法匹拉韋治療新冠病毒肺炎的開(kāi)放性對(duì)照臨床研究

蔡慶賢，楊明輝，劉東京，陳軍，舒丹，夏俊霞，廖雪嬌，顧元博，蔡秋娥，楊揚(yáng)，沈晨光，李曉鶴，彭凌，黃德良，張晶，張舒榮，王福祥，劉甲野，陳莉，陳淑彥，王召欽，張政，曹瑞源，鐘武,*，劉映霞,*，劉磊,*

a National Clinical Research Center for Infectious Diseases, The Third People’s Hospital of Shenzhen, The Second Affiliated Hospital of Southern University of Science and Technology, Shenzhen 518100, China

b National Engineering Research Center for the Emergence Drugs, Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology, Beijing 100850, China

1. 引言

2019年年末，由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2（SARS-CoV-2）引起的新冠病毒肺炎（COVID-19）在武漢暴發(fā)。COVID-19的臨床特征包括呼吸系統(tǒng)癥狀、發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、肺炎等[1–4]。截至2020年2月25日，中國(guó)和其他國(guó)家已確認(rèn)的COVID-19患者超過(guò)77 785例，死亡2666例[5]，特別是，韓國(guó)和日本分別發(fā)現(xiàn)了977例和861例感染者，疫情的暴發(fā)引起了全球恐慌。2020年1月30日，世界衛(wèi)生組織（WHO）宣布SARS-CoV-2的暴發(fā)成為國(guó)際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件（PHEIC），并根據(jù)《國(guó)際衛(wèi)生條例》（IHR）以臨時(shí)建議的形式提出建議。

研究人員發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2的基因組序列與嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）的基因組序列的相似度為75%～80%，而且SARS-CoV-2的基因組序列與幾種蝙蝠冠狀病毒的基因組序列有更高的相似度[6]。SARS-CoV-2是被報(bào)道的第7種人類感染的冠狀病毒科成員，該科還包括SARS-CoV和中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）。SARS-CoV-2已被確定為COVID-19的病原體。COVID-19患者的臨床和流行病學(xué)特征均表明，SARS-CoV-2感染可導(dǎo)致患者進(jìn)入重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）進(jìn)行治療以及具有高死亡率。中國(guó)有16%～21%的病情嚴(yán)重的感染者，死亡率為2%～3% [1,4]。然而，目前尚未有針對(duì)這種新病毒的特效治療方案。因此，我們迫切需要尋找有效的抗病毒藥物來(lái)對(duì)抗疾病，同時(shí)探索抗病毒藥物的臨床療效。

發(fā)現(xiàn)抗病毒藥物的一個(gè)有效途徑是篩選現(xiàn)有的抗病毒藥物是否對(duì)其他相關(guān)病毒感染有效。盡管一些藥物的療效仍存在爭(zhēng)議，但如利巴韋林、干擾素（IFN）、法匹拉韋（FPV）和洛匹那韋（LPV）/利托那韋（RTV）等藥物已被用于治療SARS或MERS患者。最近研究表明，作為一種前藥，F(xiàn)PV的最大半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）= 61.88 μmol·L–1、最大半數(shù)細(xì)胞毒性濃度（CC50）> 400 μmol·L-1、選擇性指數(shù)（SI）> 6.46。FPV有效抑制了SARS-CoV-2對(duì)Vero E6細(xì)胞（ATCC-1586）[7]的感染。此外，其他報(bào)道顯示，盡管FPV在Vero E6細(xì)胞中的EC50值高達(dá)67 μmol·L–1，但FPV對(duì)小鼠的埃博拉病毒感染亦有保護(hù)作用[8]。因此，臨床研究迫切需要評(píng)估這種抗病毒核苷對(duì)COVID-19治療的療效和安全性。

在本研究中，我們對(duì)深圳市第三人民醫(yī)院收治的COVID-19患者的臨床療效進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，目的是通過(guò)對(duì)比接受FPV治療的患者和接受LPV/RTV治療的患者之間的臨床結(jié)果，為感染SARS-CoV-2的患者的治療提供有價(jià)值的信息。

