食管癌癌前病變惡性進(jìn)展分子分型及高發(fā)現(xiàn)場推廣應(yīng)用

楊苗苗，宋 昕，紀(jì)愛芳，徐瑞華，魏夢霞，韓文莉，雷玲玲，趙學(xué)科，孟超龍，胡守佳，程 錕，王盼盼，鐘 侃，胡景峰，王 偉，李欣然，陳 瑤，王立東

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院河南省食管癌重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室、省部共建食管癌防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052；2.長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山西 長治 046000)

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，中晚期患者5 a生存率僅10%左右,但早期患者的5 a生存率可達(dá)90%[1]。早期患者缺乏特異癥狀，首次就診時約90%已達(dá)到中晚期。因此，闡明食管癌變多階段演進(jìn)的分子機(jī)制，篩選和建立用于大范圍人群早期發(fā)現(xiàn)和高危人群預(yù)警的指標(biāo)和方法，是提高食管癌早期發(fā)現(xiàn)率，從而降低死亡率的關(guān)鍵[2]。食管癌的病理變化過程為：正常食管黏膜→基底細(xì)胞增生→炎癥→食管黏膜上皮不典型增生(分為輕、中和重度)→早期癌→中晚期癌[3]。食管黏膜上皮癌變早期形態(tài)學(xué)變化特征為基底細(xì)胞增生異常，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為基底細(xì)胞過度增生。其突出的臨床特征是雙向發(fā)展不穩(wěn)定性，即其可向癌的方向持續(xù)發(fā)展，也可以停留在某一階段多年不變，甚至可以退回到正常狀態(tài)[4]。很顯然，甄別惡性進(jìn)展分子變化特征和分子分型是識別食管癌高危人群的重要指標(biāo)。本研究正是利用這些食管癌變早期分子指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化組合，建立癌前病變惡性進(jìn)展分子模型，并進(jìn)一步在食管癌高發(fā)區(qū)進(jìn)行推廣應(yīng)用，為食管癌早期發(fā)現(xiàn)和液體活檢技術(shù)優(yōu)化組合提供證據(jù)。

本課題組既往研究中采用串聯(lián)質(zhì)譜分析標(biāo)記的高通量蛋白質(zhì)組相對定量方法對食管癌癌前病變和食管癌活檢組織進(jìn)行高通量檢測，篩選能夠鑒別食管癌及不同癌前病變的候選蛋白。采用平行反應(yīng)檢測靶向蛋白質(zhì)組學(xué)對選出的10種差異蛋白進(jìn)行定量內(nèi)部驗(yàn)證，采用免疫組化方法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)在食管癌和癌前病變組織中進(jìn)行外部驗(yàn)證。本研究在此基礎(chǔ)上，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)，以進(jìn)展(進(jìn)展為重度不典型增生、原位癌或食管癌)為終點(diǎn)結(jié)局，結(jié)合食管癌癌前病變進(jìn)展的危險(xiǎn)因素，首次建立食管癌癌前病變風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型，即采用黏蛋白1(mucin 1，MUC1)、P15和ATP7B等3種自身抗體聯(lián)合預(yù)測食管癌癌前病變惡性進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集來自省部共建食管癌防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的200例食管癌患者血清，患者均經(jīng)內(nèi)鏡和組織病理檢測確診且未接受任何放、化療等腫瘤治療的初診患者，200例正常對照人群血清來自省部共建食管癌防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合作醫(yī)院體檢中心的健康體檢人群，無任何腫瘤相關(guān)的證據(jù)。200例食管癌患者中，男108例，女92例，年齡(60.35±8.40)歲。正常對照人群中，男99例，女101例，年齡(59.16±9.88)歲。食管癌患者和正常對照人群性別、年齡等基線資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2011年1月至2019年12月間，在食管癌高發(fā)區(qū)山西省長治市選取40～69歲無癥狀人群，進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，流行病學(xué)調(diào)查前由當(dāng)?shù)卮甯刹亢袜l(xiāng)村醫(yī)生幫助發(fā)放和講解知情同意書，對同意接受檢查者詳細(xì)采集個人信息并進(jìn)行體檢，填寫基本信息調(diào)查表，包括性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤的家族史。所有被檢者均排除急性感染、過敏、自身免疫性疾病等影響血清免疫學(xué)指標(biāo)表達(dá)的疾病。

