非標(biāo)記依賴的石墨烯核酸適配體傳感器用于赭曲霉毒素A的均相快速檢測

伍銀環(huán)，劉弘鋅，呂遠(yuǎn)平，鄧銳杰

(四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610065)

赭曲霉毒素(Ochratoxin)是曲霉菌屬和青霉菌屬的某些菌種通過一系列代謝活動所產(chǎn)生，是目前引起世界廣泛關(guān)注的霉菌毒素之一[1].它包含7種結(jié)構(gòu)相似的化合物，它的基本結(jié)構(gòu)為苯甲酸異香豆素[2].這7中結(jié)構(gòu)中屬赭曲霉毒素A(OTA)的毒性最大、范圍最廣、產(chǎn)毒量最高、對農(nóng)產(chǎn)品存在嚴(yán)重污染，廣泛存在于谷物以及飼料當(dāng)中，與人類的健康密切相關(guān)[3-4].OTA對大多數(shù)哺乳動物具有肝毒性、腎毒性、神經(jīng)毒性、致畸性和致突變性[5].更糟糕的是，OTA可能會污染許多食物和飲料，如谷類食品、堅(jiān)果、咖啡、啤酒和葡萄酒[6-7].OTA還具有極強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性，在溫度高于250℃時(shí)才會發(fā)生分解[8].歐盟規(guī)定在成人食用的谷物中OTA的含量不能超過3μg·kg-1，用于嬰幼兒食用以及特殊醫(yī)療目的食品的谷物中OTA含量不能超過0.5μg·kg-1[9].我國食品安全標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定谷物原料中OTA含量不能超過5μg·kg-1，飼料中OTA不得高于100μg·kg-1[10].因此，發(fā)展快速、靈敏的OTA檢測方法對于保障食品安全和人類健康具有重要意義.高效液相色譜(HPLC)以及其質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是目前OTA檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法，具有準(zhǔn)確度和可靠性高等特點(diǎn)，但是由于依賴大型儀器，無法應(yīng)用于現(xiàn)場檢測.近年來，發(fā)展的酶聯(lián)免疫方法以及包括表面等離子體共振(SPR)和電化學(xué)免疫等新型傳感方法有望用于OTA污染的現(xiàn)場檢測.然后這些方法大部分依賴分離過程，且利用抗體的檢測方法受限于抗體的穩(wěn)定性，價(jià)格也比較昂貴.因此，建立一種操作簡便，耗時(shí)短成本低的檢測手段對OTA的檢測是至關(guān)重要的(表1).

表1 OTA檢測方法對比Table 1 Comparison of OTA detection methods

石墨烯是一種二維納米材料，具有獨(dú)特的碳六元環(huán)晶體結(jié)構(gòu)[11].氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是石墨烯的一種衍生物，其表面有很多具有較強(qiáng)親水活性的含氧官能團(tuán)，比如羥基和羧基，這些基團(tuán)使氧化石墨烯能夠均勻地分散在水相中，具有良好的水溶性[12-13].GO以其優(yōu)異的電子、機(jī)械、表面功能、水分散性和增強(qiáng)熒光猝滅能力[14]等性能在生物領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注同時(shí)，GO表面具有大量的π-π分子結(jié)構(gòu)，能夠使核酸鏈很好的吸附在GO的表面，故而可以作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)的受體[15-18].此外，GO還可以結(jié)合單鏈DNA(ssDNA)在堿基和GO之間通過疏水、氫鍵和小分子疊置相互作用發(fā)生[19-20].然而，它幾乎不能與剛性雙鏈DNA(dsDNA)或良好折疊的DNA相互作用DNA[21].石墨烯與DNA的特異性相互作用可以用于構(gòu)建光學(xué)、電學(xué)和比色傳感器.

核酸適配體又稱為適配體、適配子等，一般是由幾個(gè)或幾十個(gè)核苷酸組成的單鏈DNA或者RNA序列，可以通過經(jīng)典的指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)過程從DNA或RNA池中選擇[22-23].核酸適配體能與靶標(biāo)分子實(shí)現(xiàn)高親和力和高特異性的結(jié)合.與抗體相比，核酸適配體具有篩選程序簡單、穩(wěn)定性高、成本低、活性均一、合成簡便和修飾方便等優(yōu)點(diǎn)[24-26].此外，相對抗體使用過程中需要固定與洗滌等復(fù)雜處理方法，核酸適配體可應(yīng)用于均相檢測技術(shù)和耦合多種信號放大技術(shù)，不僅檢測方法簡單、快速，而且可實(shí)現(xiàn)更靈敏的檢測.目前基于適配體技術(shù)的均相檢測方法有比色法、熒光法等[27-28].