2. 研究方法

2.1. 研究設(shè)計(jì)

2.2. 入組標(biāo)準(zhǔn)

所有納入FPV治療組和LPV/RTV對(duì)照組的患者均需符合入組標(biāo)準(zhǔn)。入組標(biāo)準(zhǔn)包括：①年齡為16～75 歲（包含16歲和75歲）；②鼻咽拭子樣本檢測(cè)新冠病毒RNA呈陽(yáng)性；③發(fā)病至入院時(shí)間小于7天；④愿意在研究期間和治療后7天內(nèi)采取避孕措施；⑤吞咽藥物無(wú)困難。不符合入組標(biāo)準(zhǔn)的條件包括：①嚴(yán)重的臨床癥狀[符合下列標(biāo)準(zhǔn)之一：呼吸頻率每分鐘大于30次，靜息狀態(tài)下血氧飽和度低于93%，氧合指數(shù)（OI）< 300 mmHg（1 mmHg =133.3 Pa），呼吸衰竭、休克或其他需要ICU監(jiān)護(hù)的合并器官衰竭]；②終末期慢性肝腎疾?。虎奂韧鶎?duì)FPV或LPV/RTV藥物有過(guò)敏史；④孕婦或哺乳期婦女；⑤妊娠試驗(yàn)呈陽(yáng)性、哺乳、流產(chǎn)或產(chǎn)后兩周內(nèi)的育齡婦女；⑥參與過(guò)其他抗COVID-19的臨床試驗(yàn)或過(guò)去28天內(nèi)接受過(guò)抗SARS-CoV-2治療。

2.3. 干預(yù)措施

治療組：口服FPV片（浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，每片200 mg）。第1天：給藥兩次，每次1600 mg；第2～14天：每天兩次，每次600 mg。用藥至病毒清除，療程不超過(guò)14天。

對(duì)照組：口服LPV/RTV片（艾伯維公司生產(chǎn)，每片200 mg/50 mg）。每天兩次，每次LPV 400 mg /RTV 100 mg。用藥至病毒清除，療程不超過(guò)14天。

其他治療：兩組均接受干擾素IFN-α1b（北京三元基因制藥有限公司生產(chǎn)，每瓶30 μg）霧化吸入，每天兩次，每次60 μg。除此之外，住院患者的基本治療還包括吸氧、口服或靜脈補(bǔ)液、退熱藥、止痛藥和止吐藥等對(duì)癥支持治療。

2.4. 有效性評(píng)價(jià)

本研究通過(guò)患者治療后第14天的病毒清除時(shí)間和胸部CT掃描的改善率來(lái)評(píng)估治療的有效性。在治療后第4、9和14天對(duì)患者進(jìn)行胸部CT掃描，所有胸部CT影像學(xué)結(jié)果由兩位資深放射診斷醫(yī)師按照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9,10]進(jìn)行雙盲閱片。CT影像學(xué)結(jié)果可分為三級(jí)：1為CT正常、2為磨玻璃密度影、3為固實(shí)變影。將兩肺各分為上、中、下三部分，上部為氣管隆突以上區(qū)域、中部為氣管隆突與下肺靜脈之間區(qū)域、下部為下肺靜脈以下區(qū)域，共6個(gè)區(qū)域。對(duì)每個(gè)區(qū)域內(nèi)滲出性病變所占范圍進(jìn)行5級(jí)法評(píng)分[10]：0級(jí)：0分，正常肺組織；1級(jí)：1分，病變面積＜該區(qū)域面積25%；2級(jí)：2分，病變面積占該區(qū)域面積的25%～50%：3級(jí)：3分，病變面積占該區(qū)域面積的50%～75%；4級(jí)：4分，病變面積＞該區(qū)域面積的75%?？偟梅譃槿胃鲄^(qū)域得分之和，數(shù)值范圍為0～72，如圖1所示。胸部CT“改善”的變化被定義為總得分低于用藥前，“較差”的變化被定義為總得分高于用藥前；“無(wú)明顯變化”的變化被定義為總得分與治療前相同（圖1）。

