動(dòng)物DNA甲基化研究現(xiàn)狀

麻錦楠

（云南師范大學(xué)，昆明650092）

表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、RNA修飾和非編碼RNA等。DNA甲基化作為一種被廣泛研究的表觀遺傳修飾方式，是動(dòng)物和其他真核生物共享的DNA修飾方式。DNA甲基化是指甲基基團(tuán)在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，結(jié)合到基因組DNA分子上的生物學(xué)過程。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而調(diào)控基因表達(dá)（Jinet al.，2011）；作為重要的基因組水平的化學(xué)修飾，參與了動(dòng)物生長發(fā)育中許多關(guān)鍵過程。當(dāng)原始生殖細(xì)胞向生殖脊轉(zhuǎn)變時(shí)，首先通過重編程過程進(jìn)行全基因組的去甲基化，之后再重新建立新的甲基化形式（Smith & Meissner，2013）。在胚胎發(fā)育過程中，也發(fā)現(xiàn)了大規(guī)模DNA甲基化遺傳修飾的改變（Giffordet al.，2013；Xieet al.，2013；Wanget al.，2014）。此外，嬰兒的發(fā)育過程同樣存在DNA甲基化的動(dòng)態(tài)改變，并且DNA甲基化的改變還會(huì)受到年齡、疾病、營養(yǎng)等的影響（Chenet al.，2018；Matherset al.，2018；Zhouet al.，2020；He，2022）。本文結(jié)合動(dòng)物DNA甲基化研究文獻(xiàn)，綜述了DNA甲基化特征、DNA甲基化與基因表達(dá)調(diào)控、DNA甲基化的生物學(xué)意義，以及DNA甲基化檢測技術(shù)等方面的研究進(jìn)展。

1 DNA甲基化特征

DNA的4種堿基中，胞嘧啶和腺嘌呤都可以被甲基化，形成5mC和6mA的修飾。胞嘧啶甲基化在原核及真核生物中均廣泛存在，但腺嘌呤甲基化主要存在于植物和細(xì)菌中（Yi，2017）。細(xì)菌中DNA甲基化可以將細(xì)菌自身基因組與噬菌體基因組區(qū)分開，噬菌體的DNA得以被宿主的限制性酶切割（Chinnusamy & Zhu，2009）。哺乳動(dòng)物中，CG類型基序最常見，且脊椎動(dòng)物體細(xì)胞中60%～80%的 CpG 位點(diǎn)都是高甲基化的（Schübeler，2015）。但在哺乳動(dòng)物某些組織（胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞）中，非CG類型的甲基化占比更高（Ramsahoyeet al.，2000）。在植物中，DNA高甲基化作用發(fā)生在3種甲基化基序中，包括CG、CHG和CHH（H代表A、C或T），且大多數(shù)植物甲基化區(qū)域與非甲基化區(qū)域是交替出現(xiàn)的（Schübeler，2015）。DNA甲基化水平受生長發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)等因素的影響，處于動(dòng)態(tài)變化的過程中。DNA甲基化變化可劃分為3個(gè)階段：建立、維持和去除。哺乳動(dòng)物中，甲基化位點(diǎn)的建立在甲基轉(zhuǎn)移酶3的調(diào)控下進(jìn)行（Chen & Li，2004），發(fā)生部位通常是轉(zhuǎn)錄活性較弱的啟動(dòng)子區(qū)和轉(zhuǎn)錄活性較強(qiáng)的基因體區(qū)。這些區(qū)域往往包含了大量H3K4me3（Piunti & Shilatifard，2016）。甲基轉(zhuǎn)移酶1可維持DNA復(fù)制過程CpG位點(diǎn)的對(duì)稱性，避免由于復(fù)制造成的甲基化位點(diǎn)缺失。之前被認(rèn)為是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的DNMT2已被證實(shí)為一種tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶，并已更名為tRNA天冬氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（Gollet al.，2006）。此外，DNA甲基化是一種動(dòng)態(tài)修飾過程，不僅因?yàn)槠淠芡ㄟ^酶來調(diào)控甲基化與去甲基化的作用，甲基化胞嘧啶還能自發(fā)地脫氨，導(dǎo)致基因位點(diǎn)突變頻率的增加。5-甲基胞嘧啶在自發(fā)脫氨作用下轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，CpG二核苷酸轉(zhuǎn)化為TpG二核苷酸，而未甲基化的胞嘧啶在自發(fā)脫氨作用下產(chǎn)生的尿嘧啶會(huì)很快被細(xì)胞識(shí)別并修復(fù)（Landeret al.，2001）。實(shí)際上，在進(jìn)化過程中，許多甲基化CpG位點(diǎn)脫氨并穩(wěn)定保存，這也解釋了人類基因組中甲基化頻率低于預(yù)期值的原因。