本研究結(jié)合靶標(biāo)觸發(fā)核酸適配體構(gòu)型響應(yīng)及嵌入型核酸染料Eva Green，構(gòu)建了一種用于OTA均相快速檢測的石墨烯核酸適配體傳感器.核酸適配體與OTA結(jié)合可改變其與石墨烯相互作用，Eva Green具有良好的穩(wěn)定性，在正常的儲存和操作中不會被破壞，它的引入可以非共價(jià)標(biāo)記監(jiān)測核酸適配體與石墨烯的結(jié)合狀態(tài)，進(jìn)而定量檢測OTA.在沒有OTA的情況下，由于OTA核酸適配體的發(fā)卡型結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其不易吸附在GO表面[29]，故體系的熒光值較高.在體系中加入OTA后，由于OTA的存在觸發(fā)OTA核酸適配體的構(gòu)型變化，發(fā)卡結(jié)構(gòu)被打開從而被GO吸附，導(dǎo)致體系的熒光值降低.改方法只需在室溫條件下一個(gè)離心管內(nèi)混合反應(yīng)即可，反應(yīng)結(jié)束后可直接檢測熒光信號，其檢測動態(tài)范圍是1～10 ng·mL-1，檢出限為0.17 ng·mL-1.該方法能高特異性區(qū)分OTA與食品中的赭曲霉毒素B(OTB)及其他毒素，如:玉米赤戊烯酮(ZEN)、黃曲霉毒素B1(AFB1)等.該方法成功應(yīng)用于啤酒OTA污染的檢測分析.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備

OTA核酸適配體序列為GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATC(參照文獻(xiàn)[1]設(shè)計(jì))，合成于擎科生物；赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)玉米赤戊烯酮毒素(ZEN)、黃曲霉毒素B1(AFBI)標(biāo)準(zhǔn)品購于普瑞邦生物工程有限公司(分析純)；氧化石墨烯購于先豐納米公司；Eva Green購于安諾倫(北京)生物科技有限公司公司.

熒光光譜以及熒光強(qiáng)度由多功能微孔板檢測儀(美國伯騰儀器有限公司)測得；黑色384微孔板(Greiner Bio-One公司)；PCR管(生工生物工程(上海)股份有限公司)；200μL吸頭(生工生物工程(上海)股份有限公司)；10μL吸頭(生工生物工程(上海)股份有限公司)；移液槍.樣品放置在384微孔板中，在波長480 nm處被激發(fā)，所有的發(fā)射光譜在室溫下從510到650 nm的波長范圍內(nèi)收集.所有實(shí)驗(yàn)都在室溫下進(jìn)行且至少重復(fù)三次.

1.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

優(yōu)化的反應(yīng)條件包括OTA核酸適配體、氧化石墨烯、OTA的濃度及反應(yīng)時(shí)間.其中OTA核酸適配體濃度取0.1～10μM，GO濃度取1～100μg·mL-1，OTA濃度為0.1～100 ng·mL-1，反應(yīng)時(shí)間為0～40 min.

1.3 熒光檢測OTA

(1)用分子級水將各試劑稀釋到一定的濃度，將4μL OTA溶液、4μL OTA核酸適配體溶液以及適量體積的水(使得反應(yīng)結(jié)束時(shí)溶液終濃度為初濃度的0.1倍)加入離心管中混勻反應(yīng)15 min；

(2)再向混合液中加入4μL石墨烯溶液，反應(yīng)20～30 min；

(3)最后向離心管中加入4μL Eva Green后，立即將混合溶液注入到384孔板中，用多功能微孔板檢測儀對其進(jìn)行熒光檢測，記錄在480 nm處的熒光值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算出OTA的濃度.

1.4 實(shí)時(shí)熒光測定

研究了時(shí)間對熒光強(qiáng)度變化的影響.將所有的試劑加入384微孔板中，最后加入Eva Green然后立即放入多功能微孔板檢測儀中實(shí)時(shí)測定熒光強(qiáng)度，檢測時(shí)間為0～40 min.