SARS-CoV-2的檢測(cè)采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）方法進(jìn)行，如文獻(xiàn)[5]所述。我們使用QIAamp RNA病毒試劑盒（凱杰，德國(guó)）從樣本中提取病毒核糖核酸（RNA），并且使用商業(yè)試劑盒進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR），用于SARS-CoV-2檢測(cè)。病毒清除的概念定義為在24 h內(nèi)連續(xù)出現(xiàn)兩個(gè)qPCR檢測(cè)陰性結(jié)果。

漢江流域納入《全國(guó)重要江河湖泊水功能區(qū)劃（2011—2030年）》名錄內(nèi)的水功能區(qū)共110個(gè)，其中保護(hù)區(qū)15個(gè)、保留區(qū) 38個(gè)、緩沖區(qū)9個(gè)、開(kāi)發(fā)利用區(qū)20個(gè)。

2.5. 安全性分析

使用問(wèn)卷調(diào)查不良事件發(fā)生情況并綜合分析實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果。

圖1. 一位接受FPV治療的56歲的女性COVID-19患者的胸部CT掃描評(píng)分。（a～c）FPV治療前的部分胸部CT圖像，評(píng)分為15分；（d～f）FPV治療后第12天的部分胸部CT圖像，評(píng)分為6分。

2.6. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

兩組患者基線數(shù)據(jù)比較：定量數(shù)據(jù)被描述為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，或中位數(shù)[四分位間距（IQR）]；定性數(shù)據(jù)用病例數(shù)（比例，%）描述；分類數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)；連續(xù)數(shù)據(jù)采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)。主要療效指標(biāo)及安全性指標(biāo)的比較：兩組患者病毒清除時(shí)間的比較采用Kaplan-Meier法計(jì)算，以及不同治療條件下病毒清除時(shí)間的差異性分析采用log-rank檢驗(yàn)計(jì)算。多因素分析評(píng)價(jià)干預(yù)對(duì)結(jié)果的影響：?jiǎn)我蛩睾投嘁蛩谻ox回歸模型分析病毒清除率的潛在影響因素。統(tǒng)計(jì)顯著性要求P值小于0.05。所有的分析都采用SPSS Version 22.0和GraphPad Prism 7.0完成。

3. 結(jié)論

3.1. 患者與基線分析

從2020年1月30日起，對(duì)56例實(shí)驗(yàn)室確診的COVID-19患者進(jìn)行篩選，其中35例患者符合FPV治療組的入組標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)2020年1月24日至1月30日期間開(kāi)始接受LPV/RTV治療的91例經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確診的COVID-19患者進(jìn)行篩選，其中45例患者符合本研究中對(duì)照組的入組條件。所有入組患者均完成了治療，并于治療開(kāi)始后的14天內(nèi)對(duì)其進(jìn)行隨訪，具體流程如圖2所示。比較FPV治療組和LPV/RTV對(duì)照組的所有基線特征，結(jié)果如表1所示，兩組的基線特征無(wú)顯著差異。所有患者均為國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)確定的輕癥病例。

3.2. 抗病毒治療效果比較

兩組患者抗病毒治療直至病毒清除時(shí)的Kaplan-Meier生存曲線如圖3所示。接受FPV治療的患者的病毒清除中位時(shí)間約為4天（IQR：2.5～9），與對(duì)照組患者的病毒清除中位時(shí)間11天（IQR：8～13）相比顯著減少（P< 0.001）。第18天和第21天，F(xiàn)PV治療組中的兩名患者的鼻咽拭子病毒RNA檢測(cè)結(jié)果分別轉(zhuǎn)為陰性。對(duì)照組患者27天內(nèi)病毒RNA檢測(cè)結(jié)果全部轉(zhuǎn)陰。