2 DNA甲基化與基因表達(dá)調(diào)控

基因組上不同區(qū)域的甲基化對(duì)基因表達(dá)具有不同的調(diào)控作用。哺乳動(dòng)物中存在富含CpG的區(qū)域，被稱為CpG島，其相對(duì)較小，平均約1 000 bp。人類和小鼠Mus musculu中30%～40%的CpG島在正常組織中是甲基化的（Yi，2017）。人和小鼠的基因組中，絕大多數(shù)的CpG島位于基因的啟動(dòng)子區(qū)，少數(shù)位于基因體區(qū)的可作為可替代啟動(dòng)子調(diào)節(jié)基因表達(dá)（Illingworthet al.，2010）。目前CpG島的定義不統(tǒng)一，不同研究者對(duì)CpG島的選取有一定差異，因此很多研究都將關(guān)注點(diǎn)集中于CpG島最多的啟動(dòng)子區(qū)。啟動(dòng)子區(qū)高密度的甲基化可導(dǎo)致基因的沉默。CpG位點(diǎn)的甲基化能通過2種作用機(jī)制影響基因的表達(dá)。首先，CpG區(qū)的甲基化通過抑制轉(zhuǎn)錄因子與核苷酸的結(jié)合，影響基因的表達(dá)調(diào)控。6 bp區(qū)域中只要存在單個(gè)位點(diǎn)的甲基化修飾就能抑制轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合（Watt & Molloy，1988）。其次，甲基化的CpG區(qū)域能被含有甲基-CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族識(shí)別。這些蛋白質(zhì)家族通過不同的domain識(shí)別甲基化位點(diǎn)，招募組蛋白脫乙酰激酶HDACs和其他一些染色質(zhì)重塑蛋白，改變組蛋白的結(jié)構(gòu)，從而形成緊密閉合無活性的染色質(zhì)，抑制轉(zhuǎn)錄的過程（Jones & Laird，1999）。越來越多的研究也將啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與基因表達(dá)進(jìn)行聯(lián)合分析，研究甲基化在介導(dǎo)生物組織器官發(fā)育（Waterlandet al.，2009；Liet al.，2012；Eharaet al.，2015；Maet al.，2022）、疾病發(fā)生（Br?gelmannet al.，2021）等過程中的重要作用。

目前大多數(shù)研究已證實(shí)基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化會(huì)抑制基因的表達(dá)，但是除啟動(dòng)子區(qū)域外的其他區(qū)域，如基因體區(qū)的甲基化功能還是未知的。Brenet等（2011）發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中首位外顯子的甲基化與基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，且首位外顯子的調(diào)控作用比啟動(dòng)子區(qū)更顯著。首位內(nèi)含子甲基化對(duì)基因表達(dá)同樣存在調(diào)控作用：首位內(nèi)含子與TSS位置較近，其甲基化通過影響轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)來影響基因轉(zhuǎn)錄（Hartonoet al.，2015）。首位內(nèi)含子的甲基化與基因表達(dá)相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)在包括癌癥細(xì)胞、胎兒及成年人組織、小鼠CD4+細(xì)胞、精神分裂癥患者的白細(xì)胞等中進(jìn)行了驗(yàn)證（Anastasiadiet al.，2018）?；蝮w甲基化除有部分調(diào)控基因表達(dá)的功能外，可能還在調(diào)控轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性上起重要作用。Neri等（2017）在小鼠胚胎干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3b介導(dǎo)的甲基化過程可防止生物體內(nèi)異常轉(zhuǎn)錄事件的發(fā)生，確保轉(zhuǎn)錄過程的準(zhǔn)確性。如果Dnmt3a和Dnmt3b甲基化轉(zhuǎn)移酶被抑制，胚胎會(huì)因轉(zhuǎn)錄因子的異常表達(dá)導(dǎo)致發(fā)育畸形而終止妊娠（Kinoshitaet al.，2021）。此外，位于外顯子的DNA甲基化區(qū)可通過招募多功能蛋白MeCP2增強(qiáng)HDAC對(duì)外顯子的識(shí)別，維持局部組蛋白低乙?；?，從而調(diào)節(jié)RNA的可變剪切（Maunakeaet al.，2013）。