2011年1月至2019年12月間，在食管癌高發(fā)區(qū)山西省長治市、陽泉市、晉城市等地區(qū)篩選40～69歲食管癌無癥狀人群18 208例，采集個人信息，并利用液體活檢技術(shù)進(jìn)行MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體聯(lián)合檢測，對任一抗體陽性患者進(jìn)一步行內(nèi)鏡活檢病理檢查。

1.2 研究方法

1.2.1 自身抗體ELISA檢測 1)血清樣本孵育：將待檢測的血清樣本用樣品稀釋液按1500的比例進(jìn)行稀釋，然后將稀釋后的血清樣本加入已包被抗原的96孔酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中，加樣量為100 μL/孔，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1 h，然后棄去反應(yīng)孔中液體，用洗滌液洗滌5次，每次洗滌3 min；2)酶標(biāo)二抗孵育：將辣根過氧化物酶標(biāo)記的RecA蛋白用二抗稀釋液按140 000的比例進(jìn)行稀釋，然后將稀釋后的辣根過氧化物酶標(biāo)記的RecA蛋白加入96孔酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中，加樣量為100 μL/孔，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育50 min，然后棄去點(diǎn)樣孔中液體，用洗滌液洗滌3次，每次3 min；3)顯色及終止反應(yīng)：將顯色液A和顯色液B按照11等體積混合均勻，然后將混合后的顯色液迅速加入96孔酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中，加樣量為100 μL/孔，置于37 ℃避光反應(yīng)15 min，然后向每個反應(yīng)孔中再加入50 μL終止液終止反應(yīng)，于20 min內(nèi)用酶標(biāo)儀器在450 nm(檢測波長)和595 nm(參比波長)處讀取OD值，并用空白對照孔調(diào)零；4)結(jié)果判定：以陰性對照孔所測OD值平均數(shù)加2個標(biāo)準(zhǔn)差的值為截?cái)嘀?，反?yīng)孔中OD值≥截?cái)嘀禐殛栃裕?截?cái)嘀禐殛幮浴?/p>

1.2.2 內(nèi)鏡檢查及碘染色 常規(guī)行內(nèi)鏡檢查，仔細(xì)觀察食管、賁門黏膜，并分別做碘染色和美藍(lán)染色，記錄邊界清晰的不著色區(qū)域距離門齒的距離、大小、時鐘方位和狀態(tài)，并根據(jù)病灶大小對不著色區(qū)域進(jìn)行多點(diǎn)活檢，所有活檢組織均迅速置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%～13%甲醛緩沖液內(nèi)固定。組織學(xué)閱片由2位受過專業(yè)培訓(xùn)的現(xiàn)場病理醫(yī)生雙盲診斷，診斷不一致的標(biāo)本由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科醫(yī)生確診。

1.2.3 標(biāo)本處理 抽取空腹靜脈血5 mL至離心管中，室溫中靜置30 min，2 000 r/min離心10 min，吸取上層血清分裝，每管100 μL，-80 ℃冰箱儲存。

2 結(jié)果

2.1 食管癌癌前病變惡性進(jìn)展過程中自身抗體表達(dá)檢測的實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果聯(lián)合檢測MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體對食管癌的檢測敏感性達(dá)到了85.0%，其特異性相較于單一檢測或兩兩聯(lián)合檢測有所降低，但仍能達(dá)到74.50%，提示聯(lián)合檢測MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體進(jìn)行食管癌診斷，可以在保證診斷特異性的前提下大幅度提高診斷的敏感性。隨著聯(lián)合檢測自身抗體的增加，約登指數(shù)逐漸增大并趨向于1，提示聯(lián)合檢測3種自身抗體用于診斷和篩查食管癌的方法具有較好的診斷價(jià)值。聯(lián)合檢測MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體對食管癌診斷的敏感性分別為單獨(dú)檢測MUC1、P15和ATP7B的2.30倍、2.54倍和3.54倍。見表1。