3.3. COVID-19 患者胸部CT 變化

圖2. 深圳市第三人民醫(yī)院FPV及LPV/RTV治療COVID-19患者臨床試驗(yàn)流程圖。

表1 兩組患者的基線特征

采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，確定兩組患者的胸部CT變化差異的顯著性（表2）。采用χ2檢驗(yàn)對(duì)兩組患者治療后第4、9和14天的胸部CT變化的改善率進(jìn)行比較。兩組患者的胸部CT變化的改善率在第4天和第9天沒(méi)有顯著差異（P> 0.05）。在治療后的第14天，F(xiàn)PV治療組患者的胸部CT變化的改善率顯著高于對(duì)照組（P= 0.004）。

根據(jù)病毒清除時(shí)間將患者分為兩組。病毒清除時(shí)間低于7天（包括7天）的患者在治療后第14天的胸部CT變化的改善率要高于病毒清除時(shí)間大于7天的患者胸部CT變化的改善率（圖4）。

（續(xù)表）

圖3. 兩組患者抗病毒治療直至病毒清除時(shí)的Kaplan-Meier生存曲線。

3.4. 多因素分析評(píng)價(jià)FPV 對(duì)胸部CT 變化的影響

在進(jìn)行多因素分析之前，使用χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析。單因素分析中的顯著變量（P< 0.10）為抗病毒治療以及是否發(fā)熱。多因素logistic回歸分析采用胸部CT變化（0 =無(wú)變化或惡化、1 =改善）作為因變量，單因素分析選擇顯著變量（包括年齡、基礎(chǔ)疾病和疾病嚴(yán)重程度）作為自變量。結(jié)果表明，模型中有兩個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素，即抗病毒治療[優(yōu)勢(shì)比（OR）= 3.190，95%置信區(qū)間（CI）= 1.041～9.78]和發(fā)熱（OR = 3.622，95% CI =1.054～12.442）。這表明在控制了混雜因素之后，抗病毒治療和發(fā)熱是影響胸部CT變化的獨(dú)立因素。經(jīng)FPV治療后的患者胸部CT改善更明顯（表3）。

3.5. 多因素分析評(píng)價(jià)FPV 對(duì)病毒清除時(shí)間的影響

同樣地，在進(jìn)行多因素分析之前，使用log-rank檢驗(yàn)和Cox回歸進(jìn)行單因素分析。單因素分析中的顯著變量（P< 0.10）包括抗病毒治療、血小板、T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和發(fā)病至治療時(shí)間間隔。使用多因素Cox回歸模型研究影響病毒清除的獨(dú)立因素。將病毒清除時(shí)間設(shè)置為TIME變量，將病毒清除（0 =否、1 =是）設(shè)置為狀態(tài)，并且將單因素Cox分析中的顯著變量（P< 0.10），如年齡以及是否有基礎(chǔ)性疾病設(shè)置為自變量。結(jié)果表明該模型是有意義的（P= 0.003）。關(guān)鍵因素如下：T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)[風(fēng)險(xiǎn)比（HR）= 1.002、95% CI = 1.000～1.005]和抗病毒治療（HR = 3.434、95% CI = 1.162～10.148）。在控制其他混雜因素之后，不同藥物處理和T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)是影響病毒清除的獨(dú)立因素。研究結(jié)果表明，與LPV/RTV對(duì)照組相比，F(xiàn)PV治療對(duì)病毒清除效果更好（表4）。

3.6. 用藥后的不良反應(yīng)統(tǒng)計(jì)

FPV治療組的患者用藥后的不良反應(yīng)總數(shù)為4例（11.43%），明顯少于對(duì)照組患者中的25例（55.56%）不良反應(yīng)數(shù)（P< 0.001）。FPV治療組中有2例腹瀉、1例肝損傷和1例無(wú)食欲患者。同時(shí)，LPV/RTV對(duì)照組中出現(xiàn)5例腹瀉、5例嘔吐、6例惡心、4例皮疹、3例肝損傷和2例胸悶患者（表5）。