3 DNA甲基化的生物學(xué)意義

DNA甲基化的改變與遺傳水平的改變均反映了生物對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，但DNA甲基化改變機(jī)制的靈活性更高，且具可逆性（Norouzitallabet al.，2018）。DNA甲基化作用在生殖細(xì)胞發(fā)育階段就已經(jīng)出現(xiàn)，當(dāng)原始生殖細(xì)胞向配子轉(zhuǎn)變時(shí)，親本特有的表觀遺傳印記會(huì)被清除，之后性別特異性DNA甲基化印記又在雄性和雌性配子體發(fā)育過程中重新建立（Sasaki & Matsui，2008）。而在由受精卵向早期胚胎的發(fā)育中，同樣又循環(huán)了去甲基化與甲基化重構(gòu)的過程（Smallwood & Kelsey，2012）。在胚胎發(fā)育過程中，母體環(huán)境（飲食結(jié)構(gòu)、生存壓力、生活習(xí)慣、行為方式等）會(huì)對(duì)胚胎發(fā)育和表觀遺傳信息造成影響。當(dāng)母體受到不良因素誘導(dǎo)后，會(huì)造成新生兒體質(zhì)量的改變，并可能導(dǎo)致后代罹患高血壓、冠心病、骨質(zhì)疏松、糖尿病等（Relton& Smith，2010）。此外，母體適應(yīng)新環(huán)境的能力同樣也決定了胚胎對(duì)環(huán)境變化的可塑性，這樣的可塑性也能在種系間穩(wěn)定地遺傳（Devanapallyet al.，2015）。產(chǎn)后器官發(fā)育過程也同樣受到甲基化調(diào)控。剛出生的幼體肝臟就能通過脂肪酸β氧化過程從母乳中攝取能量，但其中的機(jī)制卻鮮為人知。Ehara等（2015）通過對(duì)出生前18.5 d和出生后2 d、16 d、28 d的小鼠肝臟組織甲基化情況進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)脂肪酸β氧化相關(guān)基因在出生后存在低甲基化高表達(dá)的現(xiàn)象，而這些低甲基化基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測到許多氧化物酶體增殖劑激活受體（PPAR）結(jié)合基序。其中，PPARα受體在調(diào)控出生后小鼠肝臟脂肪酸β氧化相關(guān)基因的去甲基化過程中扮演了重要角色。Cannon等（2016）的研究也發(fā)現(xiàn)，出生后小鼠肝臟發(fā)育過程伴隨著甲基化的改變，從E18.5到P20的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的甲基化組數(shù)據(jù)顯示，DNA甲基化的改變發(fā)生在造血干細(xì)胞遷移后，與肝細(xì)胞的分化同時(shí)進(jìn)行。除了模式物種外，非模式物種器官發(fā)育中甲基化的調(diào)控作用也引起了科學(xué)家的關(guān)注。Yang等（2021）通過繪制長白豬妊娠前33 d至出生后180 d共27個(gè)生長發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的骨骼肌全基因組甲基化和轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示DNA甲基化在調(diào)控豬骨骼肌生長發(fā)育中的重要作用。Ma等（2022）對(duì)大熊貓Ailuropoda melanoleuca未進(jìn)食組、吃乳組和成年組的肝臟和胰臟進(jìn)行DNA甲基化組測序，發(fā)現(xiàn)發(fā)育過程中肝臟和胰臟甲基化水平發(fā)生了動(dòng)態(tài)變化，尤其是營養(yǎng)代謝關(guān)鍵基因的甲基化形式隨食性改變發(fā)生了顯著改變。