表1 不同自身抗體優(yōu)化組合對食管癌診斷的價(jià)值 n(%)

2.2 食管癌癌前病變惡性進(jìn)展過程中自身抗體表達(dá)檢測的臨床應(yīng)用在食管癌高發(fā)區(qū)(山西省長治市)選取40～69歲無癥狀人群868例，其中男437例、女431例，年齡(55.04±8.39)歲。有吸煙史331例，占38.13%；有飲酒史198例，占22.81%。有腫瘤家族史374例，占43.09%。聯(lián)合檢測MUC1、P15和ATP7B的液體活檢技術(shù)篩選出高危人群87例(10.02%，87/868)。內(nèi)鏡活檢病理結(jié)果明確篩查癌前病變患者69例(7.95%，69/868)，其中輕度不典型增生33例(47.83%,33/69)、中度不典型增生8例(11.59%,8/69)和重度不典型增生28例(40.58%,28/69)，上消化道腫瘤18例(2.07%，18/868)，其中食管癌17例(94.44%，17/18)、賁門癌1例(5.56%，1/18)。見表2。

對比液體活檢技術(shù)和內(nèi)鏡活檢病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體聯(lián)合檢測陽性率在癌前病變(輕、中、重度不典型增生)和食管癌患者中均明顯高于正常對照人群，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=41.207，P<0.001；χ2=28.711，P<0.001；χ2=102.357，P<0.001；χ2=67.769,P<0.001)。見表2。

表2 自身抗體聯(lián)合檢測和內(nèi)鏡活檢病理結(jié)果比較分析情況 n(%)

為了觀察MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體聯(lián)合檢測對癌前病變惡性進(jìn)展預(yù)測價(jià)值，以該組患者入組開始，進(jìn)行5 a隨訪，然后再次進(jìn)行內(nèi)鏡活檢病理。定義惡性進(jìn)展終點(diǎn)事件為進(jìn)展為重度不典型增生、原位癌或食管癌。使用單因素Logistic回歸分析評估性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤家族史、入組內(nèi)鏡活檢病理和自身抗體對惡性轉(zhuǎn)歸風(fēng)險(xiǎn)的影響，發(fā)現(xiàn)原始病理診斷中，中度不典型增生進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)最高，為輕度不典型增生的21.538倍。自身抗體陽性癌前病變患者惡性進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)是陰性癌前病變患者的21.895倍。即MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體任一指標(biāo)陽性時，惡性病變累積惡性進(jìn)展率為29.63%(8/27)，提示MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體聯(lián)合檢測對食管癌癌前病變惡性進(jìn)展具有明確預(yù)測意義。見表3。

表3 食管癌高發(fā)區(qū)內(nèi)鏡活檢病理檢出的癌前病變惡性進(jìn)展情況

2.3 食管癌高發(fā)區(qū)大規(guī)模人群應(yīng)用使用MUC1、P15和ATP7B等3種自身抗體聯(lián)合檢測液體活檢技術(shù)在食管癌高發(fā)區(qū)山西省長治市、陽泉市、晉城市進(jìn)行大規(guī)?，F(xiàn)場人群推廣應(yīng)用，共篩選18 208例35歲以上無癥狀人群進(jìn)行液體活檢，任一指標(biāo)陽性即定義為高危人群，共篩選出3 642例高危人群，并對高危人群進(jìn)一步行內(nèi)鏡病理活檢篩查，結(jié)果示正常對照人群1 672例、不典型增生1 442例、早期食管癌463例、中晚期食管癌24例、其他上消化道腫瘤41例，其早期癌檢出率2.54%(463/3 642)。

