維氏氣單胞菌分離鑒定及對殺菌劑的敏感性

王淑嫻，刁菁，樊英，蓋春蕾，宋愛環(huán)，吳海一，葉海斌

（山東省海洋生物研究院/山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266104）

維氏氣單胞菌亦被稱為維羅納氣單胞菌，隸屬氣單胞菌科（Aeromonadaceae）、氣單胞菌屬（Aeromonas）。維氏氣單胞菌由雜交群分類屬DHG8/10，致病菌株多數(shù)屬DHG8[1]。近年來不斷有研究表明維氏氣單胞菌是一種重要的水生生物病原菌，還能夠引起人畜共患病，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)還會使人類產(chǎn)生肺炎、敗血癥以及食物中毒等病癥。養(yǎng)殖模式的集約化以及養(yǎng)殖從業(yè)者對各種抗生素的不合理應(yīng)用給淡水魚類疾病的預(yù)防和控制帶來極大的困難。2020 年山東某鯉魚養(yǎng)殖場暴發(fā)了以腹部腫脹，腸道充血并伴有一定腹水為主要癥狀的疾病，造成了所養(yǎng)鯉魚的大量死亡。該研究從瀕死病魚體內(nèi)的肝、脾、腎、腸道中分離純化得到一株疑似致病菌，并對該菌進(jìn)行了鑒定、系統(tǒng)發(fā)育樹分析和體外藥敏性研究，旨在為養(yǎng)殖鯉魚的疾病防治提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株分離：通過劃線法從患病鯉魚的肝、腎、脾、腸等內(nèi)臟組織中分離得到一株優(yōu)勢菌，命名為S-1。

主要試劑和儀器：分離細(xì)菌所用胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購自北京陸橋生物試劑有限公司，基因組DNA 提取試劑盒、PCR 反應(yīng)所需PremixTaq DNA 聚合酶購自TaKaRa 公司，引物由上海生工合成，藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司，PCR 儀、核酸微量測定儀、凝膠成像系統(tǒng)購自日本Bio-Rad 公司，微量加樣器購自Eppendorf 公司。

1.2 細(xì)菌基因組DNA 提取

在TSA 平板上劃線接種細(xì)菌S-1，于細(xì)菌培養(yǎng)箱中28 ℃過夜培養(yǎng)，用接種環(huán)挑取少量細(xì)菌于EP管中，按照基因組DNA 提取試劑盒的說明，提取細(xì)菌S-1 的基因組，使用核酸微量測定儀檢測核酸濃度，作為PCR 反應(yīng)的模板。

1.3 分子生物學(xué)方法鑒定

采用一對通用引物，對細(xì)菌S-1 的16S rRNA序列進(jìn)行測定。PCR 反應(yīng)體系：Premix Taq 酶 25 μL；正向引物（27 f）1 μL；反向引物（1492r）1 μL；S-1 基因組 1 μL；滅菌超純水 22 μL，共 50 μL 體系。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 1 min，55 ℃復(fù)性 1 min，72 ℃延伸 l min 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃溫育 10 min。吸取 6 μL 的 PCR 產(chǎn)物，經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳20 min，利用凝膠成像儀觀察并拍照。剩余PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司測序，測序結(jié)果登陸GenBank 進(jìn)行BLast 比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 藥敏性檢測

采用KB 紙片擴(kuò)散法[2]測定細(xì)菌S-1 的藥物敏感性。將純化的菌液進(jìn)行梯度稀釋，利用平板計(jì)數(shù)法配制的菌液濃度為1.0×108CFU/mL。吸取100 μL菌液均勻涂布在TSA 平板上，用無菌鑷子將各種抗生素藥敏片輕輕貼在培養(yǎng)基表面，28 ℃恒溫倒置過夜培養(yǎng)，測量抑菌圈直徑，根據(jù)藥敏試紙片抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)，判斷菌株對藥物的敏感程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)特性及鏡檢觀察

將細(xì)菌S-1 接種于TSA 培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，形成圓形，中央微隆，邊緣較整齊，淺黃色有芳香味的中等大小的菌落。經(jīng)過革蘭氏染色，可在顯微鏡下觀察到革蘭氏染色陰性，短桿狀，兩端鈍圓或直平的小桿菌。