除了發(fā)育初期和胚胎階段會(huì)發(fā)生表觀遺傳修飾外，發(fā)育完全的個(gè)體同樣會(huì)受到環(huán)境因素引起的DNA甲基化修飾，導(dǎo)致表型改變。大量關(guān)于脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因素與表觀遺傳之間存在相關(guān)性，包括環(huán)境污染（如無機(jī)污染物、農(nóng)藥污染和抗菌物污染等）、飲食營養(yǎng)、父母行為等（Wang Tet al.，2017；Wang Yet al.，2017；Kelleyet al.，2021）。其中，營養(yǎng)作為最重要的DNA甲基化影響因子，在表觀遺傳標(biāo)記建立和去除中起重要作用。在人類和小鼠中，高脂飲食導(dǎo)致大量基因啟動(dòng)子甲基化改變，影響器官發(fā)育和功能（Jacobsenet al.，2012；Zhanget al.，2015）。低營養(yǎng)飲食也對(duì)甲基化模式產(chǎn)生影響（Yaskolkaet al.，2021）。營養(yǎng)物質(zhì)可能通過3種方式影響DNA甲基化模式（圖1）：（1）改變甲基化過程涉及的底物；（2）改變調(diào)節(jié)葉酸循環(huán)中酶的活性；（3）改變DNA甲基化過程中酶的活性（Zhang，2015）。SAM屬于DNA和蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶的主要供體，通過甲硫氨酸循環(huán)過程合成。以上方式可直接或間接影響SAM合成過程，導(dǎo)致體內(nèi)整體DNA甲基化水平的改變（Niculescu，2012；Kadayifciet al.，2018）。

圖1 營養(yǎng)物質(zhì)影響DNA甲基化的方式（Zhang， 2015）Fig. 1 Possible nutritional ways that nutrition influences DNA methylation（Zhang， 2015）

環(huán)境誘導(dǎo)的DNA甲基化修飾通過改變基因表達(dá)，影響個(gè)體及其后代的表型，為后代適應(yīng)新環(huán)境提供了有效保障。Norouzitallab等（2014）對(duì)孤雌生殖的雌性鹵蟲Artemia進(jìn)行非致死性熱休克刺激后，所有親本個(gè)體產(chǎn)生了一系列響應(yīng)機(jī)制，包括Hsp70表達(dá)水平提高，對(duì)熱應(yīng)激的耐受性增加及對(duì)致病性弧菌的抗病性增強(qiáng)等。值得注意的是，這些表型能夠穩(wěn)定、連續(xù)遺傳到子三代。子代鹵蟲表型的改變與DNA甲基化有關(guān)，證實(shí)了表觀遺傳修飾產(chǎn)生的適應(yīng)性表型的可遺傳性。蚜蟲Acyrthosiphon pisum的跨代實(shí)驗(yàn)也得到相似的結(jié)果，當(dāng)蚜蟲飼養(yǎng)環(huán)境中存在空間和食物資源競爭時(shí)，將誘發(fā)蚜蟲從無翅個(gè)體轉(zhuǎn)變?yōu)橛谐醾€(gè)體，這樣的轉(zhuǎn)變往往發(fā)生在個(gè)體發(fā)育的早期階段，并與蚜蟲幼激素結(jié)合蛋白的甲基化有關(guān)（Walshet al.，2010）。在哺乳動(dòng)物的研究中同樣發(fā)現(xiàn)了DNA甲基化的可遺傳性，Li等（2011）對(duì)連續(xù)6代的小鼠進(jìn)行甲基飲食喂養(yǎng)后，甲基供體導(dǎo)致了小鼠基因組數(shù)千個(gè)位點(diǎn)甲基化的隨機(jī)改變。隨著世代的增加，個(gè)體間表觀遺傳變異也隨之增加。此外，小鼠不同世代受甲基化影響較大的基因主要參與了基因表達(dá)、器官形成和細(xì)胞發(fā)育的過程。總之，由環(huán)境介導(dǎo)的、表觀遺傳修飾產(chǎn)生的表型改變可能獨(dú)立于自然選擇以外，這些表觀遺傳修飾可以讓生物在短期環(huán)境的改變下快速進(jìn)行適應(yīng)性轉(zhuǎn)變。而長期暴露于某一環(huán)境中的物種，其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生持久的表觀遺傳變化，這些變化又通過增加5-甲基胞嘧啶的變異度促進(jìn)可遺傳突變的發(fā)生。