表2 COVID-19患者治療后的胸部CT變化

圖4. 病毒清除時(shí)間及治療后第14天患者胸部CT變化的改善情況。

4. 討論

在這項(xiàng)針對(duì)COVID-19患者的開(kāi)放性對(duì)照研究中，接受FPV治療的患者比接受LPV/RTV治療的患者具有更快的病毒清除速度和更好的胸部影像學(xué)改變。由于這不是一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、平行的試驗(yàn)，因此，進(jìn)行大規(guī)模的、精心設(shè)計(jì)的驗(yàn)證性試驗(yàn)是非常必要的。然而，鑒于COVID-19在全球范圍內(nèi)的傳播所造成的重大影響，我們的研究結(jié)果可為這種新發(fā)疾病的治療提供有用的信息。

FPV作為一種前藥，是一種新型的RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）抑制劑，F(xiàn)PV已被證明在治療流感和埃博拉病毒方面是有效的[8,11–15]。最近，Wang等[7]的研究報(bào)告顯示，F(xiàn)PV和瑞德西韋均可在體外有效抑制SARS-CoV-2感染（EC50= 61.88 μmol·L–1、CC50> 400 μmol·L–1、SI > 6.46）。本研究表明FPV是一種潛在的COVID-19臨床干預(yù)手段。

本研究的準(zhǔn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)可能在患者招募中存在選擇偏差。然而，考慮同時(shí)出現(xiàn)的患者數(shù)量眾多，且疾病的傳染性極高，從倫理上講，分配患者接受不同的試驗(yàn)藥物是不可接受的，并且隨機(jī)分配過(guò)程是不可行的。此外，在某些不真實(shí)的信息來(lái)源和對(duì)醫(yī)院隔離不信任的背景下，在初始狀態(tài)使用隨機(jī)設(shè)計(jì)可能會(huì)導(dǎo)致更多患者拒絕隔離。因此，我們選擇進(jìn)行一項(xiàng)前后設(shè)計(jì)的試驗(yàn)，該試驗(yàn)將兩個(gè)不同時(shí)期連續(xù)入院的患者分別分為兩個(gè)治療組。由于兩個(gè)治療組的基線特征具有可比性，并且在對(duì)潛在的混雜因素進(jìn)行調(diào)整后，結(jié)果仍保持不變，因此，由混雜偏差產(chǎn)生的影響（如果有的話）并非主要問(wèn)題。

本研究還發(fā)現(xiàn)，早期的病毒清除有助于改善患者第14天的胸部成像。這一發(fā)現(xiàn)提示該病的改善可能取決于SARS-CoV-2的抑制作用，而FPV通過(guò)抑制SARS-CoV-2來(lái)控制COVID-19的病情進(jìn)展。直到目前，COVID-19的發(fā)病機(jī)理還不清楚。由于SARS-CoV-2感染被認(rèn)為是自限性的、以全身炎癥反應(yīng)為特征，因此，對(duì)癥支持治療是WHO和國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)主要推薦的方法。這種特征類似于MERS-CoV，針對(duì)這種情況，研究人員通常采用非特異性的治療措施來(lái)降低危重癥率和死亡率 [16]。抗病毒藥物是如何幫助控制這種疾病的發(fā)生是有爭(zhēng)議的。雖然已經(jīng)有許多針對(duì)COVID-19的抗病毒藥物的臨床試驗(yàn)獲批，但是其使用時(shí)機(jī)、治療時(shí)間和研究終點(diǎn)尚未統(tǒng)一。本研究將病毒清除時(shí)間作為主要終點(diǎn)，用于評(píng)價(jià)FPV對(duì)SARS-CoV-2的抗病毒作用，并成功確定了FPV的優(yōu)先級(jí)。病毒清除時(shí)間與胸部CT改善之間的關(guān)系表明，病毒清除是臨床終點(diǎn)的理想替代方案。本研究的局限性在于病毒滴度與臨床預(yù)后之間的關(guān)系尚不清楚。未來(lái)的研究可能會(huì)更多地關(guān)注這一點(diǎn)。

