氟西汀對(duì)抑郁癥模型小鼠Treg細(xì)胞的影響①

馬博乙 張 靜 吳玉婷 張博文 曹雅明 李 成

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，沈陽(yáng) 110000)

抑郁癥是臨床上常見的精神障礙性疾病之一，其發(fā)病率高，流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示抑郁癥在我國(guó)發(fā)病率高達(dá)5%。抑郁癥具體的發(fā)病機(jī)制仍然不是非常明確。最近，關(guān)于抑郁癥與免疫之間的相關(guān)研究有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。有人提出抑郁癥可能是由細(xì)胞因子分泌引起的免疫系統(tǒng)改變，并且已經(jīng)在抑郁患者中觀察到T輔助(Th)細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子的變化，例如血漿中IFN-γ增加，CD4/CD8比率增加和淋巴細(xì)胞對(duì)有絲分裂原的增殖反應(yīng)降低等[1]。此外在抑郁癥患者中發(fā)現(xiàn)Th1/Th2細(xì)胞因子的比例更加偏向Th1細(xì)胞因子；血漿IFN-γ/IL-4比例(Th1/Th2比率)水平均較高[2]。然而，也有研究表明，抑郁癥患者和對(duì)照組之間的外周血淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量沒(méi)有差異[3]。因此，CD4+T細(xì)胞在抑郁癥中的確切表現(xiàn)和作用還有待研究。

目前臨床上用于治療單相抑郁癥的藥物主要為選擇性五羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitor,SSRIs)，代表藥物是氟西汀。相關(guān)研究表明，氟西汀可減少絲裂原誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖[4]。另外，在正常小鼠中用氟西汀治療4周后，發(fā)生T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫增強(qiáng)[5]。所以T細(xì)胞在抑郁癥發(fā)展中的作用以及T細(xì)胞和其亞群的狀態(tài)仍有待確定。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)目前已被廣泛接受的慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)法制備小鼠抑郁癥模型，并選用氟西汀治療，探討氟西汀對(duì)抑郁癥小鼠T細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子的影響，為治療抑郁癥拓展新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性C57BL/6J小鼠，SPF級(jí)，8周齡，體質(zhì)量20～24 g，購(gòu)自沈陽(yáng)艾科賽斯生物科技有限公司。

1.1.2試劑和儀器 氟西汀(Sigma公司)；FoxP3等抗體(Bioss公司)；酶標(biāo)儀，流式細(xì)胞儀(Thermo公司)；免疫組化試劑盒(UltraSensitive S-P超敏試劑盒)、DAB顯色試劑盒(邁新生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1CUMS抑郁模型建立 本實(shí)驗(yàn)采用CUMS建立抑郁模型[6，7]。將空籠17 h、斜籠45° 17 h、濕籠17 h、食物剝奪14 h、夜間光照12 h、熱水游泳5 min、飲水剝奪16 h、夾尾5 min共8種刺激隨機(jī)安排到28 d內(nèi)，每日2種，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，使小鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生。對(duì)照組正常飼養(yǎng)，未給予刺激。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，室內(nèi)溫濕度恒定，通風(fēng)良好，自由進(jìn)食。正常飼養(yǎng)，未給予刺激的小鼠為A組(每組6只)：對(duì)照組。正常小鼠給予氟西汀注射(6只)為B組。CUMS建模結(jié)束后，將CUMS組小鼠分為2組(每組6只)分別為C組：CUMS模型組；D組：CUMS模型+氟西汀組。CUMS建模28 d后，A組和C組：給予生理鹽水0.5 ml/d腹腔注射；B組和D組：每天給予氟西汀10 mg/kg溶于0.5 ml生理鹽水中腹腔注射，治療持續(xù)3周。

1.2.3行為學(xué)評(píng)價(jià) 建模開始前和建模結(jié)束后分別進(jìn)行小鼠的行為學(xué)測(cè)定。①體質(zhì)量測(cè)量：于8∶00進(jìn)行小鼠體質(zhì)量測(cè)量。②攝食實(shí)驗(yàn)：早上9∶00添加食物約20 g，次日9∶00稱食物余量，同時(shí)稱動(dòng)物體質(zhì)量，計(jì)算24 h攝食比[攝食比=(食物總量一食物余量)/體質(zhì)量×100%]。③糖水偏好測(cè)試實(shí)驗(yàn)：該實(shí)驗(yàn)是用來(lái)檢測(cè)抑郁模型中快感缺失的指標(biāo)，快感缺乏是抑郁癥患者的核心癥狀之一[8]。具體操作為：首先進(jìn)行糖水適應(yīng)的訓(xùn)練，前24 h每個(gè)鼠籠放置兩瓶1%蔗糖水，24 h后將其中的一瓶換為純水。適應(yīng)之后進(jìn)行測(cè)試：每籠各放置 1% 蔗糖溶液和純水各一瓶，小鼠自由取水，禁食。12 h后測(cè)量剩余液體體積，記錄蔗糖水、純水及總液體消耗，計(jì)算糖水偏好。糖水偏好百分比(%)=糖水消耗量/液體總消耗量×100%。

