MicroRNA-21-5p 和MicroRNA-18b-5p在大腸癌中的表達(dá)及意義

劉日旭，王 乙，曹 巖，劉明開

(大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 大連116021)

MicroRNA(miRNA)是一種參與轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)水平調(diào)控的內(nèi)源性非編碼小RNA分子,研究發(fā)現(xiàn)，存在于癌癥相關(guān)基因組區(qū)域的脆性位點(diǎn)中的miRNA被異常激活后可轉(zhuǎn)變?yōu)樵┗?，誘導(dǎo)細(xì)胞癌變的發(fā)生[1]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)基因家族，包括PIK3CA、AKT和PTEN，是人類各種癌癥中最常見的突變基因之一。PI3K途徑突變可以直接增強(qiáng)PIK3CA和AKT的信號傳導(dǎo)，也可以通過使PTEN調(diào)節(jié)因子失活的負(fù)性調(diào)控來增強(qiáng)信號傳導(dǎo)。目前腫瘤治療的新策略正在圍繞PI3K-AKT信號通路中重要分子及其靶基因進(jìn)行研究[2]。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)對MicroRNA-21-5p(miR-21-5p)和MicroRNA-18b-5p(miR-18-5p)在大腸組織中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對PI3K在大腸組織中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，探討mir-21-5p和mir-18-5p在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，研究mir-21-5p和mir-18-5p對PI3K/AKT信號通路及其靶基因的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 病例資料

50例病例均為2018年1-9月經(jīng)臨床及組織病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性大腸癌的住院患者。其中男性27例，女性23例，平均年齡61.9歲。

1.2 標(biāo)本來源

病變組(CRC)為大腸癌組織，對照組(NCM)為距腫瘤邊緣超過8 cm的癌旁正常黏膜組織。收集術(shù)中新鮮組織標(biāo)本，用于qPCR檢測的置于液氮保存；用于免疫組化檢測的經(jīng)過10%甲醛固定后石蠟包埋保存。

1.3 方法

1.3.1qPCR方法對大腸組織標(biāo)本進(jìn)行miR-21-5p和miR-18-5p相對表達(dá)量的分析 RNA提取試劑RNAiso Plus Reagent、U6引物、miR-21-5p引物、miR-18-5p引物、RT試劑盒和qPCR試劑盒，來源于大連TaKaRa公司。計(jì)算并評價(jià)RNA純度使用 Thermo NanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)測定RNA在260 nm、280 nm的吸收值。檢測RNA純度及完整性使用變性瓊脂糖凝膠電泳。RT反應(yīng)使用TaKaRa TP600型梯度PCR儀。qPCR反應(yīng)使用TaKaRa TP800型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

按照RNAiso Plus Reagent試劑盒說明書，進(jìn)行大腸癌組織及癌旁組織Total RNA的提取。將Total RNA 10ng作為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄cDNA的合成。用無菌超純水稀釋cDNA 10倍后，以U6引物為內(nèi)參，進(jìn)行qPCR反應(yīng)，檢測miR-21-5p和miR-18-5p的相對含量。RT反應(yīng)條件:37℃，60 min；85℃，5 min。qPCR反應(yīng)條件:95℃，預(yù)變性10 min；95℃，變性10 s；60℃，退火20 s；72℃，延伸30 s，共40個(gè)循環(huán),計(jì)算病變組和對照組的miR-21-5p和miR-18-5p的相對表達(dá)水平采用2-△CT法(△CT=CT目的基因-CTU6)。

1.3.2免疫組化法檢測組織標(biāo)本中PI3K 的表達(dá) 小鼠抗人PI3K單克隆抗體來源于SANTA CRUZ公司；免疫組化試劑盒來源于福州邁新生物。標(biāo)本組織以4-5 μm厚度連續(xù)切片，脫蠟水化后按試劑盒說明書進(jìn)行染色，以已知的大腸癌陽性組織切片為陽性對照，PBS液代替一抗為陰性對照。

標(biāo)準(zhǔn)及判讀：參照文獻(xiàn)方法觀察PI3K的分布和陽性率。細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色為PI3K的陽性表達(dá)。計(jì)數(shù)高倍鏡下4個(gè)不同視野200個(gè)細(xì)胞，以陽性細(xì)胞的百分比為最終結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)。檢測數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果電泳結(jié)果顯示如圖1，OD檢測結(jié)果顯示，A260 nm/A280 nm的比值為1.98，在1.8-2.1范圍內(nèi)，符合qPCR檢測的要求。