表3 FPV治療后患者胸部CT變化的logistic回歸分析

表4 病毒清除的Cox回歸分析

對(duì)照組發(fā)生的不良事件多于FPV治療組，不良事件發(fā)生率與既往利用LPV/RTV治療艾滋病的研究相似。值得一提的是，本研究中FPV的治療時(shí)間是治療流感所用時(shí)間的兩倍。然而，試驗(yàn)組的不良事件很少見(jiàn)且耐受，并且沒(méi)有患者需要停止FPV治療。這些結(jié)果表明，如有必要，F(xiàn)PV的治療時(shí)間可以延長(zhǎng)。所有患者均經(jīng)連續(xù)兩次RNA檢測(cè)陰性（間隔24 h以上）及臨床改善后出院，并于指定隔離地點(diǎn)隔離，出院后再隨訪14天。

SARS-CoV-2感染已在全世界迅速蔓延，而目前還沒(méi)有有效的針對(duì)性藥物。當(dāng)前的任務(wù)是進(jìn)行一項(xiàng)精心設(shè)計(jì)的試驗(yàn)，以根據(jù)大量證據(jù)確定有效的治療方法。然而，在這項(xiàng)研究的開(kāi)始，某些條件不允許患者隨機(jī)接受標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理或試驗(yàn)藥物。在此對(duì)照試驗(yàn)的初步研究中，我們發(fā)現(xiàn)FPV在COVID-19患者的疾病進(jìn)展和病毒清除方面顯示出更好的治療效果。我們的研究結(jié)果為治療SARSCoV-2感染提供了初步證據(jù)。另外，我們還介紹了病毒清除時(shí)間可作為抗病毒治療試驗(yàn)的主要終點(diǎn)，而且可能是研究COVID-19相關(guān)治療中設(shè)計(jì)方案的一個(gè)有效替代方案。

致謝

感謝李松教授對(duì)此臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與指導(dǎo)。本工作由國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2017ZX10204401、2018ZX10711001、2017ZX10103011、2018ZX09711003、2020YFC 0841700）、深圳市“三名”醫(yī)學(xué)項(xiàng)目（SZSM201412003、SZSM201512005）、深圳市科技研發(fā)項(xiàng)目（20200207 3000001）、中國(guó)博士后科研基金（2019M660836）、廣東省2020年科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項(xiàng)基金、廣東省科技廳防控新型冠狀病毒感染科技攻關(guān)應(yīng)急專項(xiàng)（2020B111105001）資助完成。

Author’s contributions

Lei Liu, Yingxia Liu, Qingxian Cai, Minghui Yang,Wu Zhong, and Jun Chen contributed to the study design.Qingxian Cai, Minghui Yang, Dan Shu, Junxia Xia, Xuejiao Liao, Dongjing Liu, Yuanbo Gu, Qiue Cai, Xiaohe Li, Jiaye Liu,Ling Peng, Deliang Huang, and Jing Zhang contributed to the collection of clinical data. Qingxian Cai, Minghui Yang, Shurong Zhang, Fuxiang Wang, Li Chen, Shuyan Chen, Zhaoqin Wang, and Zheng Zhang contributed to the data analysis. Qingxian Cai, Minghui Yang, Jun Chen,Yang Yang, Chenguang Shen, Ruiyuan Cao, and Wu Zhong contributed to the manuscript preparation. All the authors have read and approved the manuscript.

Compliance with ethics guidelines

Qingxian Cai, Minghui Yang, Dongjing Liu, Jun Chen,Dan Shu, Junxia Xia, Xuejiao Liao, Yuanbo Gu, Qiue Cai, Yang Yang, Chenguang Shen, Xiaohe Li, Ling Peng,Deliang Huang, Jing Zhang, Shurong Zhang, Fuxiang Wang, Jiaye Liu, Li Chen, Shuyan Chen, Zhaoqin Wang,Zheng Zhang, Ruiyuan Cao, Wu Zhong, Yingxia Liu, and Lei Liu declare no competing interests.