1.2.4樣品采集 給藥結(jié)束后，每組取3只小鼠取眼球血，室溫自然凝固60 min，2 000 r/min離心20 min，仔細(xì)收集上清，-20℃保存?zhèn)溆?。每組再取3只小鼠用3%水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露心臟，以等滲生理鹽水經(jīng)左心室灌注沖洗后，用4%多聚甲醛溶液灌注，結(jié)束后取脾臟，置于4%多聚甲醛溶液中備用。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù) 檢測(cè)脾組織中調(diào)節(jié)T細(xì)胞(regulatory cells,Treg)的活化作用，選取脾細(xì)胞1×107個(gè)放入含有50 ng/ml PMA和1 mmol/L ionomycin的24孔板在5% CO2，37℃條件下刺激6 h，并加入Golgi stop reagent(2 μmol/L)用以封閉細(xì)胞因子的分泌。Tregs細(xì)胞標(biāo)記選取(CD4+CD25+Foxp+Treg細(xì)胞)，細(xì)胞培養(yǎng)之后，取所有脾細(xì)胞先進(jìn)行FITC-anti-CD4和PerCP-anti-CD25細(xì)胞膜表面染色，在固定和透膜后用APC-anti-Foxp3抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，其固定及透膜方法如上所述。染色結(jié)束細(xì)胞PBS洗滌后重懸4℃保存，待流式細(xì)胞儀檢測(cè)。所有染色細(xì)胞用FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，各組均設(shè)抗體單標(biāo)記及陰性對(duì)照，細(xì)胞檢測(cè)數(shù)為1×105個(gè)。用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6免疫組化 取固定結(jié)束的脾臟組織制作蠟塊及切片(厚度5 μm)，常規(guī)脫蠟脫水，免疫組化染色采用UltraSensitive S-P超敏試劑盒，DAB顯色，脫水封片。數(shù)據(jù)處理采用Image-Pro-Plus 6.0分別計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞比例。

2 結(jié)果

2.1行為學(xué)評(píng)價(jià) 應(yīng)激前(實(shí)驗(yàn)第0天)CUMS組小鼠體質(zhì)量、攝食比、糖水偏好與對(duì)照組均無(wú)明顯差異(P>0.05)，應(yīng)激后CUMS組的體質(zhì)量、攝食比、糖水偏好均明顯低于未進(jìn)行應(yīng)激實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組(第28天)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明CUMS抑郁建模成功，如表1。

表1 實(shí)驗(yàn)第0天及第28天對(duì)照組與CUMS建模組小鼠體質(zhì)量、攝食比、糖水偏好測(cè)定Tab.1 Body weight,food consumption ratio and sucrose preference stress in control group and CUMS model group were measured at 0 day and 28

2.2CUMS模型組及氟西汀治療組脾臟形態(tài)學(xué)改變 脾組織HE染色發(fā)現(xiàn)CUMS組脾組織結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變脾臟白髓萎縮，脾索結(jié)構(gòu)不清晰，脾小梁斷裂，如圖1。

圖1 HE染色Fig.1 HE stainingNote:*.White pulp.

2.3免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Treg細(xì)胞亞群變化 免疫組化結(jié)果顯示，CUMS模型組Foxp3陽(yáng)性率明顯高于CUMS+氟西汀治療組和對(duì)照組(P<0.05)；CUMS+氟西汀治療組Foxp3陽(yáng)性率略高于對(duì)照組；正常鼠給予氟西汀治療后Foxp3陽(yáng)性率比對(duì)照組明顯增加(P<0.05)，如圖2、表2。

表2 脾臟免疫組化Foxp3陽(yáng)性率細(xì)胞百分比Tab.2 Percentage of positive cells positive for Foxp3 in

圖2 CUMS抑郁癥模型組、氟西汀治療組及對(duì)照組Foxp3免疫組化染色Fig.2 CUMS depression model,fluoxetine-treated group and control group Foxp3 immunohistoche-mical stainingNote:A.Control+fluoxetine-treated;B.Control group;C.CUMS+fluoxetine-treated group;D.CUMS group.

