p可部分逆轉沉默MIR4435-2HG對SK-N-SH細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。沉默MIR4435-2HG通過功能實驗研究MIR4435-2HG對神經母細胞瘤SK-N-SH細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學功能的影響，靶向調控miR-873-5p表達是研究MIR4435-2HG在神經母細胞瘤中發(fā)揮生物學功能的分子機制，后者在前者的基礎上進一步探索，共同解釋了MIR4435-2HG的功能和意義。說明MIR4435-2HG通過直接靶向miR-873-5p調控神經母細胞瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲。

綜上所述，MIR4435-2HG在神經母細胞瘤中表達上調，沉默MIR4435-2HG表達可抑制神經母細胞瘤細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡，其作用機制與靶向調控miR-873-5p表達密切相關，為神經母細胞瘤的臨床診治提供有價值的生物學標志物和靶點。