1.5 選擇性測試

為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用核酸適配體的特異性，我們選擇了OTB、ZEN以及AFB1與之進(jìn)行比較.首先在離心管中加入1.5μM的OTA核酸適配體、10 ng·mL-1的OTA、OTB、ZEN、AFB1，再加入適量的水，反應(yīng)15 min；然后向混合液中加入25μg·mL-1的GO溶液，反應(yīng)20～30 min；最后加入10×的EvaGreen后將溶液加入到384微孔板中立即用多功能微孔板檢測儀測定480 nm處的熒光值.

1.6 樣品測定

(1)樣品處理:取啤酒試樣，使用前先置于4℃冰箱冷藏30 min(低溫有利于減少樣品中的氣泡)后對其進(jìn)行超聲脫氣，在室溫條件下離心10 min，使樣品中的雜質(zhì)沉淀，轉(zhuǎn)速為800 rpm，離心后過濾除去沉淀，將啤酒溶液稀釋100倍，向稀釋后的啤酒溶液中加入不同濃度的OTA(1ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1).

(2)實(shí)際樣品熒光測定:將4μL含有OTA的啤酒溶液、4μL核酸適配體溶液以及適量體積的水(使得反應(yīng)結(jié)束時(shí)溶液終濃度為初濃度的0.1倍)加入離心管中混勻反應(yīng)15 min；再向混合液中加入4μL GO溶液，反應(yīng)20～30 min；最后向離心管中加入4μL 20×Eva Green后，立即將混合溶液注入到384孔板中，用多功能微孔板檢測儀對其進(jìn)行熒光檢測，記錄在480 nm處的熒光值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算出OTA的濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

基于GO和核酸適配體構(gòu)建的生物傳感器檢測原理如圖1所示.通過加入嵌入式核酸染料EvaGreen，可以實(shí)現(xiàn)非共價(jià)標(biāo)記核酸適配體，點(diǎn)亮核酸適配體探針.由于核酸適配體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)使其不容易被氧化石墨烯吸附，從而熒光不會被猝滅；當(dāng)目標(biāo)檢測物(OTA)存在的情況下，OTA核酸適配體在與靶結(jié)合時(shí)從發(fā)卡結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)镺TA/OTA核酸適配體復(fù)合物，通過π-π共軛以及范德華力[11]，使適配體和OTA形成的復(fù)合物可吸附在氧化石墨烯的表面，由于FRET的作用，氧化石墨烯猝滅了核酸適配體和OTA/Evagreen的復(fù)合物攜帶的熒光信號，從而可由熒光值的差別來對OTA進(jìn)行檢測，且檢測體系中的OTA濃度越高，熒光信號降低程度越大.

圖1 石墨烯核酸適配體傳感器用于赭曲霉毒素A的均相快速檢測原理圖Fig.1 Working principle for graphene aptasensor for rapid homogeneous detection of ochratoxin A

2.2 適配體濃度優(yōu)化

適配體的濃度為0.1～10μM，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2(A))，隨著核酸適配體濃度的增長，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，當(dāng)適配體濃度為1.5μM時(shí)，背景與信號的比值(噪信比)最大，故而后續(xù)實(shí)驗(yàn)適配體的濃度采用1.5μM.

圖2 原理驗(yàn)證及核酸適配體優(yōu)化(A)在OTA適配體(黑色)、OTA適配體/GO(藍(lán)色)和OTA適配體/GO/OTA(紅色)存在下體系的熒光發(fā)射光譜)；(B)不同OTA適配體濃度下體系的熒光強(qiáng)度Fig.2 Principle verification and optimization of nucleic acid aptamer(A)Fluorescence emission spectra of the system in the presence of OTA aptamer(black)，OTA aptamer/GO(blue)and OTA aptamer/GO/OTA(red)；(B)Fluorescence intensity of the system at different OTA aptamer concentration

2.3 石墨烯濃度優(yōu)化

在熒光檢測平臺中引入GO可以得到較低的背景，而高濃度GO則可能導(dǎo)致熒光回收率較低.因此對GO的濃度也需要進(jìn)行優(yōu)化.圖3(A)顯示了不同濃度GO存在時(shí)OTA/OTA核酸適配體的熒光信號變化.由圖可知，隨著GO的濃度增加，熒光強(qiáng)度不斷減弱，當(dāng)GO濃度為10μg·mL-1時(shí)背景與信號的比值(噪信比)最大，比值為3.59.