2.2 基因組DNA 含量測定

將1 μL 細(xì)菌S-1 的基因組DNA 加入核酸微量測定儀中，經(jīng)檢測得知所提取的基因組DNA 的濃度為 120 ng/μL，OD260/OD280 值為 1.82，說明DNA 純度較高，可以作為PCR 反應(yīng)的模板。

2.3 16S rRNA 基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

測序結(jié)果顯示細(xì)菌S-1 的16S rRNA 基因序列長度為1453 bp，將該基因序列在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行BLast 檢索。比對結(jié)果顯示該菌與產(chǎn)氣單胞菌屬的16S rRNA 基因序列聚為一群，從同源性較高的序列中選取典型的序列，包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）、梭形芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）、類志賀鄰單胞菌（Plesiomonas shigelloides）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）、溫和氣單胞菌（A.sobria）、燦爛弧菌（Vibrio splendidus）、鰻弧菌（V.anguillarum）、歐式弧菌（V.owensii）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、溶藻膠弧菌（V.alginolyticus）的 16S rRNA 基因序列，利用MEGA 4.O 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果顯示細(xì)菌S－1 與兩株A.veronii（KY767536.1 和MN581681.1）聚合在一起（如圖1 所示）。

根據(jù)細(xì)菌16S rRNA 基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，將細(xì)菌S-1 鑒定為維氏氣單胞菌。

圖1 根據(jù)分離菌株S-1 的16S rRNA 基因序列繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

如表1 所示，該菌對氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢呋辛、米諾環(huán)素、氧氟沙星、哌拉西林、丁胺卡那、復(fù)方新諾明等抗生素高度敏感，對多西環(huán)素、新霉素、頭孢拉定、紅霉素、麥迪霉素等藥物中度敏感，對諾氟沙星、環(huán)丙沙星、羧芐西林、痢特靈、多粘菌素B、卡那霉素、苯唑西林、萬古霉素、克林霉素、氨芐西林、青霉素等藥物不敏感。

3 討論

維氏氣單胞菌作為一種引起人-獸-魚共患病的病原菌，可導(dǎo)致多種水生生物發(fā)病，還可引起人類等哺乳動物感染罹患多種疾病。人們治療時(shí)的不合理用藥，致使該菌對多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性，給魚類養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也給人類的公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重的威脅[3]，為此，維氏氣單胞菌越來越引起國內(nèi)外學(xué)者的高度重視。

表1 細(xì)菌S-1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

有研究者從患病淡水魚類中成功分離到維氏氣單胞菌，同時(shí)觀察其肝、腎、脾、腸、腦、鰓等實(shí)質(zhì)器官的病理組織學(xué)變化，結(jié)果表明患病魚類因多個(gè)組織器官出現(xiàn)嚴(yán)重的病理變化而導(dǎo)致死亡[4-5]。還有研究者通過使用16S r DNA 的 RFLP-PCR 技術(shù)對患病的和健康的養(yǎng)殖虹鱒魚進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)50 株菌株，其中維氏氣單胞菌占22%[6]。該研究從患病鯉魚中分離得到一株革蘭氏陰性細(xì)菌（S-1），16S rRNA 基因片段序列分析結(jié)果顯示，該菌的16S rRNA 基因序列與維氏氣單胞菌16S rRNA 基因序列的同源性最高，達(dá)到99%以上。MEGA 4.0 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，在系統(tǒng)發(fā)育樹上該菌與維氏氣單胞菌聚成一簇，鑒定該菌為維氏氣單胞菌。

維氏氣單胞菌對多種抗生素呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性，這與養(yǎng)殖過程中亂用抗生素有很大關(guān)系。并且由于維氏氣單胞菌會導(dǎo)致人獸共患疾病，所以臨床的抑菌必須引起人們足夠的重視，合理選擇用藥，對于不同菌株選擇不同敏感的藥物進(jìn)行治療，防止盲目性的亂用藥。該研究采用藥敏紙片法檢測了從患病鯉魚分離得到的維氏氣單胞菌菌株對30 種抗生素的體外敏感性。結(jié)果表明：該菌株對氯霉素、慶大霉素、四環(huán)素、頭孢氨芐等14 種抗生素高度敏感，對多西環(huán)素、新霉素、頭孢拉定、紅霉素、麥迪霉素等11 種藥物具有耐藥性。維氏氣單胞菌對抗生素的耐藥性檢測，可以為氣單胞菌屬細(xì)菌感染疾病的防治提供科學(xué)參考。