3 討論

食管癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多階段、復(fù)雜的病理過程，具體發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。王立東等[5-6]首次報(bào)道一系列食管癌發(fā)病易感基因(如PLCE1、RFT2等)以及發(fā)病高危因素(如核黃素、維生素缺乏等)重要成果，提出食管癌發(fā)生的環(huán)境-遺傳-基因交互作用機(jī)制，為食管癌多階段演進(jìn)分子機(jī)制探討提供了思路和啟發(fā)。本研究基于前期食管癌蛋白質(zhì)組學(xué)工作基礎(chǔ)[7-12]，分析了食管癌癌前病變惡性進(jìn)展過程中分子指標(biāo)變化及其在篩查中的應(yīng)用，報(bào)道了一組適用于食管癌高發(fā)區(qū)大規(guī)模人群篩查應(yīng)用的自身抗體(MUC1、P15和ATP7B)。自身抗體是機(jī)體針對腫瘤組織分泌出的蛋白產(chǎn)生的免疫應(yīng)答產(chǎn)物，不僅可明確預(yù)測癌前病變惡性進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，而且可以應(yīng)用于高危人群篩查，結(jié)合液體活檢和內(nèi)鏡活檢病理，大幅度節(jié)約篩查成本。

本研究基于主動隨訪的終點(diǎn)結(jié)局為進(jìn)展，進(jìn)展為重度不典型增生、原位癌或食管癌，而未討論保持或逆轉(zhuǎn)。主要原因是癌前病變組織較小，內(nèi)鏡活檢病理檢查時可能已經(jīng)阻斷了可能的癌前病變進(jìn)展情況，與癌前病變的自然發(fā)生、發(fā)展的保持不變或逆轉(zhuǎn)為正常的影響因素不能明確區(qū)分，因此，本研究僅討論惡性進(jìn)展為重度不典型增生、原位癌或食管癌的狀態(tài)。

盡管已報(bào)道P53基因在食管癌組織中的表達(dá)，但是P53在多種腫瘤組織中均可表達(dá)，不具有自身抗體檢測的特異性[13]，同時自身抗體或微小RNA均被報(bào)道與食管癌的預(yù)后相關(guān)，是今后臨床研究、個體化診療的方向[14]。本研究主要討論食管癌癌前病變惡性進(jìn)展分子機(jī)制以及自身抗體在癌前病變患者血清中的表達(dá)。在食管癌患者血清自身抗體檢測時發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)檢測MUC1、P15或ATP7B時，陽性率較正常對照人群明顯升高。優(yōu)化組合MUC1、P15和ATP7B自身抗體聯(lián)合檢測時，陽性率較正常對照人群也有明顯升高，且篩查效率提高了數(shù)倍，因此，可用于高發(fā)區(qū)食管癌篩查。在食管癌高發(fā)區(qū)小范圍臨床應(yīng)用中，結(jié)合5 a隨訪發(fā)現(xiàn)，3種自身抗體任一指標(biāo)陽性時，食管癌癌前病變惡性進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)是陰性患者惡性進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的21.895倍，具有獨(dú)立預(yù)測價(jià)值。

與國家衛(wèi)健委的上消化道腫瘤早診早治項(xiàng)目技術(shù)[15]相比，使用液體活檢技術(shù)結(jié)合內(nèi)鏡活檢病理在食管癌高發(fā)區(qū)進(jìn)行大規(guī)模人群篩查，早期癌發(fā)現(xiàn)率相近，但是內(nèi)鏡篩查比例明顯下降，降低了篩查成本，縮小了癌前病變惡性進(jìn)展監(jiān)測高風(fēng)險(xiǎn)人群，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了食管癌的精準(zhǔn)診療，降低了食管癌的發(fā)病率和死亡率。

綜上所述，使用多種自身抗體聯(lián)合檢測，優(yōu)化組合，結(jié)合內(nèi)鏡活檢病理篩查是食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群早期發(fā)現(xiàn)和高危人群預(yù)警的重要手段。