2.4 實(shí)時(shí)熒光測定

研究了GO/適配體探針對靶標(biāo)分子的實(shí)時(shí)響應(yīng)(圖3(B)).如圖3(B)所示，熒光強(qiáng)度在0～20 min的時(shí)間范圍內(nèi)顯著減少，在20 min之后信號趨于穩(wěn)定.因此，選擇20 min的時(shí)間檢測OTA.

圖3 氧化石墨烯及時(shí)間的優(yōu)化(A)不同OTA適配體濃度下體系的熒光強(qiáng)度；(B)不同反應(yīng)時(shí)間下體系的熒光強(qiáng)度Fig.3 Optimization of graphene oxide and time(A)Fluorescence intensity of the system at different OTA aptamer concentrations；(B)Fluorescence intensity of the system under different reaction time

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線以及檢出限

方法的靈敏度是決定其適用性的關(guān)鍵參數(shù).為了評估OTA測定的靈敏度，研究了GO/適配體探針對不同濃度的OTA的響應(yīng)，熒光信號如圖4(A)所示，熒光值隨著OTA濃度的增加而逐漸降低，OTA在0-10 ng·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖4(A)).檢測限為0.17 ng·mL-1，該LOD符合歐盟委員會食品法規(guī)對用于直接人食用的加工谷類產(chǎn)品中OTA的檢測要求[40].這些結(jié)果表明，該石墨烯核酸適配體傳感器有望作為一種OTA的快速現(xiàn)場檢測方法.

2.6 選擇性

為了研究該試驗(yàn)方法的選擇性，選擇了與OTA結(jié)構(gòu)類似的OTB及其他真菌毒素(ZEN和AFB1)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖4(B)所示，在相同條件下，OTA引起的熒光信號變化明顯大于OTB、ZEN以及AFB1引起的信號變化.可見，由于核酸適配體對OTA的固有特異性，只有OTA才能誘導(dǎo)出顯著的信號.OTB、ZEN以及AFB1只引起微弱的熒光信號變化.因此，該對OTA的檢測具有良好的選擇性，表明其在復(fù)雜樣品分析中的應(yīng)用具有潛在的可能性.

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及選擇性(A)不同濃度OTA條件下體系的熒光強(qiáng)度，濃度分別為:0，0.1，1.5，2.5，3，5，10，25，50，75，100ng·ml-1；(B)體系中OTA的選擇性Fig.4 Standard curve and selectivity(A)Fluorescence intensity of the system in the response to OTA at various concentrations:0，0.1，1.5，2.5，3，5，10，25，50，75，100 ng·mL-1；(B)Selectivity of the designed sensing system for OTA

2.7 樣品分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所設(shè)計(jì)的測定方法在檢測食物樣本中的可行性，我們對啤酒樣品進(jìn)行了OTA的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，用本實(shí)驗(yàn)方法測定三種不同濃度OTA(1，5，10 ng·mL-1)的回收率(表2)，回收率在91.6～113%之間，驗(yàn)證了該方法可應(yīng)用在具有復(fù)雜基質(zhì)的食品樣品中OTA的定量檢測.

表2 啤酒中OTA加標(biāo)回收檢測結(jié)果Table 2 Detection of OTA in beer

3 結(jié)論

綜上所述，我們利用靶標(biāo)分子觸發(fā)的核酸適配體構(gòu)型變化及嵌入型核酸染料，構(gòu)建了石墨烯適配體傳感器實(shí)現(xiàn)了對OTA的均相快速、非標(biāo)記依賴的檢測.該方法涉及OTA觸發(fā)核酸適配體構(gòu)型變化、GO的熒光淬滅能力以及核酸染料非共價(jià)標(biāo)記效應(yīng).核酸適配體的結(jié)構(gòu)響應(yīng)性及其與GO的相互作用調(diào)控可實(shí)現(xiàn)對OTA快速靈敏的響應(yīng).與其他基于核酸適配體的OTA檢測方法相比，該方法不需要進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記和帶修飾的核酸適配體，降低了成本和復(fù)雜性.該方法將OTA核酸適配體、GO與OTA樣品在室溫下簡單混合即可檢測OTA，并具有優(yōu)異的靈敏度(0.17 ng·mL-1)和選擇性.此外，該方法能夠準(zhǔn)確檢測出啤酒中OTA的含量，并且通過選擇與其他毒素相對應(yīng)的核酸適配體利用該方法可檢測其他毒素，如:黃曲霉毒素B1、卡那霉素等.因此有望為食品安全領(lǐng)域真菌毒素的檢測控制提供新的工具，在食品安全領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值.