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)檢測(cè)Treg細(xì)胞數(shù)量 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CUMS組小鼠與對(duì)照組相比Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比無(wú)顯著差異(P>0.05)；而CUMS+氟西汀治療組明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如表3及圖3。

表3 脾臟中Treg細(xì)胞數(shù)量占CD4+T細(xì)胞百分比Tab.3 Number of Treg cells in the spleen accounts for percentage of CD4+T

圖3 CUMS抑郁癥模型組及氟西汀治療組 Treg細(xì)胞亞群的改變Fig.3 Changes of subpopulation of Treg cells in CUMS depression model group and fluoxetine-treated group

3 討論

T細(xì)胞是體內(nèi)發(fā)揮免疫功能的關(guān)鍵免疫細(xì)胞，根據(jù)其表面分子表達(dá)不同，可以分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，其中CD4+T細(xì)胞主要發(fā)揮輔助和調(diào)節(jié)功能，故也稱為輔助性T細(xì)胞，可分為不同的亞群，如Th1、Th2、Th17 和Treg等。之前有研究表明，輕度的應(yīng)激會(huì)激活Th2細(xì)胞，相反，長(zhǎng)期反復(fù)的刺激壓力會(huì)激活Th1細(xì)胞[9]。近年來(lái)，Th17和Treg細(xì)胞之間的平衡受到了越來(lái)越多的關(guān)注。Th17細(xì)胞可以促進(jìn)小鼠的自身免疫，并且與人類炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，而Tregs控制由正常菌群引發(fā)的免疫反應(yīng)和炎癥[10]。有研究表明，在CUMS誘導(dǎo)的抑郁癥模型小鼠體內(nèi)Th17及Treg細(xì)胞亞群發(fā)生改變，但該研究沒(méi)有繼續(xù)研究CUMS小鼠使用抗抑郁藥物后的T細(xì)胞亞群的變化[11]。Tregs，也稱為抑制性T細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3+Tregs)，可抑制過(guò)度的免疫應(yīng)答并介導(dǎo)免疫耐受。

在本實(shí)驗(yàn)中，使用CUMS法誘導(dǎo)抑郁癥的小鼠模型并使用氟西汀對(duì)其進(jìn)行治療，小鼠的體重及糖水偏好實(shí)驗(yàn)證實(shí)CUMS法誘導(dǎo)抑郁癥模型有效。氟西汀治療小鼠與正常小鼠行為學(xué)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，治療小鼠的糖水偏好沒(méi)有差異即快感消失癥狀有改善。

HE染色觀察脾臟形態(tài)發(fā)現(xiàn)CUMS組小鼠脾臟結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，白髓萎縮，脾索結(jié)構(gòu)不清晰，脾小梁斷裂。猜測(cè)免疫器官正常形態(tài)和功能的改變是造成重度抑郁癥患者免疫力下降的重要原因。免疫組化結(jié)果顯示：CUMS+氟西汀治療組和對(duì)照組Foxp3陽(yáng)性率均明顯低于CUMS模型組；正常鼠給予氟西汀治療后Foxp3陽(yáng)性率比對(duì)照組明顯增加，猜測(cè)抑郁癥發(fā)生過(guò)程中小鼠免疫應(yīng)答處于抑制狀態(tài)，可以解釋情緒低落時(shí)人疾病易感性增強(qiáng)，而在氟西汀治療后這種抑制狀態(tài)被打破。流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，CUMS組小鼠與對(duì)照鼠相比Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比無(wú)顯著差異(P>0.05)；而CUMS+氟西汀治療組明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，文獻(xiàn)報(bào)道，在CUMS的后期階段，CD3+CD8-IL-17+的Th17細(xì)胞的比例顯著降低[12]。同時(shí)，在Treg特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)含量升高，尤其在第14天發(fā)生了顯著增加。提示Tregs可能是參與抑郁癥免疫抑制的關(guān)鍵細(xì)胞類型。但在該文獻(xiàn)中，CUMS第21天時(shí)抑郁癥模型組與對(duì)照組Treg細(xì)胞百分比與對(duì)照組無(wú)明顯差異，提示Treg細(xì)胞在抑郁癥模型組發(fā)揮功能具有時(shí)間限制性。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表明 Treg細(xì)胞除了受時(shí)間限制外，也很大程度上受到氟西汀治療的影響。此外，還發(fā)現(xiàn)給予正常小鼠氟西汀后小鼠脾臟中的Treg細(xì)胞明顯增加，可能是由于Foxp3不僅僅表達(dá)在Treg細(xì)胞中造成陽(yáng)性率有增高，還可能氟西汀增強(qiáng)免疫后小鼠體內(nèi)CD4+免疫細(xì)胞總數(shù)有明顯增加所致[13，14]。

綜上所述，在小鼠CUMS抑郁模型中，行為學(xué)的改變可能與Treg細(xì)胞的比例失調(diào)相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為Treg細(xì)胞在抑郁癥中的作用提供了新角度，并且為抑郁癥的治療提供了新靶點(diǎn)。研究T細(xì)胞亞群與神經(jīng)因子之間的關(guān)系將有助于理解免疫細(xì)胞在抑郁癥中發(fā)揮的作用。