圖1 RNA瓊脂糖電泳結(jié)果

2.2 miR-21-5p和miR-18-5p在大腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)qPCR統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在50例配對組織標(biāo)本中，miR-21-5p和miR-18-5p在大腸癌組織中表達(dá)水平顯著高于在癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 miR-21-5p和miR-18-5p在大腸癌組織和癌旁正常黏膜組織的表達(dá)水平

2.3 免疫組化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

免疫組化檢測結(jié)果表明，在50例大腸癌組織中，PI3K陽性細(xì)胞呈彌漫性分布，并多數(shù)聚集成團(tuán)(圖2)，其陽性表達(dá)率為80.3%±1.47%。在50例癌旁正常黏膜組織中，PI3K陽性細(xì)胞呈局限性分布于大腸黏膜腺體間質(zhì)中，呈現(xiàn)散在陽性(圖3)，其陽性表達(dá)率為11.11%±0.69%。PI3K陽性細(xì)胞的分布范圍和反應(yīng)強(qiáng)度在大腸癌組織中均明顯高于癌旁正常黏膜組織(P<0.05)。

2.4 大腸癌組織中miR-21-5p和miR-18-5p與PI3K表達(dá)的相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，大腸癌組織中的miR-21-5p與PI3K表達(dá)水平明顯正相關(guān)(r=0.810,P<0.05)；miR-18-5p與PI3K表達(dá)水平明顯正相關(guān)(r=0.790，P<0.05)。

圖2 PI3K在大腸癌組織的表達(dá)(SP×400)

圖3 PI3K在癌旁正常黏膜組織的表達(dá)(SP×400)

3 討論

近年來，隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的興起，分子生物學(xué)檢測成為腫瘤診斷和治療的重要環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在大腸癌患者組織、血漿和糞便中的表達(dá)明顯失衡[3-5]，通過檢測異常表達(dá)的miRNA，不僅有助于腫瘤的早期篩查，更有助于疾病分型、監(jiān)測、預(yù)后評估及指導(dǎo)用藥[6]。miR-21-5p在腸癌組織中表達(dá)水平明顯升高，并可以通過持續(xù)活化PI3K通路，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲[7]。TOIYAMA等人發(fā)現(xiàn)miR-21-5p在大腸癌患者血漿中表達(dá)水平顯著升高，在診斷及術(shù)后監(jiān)測方面優(yōu)于癌胚抗原(CEA)[8]。miR-18-5p與癌細(xì)胞凋亡有緊密的聯(lián)系，但是miR-18-5p對大腸癌的相關(guān)調(diào)控作用研究較少。Katayama等人研究顯示，肝癌中miR-18-5p表達(dá)水平增高。Murakami等人研究顯示，肝細(xì)胞癌分化程度與miR-18-5p表達(dá)水平負(fù)相關(guān)[9]。ZENG等研究顯示，肺癌中miR-18-5p表達(dá)水平增高[10]。由于miR-18-5p非某器官組織的特異性基因，在大腸癌中表達(dá)也有增加，可能在大腸癌的發(fā)病中起到廣泛的作用。存在于正常組織中的PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，具有正常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。生物信息學(xué)的分析顯示，miR-21-5p和miR-18-5p的靶基因?yàn)镻TEN[11，12]。PTEN調(diào)節(jié)因子的負(fù)性調(diào)控使PI3K/AKT途徑的信號傳導(dǎo)增強(qiáng)導(dǎo)致突變。

本研究發(fā)現(xiàn),miR-21-5p和miR-18-5p在大腸癌組織中的表達(dá)水平均超出癌旁正常黏膜組織數(shù)倍,同時(shí)PI3K蛋白在大腸癌組織中呈現(xiàn)彌漫性高表達(dá)，在大腸癌旁正常黏膜呈現(xiàn)局部性低表達(dá)，二者具有正相關(guān)性。結(jié)合生物信息學(xué)可以推測，大腸組織中的miR-21-5p和miR-18-5p因致癌因素的刺激而過表達(dá)，使PTEN的抑癌功能受限，PI3K/AKT信號通路持續(xù)活化，推進(jìn)大腸癌的發(fā)生和發(fā)展。