DNA甲基化修飾涉及到大量的生物學(xué)過程，異常的甲基化還會(huì)導(dǎo)致生物發(fā)育異常，甚至疾病的發(fā)生。腫瘤抑制基因（TSG）和癌基因的異常DNA甲基化在癌癥的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。多種癌癥中，普遍存在TSG的超甲基化現(xiàn)象，包括P16/INK4基因（Parrellaet al.，2004）、CADM基因（Heet al.，2013）、RASSF1A基 因（Huanget al.，2016）等。TSG啟動(dòng)子區(qū)高甲基化后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，細(xì)胞粘附性及血管生成過程的失調(diào)，誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生。此外，癌癥中除了異常高甲基化修飾外，也存在整體去甲基化及原癌基因低甲基化的情況。甲基化水平降低會(huì)引發(fā)基因組的不穩(wěn)定性，激活重復(fù)序列元件，導(dǎo)致基因組印記缺失及不可控的細(xì)胞增殖現(xiàn)象（Esteller，2007）。全基因組甲基化測序發(fā)現(xiàn)，原癌基因的高表達(dá)與CpG島的低甲基化有關(guān)。Zhao等（2020）關(guān)于前列腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，原癌基因附近轉(zhuǎn)錄因子和增強(qiáng)子結(jié)合位點(diǎn)的低甲基化，是驅(qū)動(dòng)原癌基因表達(dá)的主要因素。Suzuki等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，基因組的CpG位點(diǎn)甲基化的模式與癌癥診斷和預(yù)后相關(guān)，某些基因簇中CpG島的甲基化模式已被用于腫瘤的預(yù)后和分類。

4 DNA甲基化的檢測

在過去10年中，已開發(fā)許多DNA甲基化檢測技術(shù)（Laird，2010）。部分方法集中于檢測DNA甲基化區(qū)域，如甲基化DNA免疫沉淀法將基因組隨機(jī)打斷為300～600 bp的片段，使用抗5mC的抗體孵育后富集出甲基化片段，設(shè)計(jì)特異性引物檢測目的基因甲基化水平（Jacintoet al.，2008）；甲基化敏感限制性內(nèi)切酶法利用甲基敏感性內(nèi)切酶（HpaII、Hin6I和AciI）切割出含有甲基化CpG位點(diǎn)的序列，通過電泳分離對(duì)甲基化片段進(jìn)行分析（Maunakeaet al.，2010）；其他方法則集中對(duì)單一位點(diǎn)甲基化進(jìn)行檢測，主要步驟：用重亞硫酸鹽將DNA中的C轉(zhuǎn)化為U，經(jīng)PCR后轉(zhuǎn)化為T，而未甲基化的C位點(diǎn)不會(huì)發(fā)生變化，仍以C的形式存在（Frommeret al.，1992）。通過芯片技術(shù)及二代高通量測序技術(shù)即可將基因組所有C位點(diǎn)進(jìn)行測序。此外，一些單分子測序技術(shù)采用合成寡核苷酸探針來直接鑒定甲基化胞嘧啶（Yanget al.，2015）。

在這些方法中，有2種方法被廣泛用于評(píng)估單核胞嘧啶DNA甲基化水平，分別是簡化重亞硫酸鹽測序（RRBS）（Meissneret al.，2005）和全基因組重亞硫酸氫鹽測序（WGBS，又稱BS-seq、methyl-seq或methylC-seq）（Cokuset al.，2008）。這2種方法均需要將提取的DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理。WGBS在基因組的覆蓋范圍更廣，能用于檢測每個(gè)C位點(diǎn)的甲基化水平，為了獲得可信度高的甲基化值，該方法需保證每個(gè)位點(diǎn)的reads覆蓋度達(dá)到5～10×，所以價(jià)格更高。RRBS需要限制性酶MspI消化DNA，并富集含CCGG位點(diǎn)的50～300 bp的片段。該方法只需要對(duì)基因組部分位置進(jìn)行檢測，其測序覆蓋度較低。這些新技術(shù)的出現(xiàn)使更好、更全面認(rèn)識(shí)DNA甲基化修飾成為可能，幫助我們從少量基因位點(diǎn)的研究擴(kuò)大到基因組范圍。

5 展望

動(dòng)物DNA甲基化研究涉及生長、發(fā)育、環(huán)境、營養(yǎng)等多個(gè)方面。DNA甲基化通過調(diào)控基因表達(dá)，影響真核細(xì)胞的發(fā)育、分化等過程，并在癌癥、腫瘤等疾病發(fā)展中起到重要作用。越來越多的研究使用DNA甲基化作為生物標(biāo)志物，用于疾病的識(shí)別和診斷、動(dòng)物生長性狀標(biāo)記、酮體性狀標(biāo)記等。但目前的研究仍面臨許多挑戰(zhàn)，如某些疾病樣本及動(dòng)物組織樣本獲取困難；由于DNA甲基化的動(dòng)態(tài)性及相對(duì)不穩(wěn)定性，難以建立穩(wěn)定的DNA甲基化參照模型等。隨著后期DNA全基因組甲基化生物信息庫的建立及DNA甲基化檢測技術(shù)的發(fā)展，這些問題將會(huì)逐步得到解決。