一種新的液體活檢技術(shù)在食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群早期食管癌篩查中的應(yīng)用

程 錕，趙學(xué)科，周福有，王盼盼，鐘 侃，胡景峰，宋 昕，王 偉，李欣然，楊苗苗，徐瑞華，魏夢霞，韓文莉，雷玲玲，孟超龍，胡守佳，王建坡，王能超，鮑啟德，王立東#

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省食管癌重點開放實驗室、省部共建食管癌防治國家重點實驗室，河南 鄭州450052；2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，河南 鄭州 450052；3.安陽市腫瘤醫(yī)院胸外科，河南 安陽 455000；4.安陽市腫瘤醫(yī)院腫瘤防治辦公室，河南 安陽 455000；5.安陽市腫瘤醫(yī)院放療科，河南 安陽 455000；6. 濮陽安陽地區(qū)醫(yī)院腫瘤科，河南 安陽 455000)

食管癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均較高，我國為食管癌高發(fā)區(qū)[1]。我國是食管鱗癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，據(jù)統(tǒng)計我國每年大約有25萬新增確診病例,占全世界食管鱗癌新增病例總數(shù)的一半以上[2]。目前，色素內(nèi)鏡和黏膜活檢是食管鱗癌早期發(fā)現(xiàn)的重要篩查方法[3]。但是，內(nèi)鏡篩查有創(chuàng)傷、成本高、效率低，這些限制了內(nèi)鏡篩查在無癥狀人群中的推廣應(yīng)用。而且，食管上皮高級別內(nèi)瘤變(重度不典型增生)和早期浸潤癌患者均無特異癥狀，導(dǎo)致這些患者臨床上發(fā)現(xiàn)率極低[4]。換言之，一旦出現(xiàn)食管癌特異癥狀(進(jìn)行性吞咽困難)多數(shù)就診時已為中晚期，失去最佳就診時間。這是食管癌死亡率居高不下的主要原因之一[5]。如何發(fā)現(xiàn)這些無特異癥狀的患者是食管癌防治研究領(lǐng)域亟待解決的難題。本研究報道一組無癥狀高危人群篩查和早期發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)抗原自身抗體液體活檢技術(shù)，并進(jìn)一步分析在食管癌高發(fā)區(qū)進(jìn)行推廣應(yīng)用的初步結(jié)果，為食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群食管癌前病變和早期癌篩查提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象第1組為來自省部共建食管癌防治國家重點實驗室收集的160例血清樣本。其中正常人血清80例(對照組)來自該實驗室合作醫(yī)院體檢中心的健康體檢人群，無任何腫瘤相關(guān)的證據(jù)；早期食管癌患者血清80例(食管癌組)。80例正常人中，男43例，女37例，年齡(51.72±10.79)歲。80例早期食管癌患者血清來自經(jīng)組織病理學(xué)證實的早期(0期+Ⅰ期)食管癌患者，均未接受放療和化療，男57例，女23例，年齡(61.84±6.92)歲。利用間接酶聯(lián)免疫法檢測腫瘤相關(guān)抗原自身抗體增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅱ(transforming growth factor β receptor，TβRⅡ)和著色性干皮病基因組C(xeroderma pigmentosum group C，XPC)，通過檢測早期食管癌患者和正常人血清中這一組相關(guān)腫瘤抗原自身抗體的水平，明確該組腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合檢測食管癌的效能。

第2組人群為在食管癌高發(fā)地區(qū)河南省安陽市文峰區(qū)魏家營村進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，自愿接受流行病學(xué)調(diào)查、血清學(xué)腫瘤相關(guān)抗原自身抗體檢查和色素內(nèi)鏡檢查的無癥狀人群518例，男249例，女269例，年齡(51.87±10.48)歲，所有無癥狀人群均接受血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體檢查和色素內(nèi)鏡檢查。

第3組人群來自食管癌高發(fā)區(qū)河南省新鄉(xiāng)市獲嘉縣進(jìn)行食管癌大規(guī)模篩查，對21 428例35歲以上無癥狀人群行血清學(xué)腫瘤相關(guān)抗原自身抗體檢測，其中男10 728例，女10 700例，年齡(51.97±10.31)歲。對檢測結(jié)果為陽性者進(jìn)行色素內(nèi)鏡檢查。

1.2 實驗方法

1.2.1 血樣采集與保存 每例研究對象均填寫基本信息調(diào)查表并體檢。每例研究對象均取空腹靜脈血5 mL，之后將其置于離心管內(nèi)，在室溫下靜置30 min后以2 000 r/min離心20 min，吸取血清，每管100 μL分裝，液氮保存。

1.2.2 血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體檢測 使用本實驗室已經(jīng)建立的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清腫瘤相關(guān)性原自身抗體，各包被抗原的稀釋終濃度為0.5 μg/μL，血樣稀釋濃度為150，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG稀釋濃度為15 000。在酶聯(lián)免疫吸附試驗板孔中加入用包被稀釋液稀釋過的抗原100 μL/孔，4 ℃過夜(24 h以上)。加入稀釋后的患者血清100 μL/孔，每例樣品至少做2次檢查，37 ℃孵育。已知陽性的血清作為陽性對照，包被緩沖液作為陰性對照。加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG 100 μL/孔，37 ℃孵育。加入四甲基聯(lián)苯胺-過氧化氫尿素顯色液，100 μL/孔，置37 ℃避光反應(yīng)，當(dāng)陽性對照出現(xiàn)明顯顏色變化后，每孔加入終止液50 μL終止反應(yīng)，并在酶聯(lián)免疫吸附試驗讀數(shù)儀上讀取450 nm處光密度值。

1.2.3 血清檢測結(jié)果判定 采用Scripps研究所判定方法設(shè)置截斷值，讀數(shù)在此值以上的為陽性，否則為陰性。有1種自身抗體陽性時，該受試者定義為高危受試者。

1.2.4 色素內(nèi)鏡檢查 常規(guī)內(nèi)鏡檢查，行食管黏膜碘染色和賁門黏膜美藍(lán)染色，在食管不染區(qū)取材，所有活檢組織均迅速置于體積分?jǐn)?shù)85%乙醇內(nèi)固定。

1.2.5 病理組織學(xué)檢查 對色素內(nèi)鏡獲取的活檢組織常規(guī)處理后進(jìn)行切片，每張切片厚5 μm，然后進(jìn)行HE染色，得出組織病理學(xué)診斷結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組和對照組3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體表達(dá)比較及診斷效能PCNA、TβRⅡ、XPC等3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體在食管癌組的陽性率明顯高于在對照組(χ2=23.184，P<0.001；χ2=16.704，P<0.001；χ2=19.877，P<0.001)。3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合檢測診斷早期食管癌患者敏感性和特異性均為81.25%。見表1、2。

表1 食管癌組和對照組3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體表達(dá)比較 n(%)

表2 3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體不同組合聯(lián)合檢測對食管癌的診斷效能 n(%)

2.2 食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體液體活檢技術(shù)和色素內(nèi)鏡檢查結(jié)果比較食管癌高發(fā)區(qū)518例無癥狀人群均接受3種血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合液體活檢技術(shù)和色素內(nèi)鏡檢查，并進(jìn)行研究對象基線資料和兩者檢查方法診斷效能進(jìn)行比較分析。結(jié)果見表3、4。

表3 食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群年齡、性別分布情況 n(%)

表4 食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合液體活檢技術(shù)和色素內(nèi)鏡檢查結(jié)果比較 n(%)

2.3 食管癌高發(fā)區(qū)液體活檢技術(shù)篩查檢出食管癌的效能采用3種腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合液體活檢技術(shù)對食管癌高發(fā)區(qū)21 428例無癥狀人群進(jìn)行食管癌篩查，共確定高危(陽性)人群4 286例，進(jìn)一步行色素內(nèi)鏡檢查，結(jié)果顯示正常人群2 690例(62.86%)、不典型增生1 498例(34.95%)、早期食管癌545例(12.72%)、中晚期食管癌34例(0.79%)、其他消化道腫瘤64例(1.49%)，其中早期食管癌占整個無癥狀人群的2.54%。

3 討論

在我國食管鱗癌不僅發(fā)病率高，還存在顯著的地域差異，比如我國北部，尤其是河南林州及其毗鄰的輝縣、安陽、磁縣等是世界上食管鱗癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)之一[6]。傳統(tǒng)意義上，高發(fā)區(qū)、40歲以上、男性、吸煙、飲酒、家族史陽性的無癥狀人群被籠統(tǒng)界定為食管鱗癌高?；蚋唢L(fēng)險人群，也是食管鱗癌早期篩查的主要對象[7-8]。目前，色素內(nèi)鏡和黏膜活檢是食管鱗癌早期發(fā)現(xiàn)的重要篩查方法。但是，內(nèi)鏡篩查有創(chuàng)傷、成本高且效率低，這限制了內(nèi)鏡篩查在無癥狀人群中的推廣應(yīng)用。因而，尋找有效的食管鱗癌特異性分子診斷標(biāo)志物用于篩選食管鱗癌高風(fēng)險人群，對食管鱗癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療，進(jìn)而改善食管鱗癌患者的生存和預(yù)后具有重要意義。

本研究創(chuàng)新性使用PCNA、TβRⅡ和XPC等3種血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合液體活檢對無癥狀人群進(jìn)行篩查，并結(jié)合色素內(nèi)鏡確診，結(jié)果檢出早期癌比例達(dá)到了2.54%。傳統(tǒng)的內(nèi)鏡篩查手段對早期癌的檢出比例為2%左右[9]，這表明本研究中的液體活檢技術(shù)具有很高的準(zhǔn)確性。但使用液體活檢技術(shù)約減少了80%的陪伴檢查，大大節(jié)約了成本，液體活檢技術(shù)聯(lián)合內(nèi)鏡檢查相較于傳統(tǒng)的內(nèi)鏡篩查優(yōu)勢明顯。

敬元華等[10]和馮祥等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，食管癌的檢出率分別為0.31%和0.52%，這與本研究中的食管癌檢出率相差較大。造成這種結(jié)果的原因很大可能是我國食管鱗癌發(fā)病率存在顯著的地域差異性。四川省南部縣和江蘇省揚中市的食管癌發(fā)病率遠(yuǎn)低于河南林州及其毗鄰的輝縣、安陽、磁縣等，發(fā)病率低必然導(dǎo)致檢出率低[1]。

另外，本研究也存在一定的局限性，雖然PCNA、TβRⅡ和XPC等3種血清腫瘤相關(guān)抗原自身抗體聯(lián)合液體活檢技術(shù)的敏感性和特異性都比較高，但是假陽性、假陰性仍然不可避免。這需要找到更多與食管癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的分子指標(biāo)[12]，同時優(yōu)化用于液體活檢的食管癌相關(guān)分子指標(biāo)的組合，以實現(xiàn)食管癌的高危人群預(yù)警和早期發(fā)現(xiàn)。