東莞地區(qū)熱帶念珠菌臨床分離株耐藥性及基因分型研究

李少洪，郭主聲*,張 莉,林偲思,謝樹金,馮劍波,黃 亞,陳桂鈴,黃曉君,黃 彬

(1.中山大學附屬東莞東華醫(yī)院 微生物室,廣東 東莞523110;2.中山大學附屬第一醫(yī)院 檢驗醫(yī)學部,廣東 廣州510000)

在全球范圍內(nèi)，隨著廣譜抗菌藥物、激素、免疫抑制劑和抗腫瘤藥物的使用及侵入性診療技術(shù)的應用，真菌所致的感染明顯增多。盡管白色念珠菌是院內(nèi)真菌感染的主要致病菌，但是非白念珠菌，尤其是熱帶念珠菌感染的發(fā)病率逐漸增高。根據(jù)ARTEMIS全球抗真菌監(jiān)測網(wǎng)調(diào)查41個國家中的142個醫(yī)療中心所得數(shù)據(jù)，在1997年-2000年間熱帶念珠菌分離率僅為5.4%，在2001-2004年為7.5%，2005-2007年上升為8%[1]。此外，根據(jù)中國醫(yī)院侵襲性真菌監(jiān)測網(wǎng)(National China Hospital Invasive Fungal Surveillance Net，CHIF-NET)數(shù)據(jù)，2010-2014年熱帶念珠菌分離率是15.7%[2]。近年來，在國內(nèi)某醫(yī)院熱帶念珠菌分離率高達25.8%[3]。目前，熱帶念珠菌已經(jīng)成為非白念珠菌中最常見的病原菌。但是，相對于白色念珠菌，關(guān)于熱帶念珠菌的臨床分布特點和藥物敏感性信息相對較少。另外，由于熱帶念珠菌具有容易形成生物膜的特點[4]，使其有較強的黏附性，導致院內(nèi)消毒容易殘留、患者反復感染，甚至出現(xiàn)院內(nèi)播散，因此對菌株進行同源性分析，確證是否出現(xiàn)同一克隆菌株的院內(nèi)傳播具有非常重要的意義[5]?，F(xiàn)對2016年1月-2017年12月期間從中山大學附屬東莞東華醫(yī)院患者標本中分離得到的92株非重復熱帶念珠菌進行臨床分布特點和藥敏結(jié)果分析，并采用采用多位點序列分型法(MLST)對其進行分型，以了解本院熱帶念珠菌感染分布特點和基因分型，為臨床選擇抗真菌藥物提供一定的依據(jù)，也為防控該類菌的感染與傳播提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 標本來源

1.2 儀器和試劑

培養(yǎng)基有血瓊脂平板、沙保羅平板、改良SHADOMY瓊脂真菌藥敏平板和法國科馬嘉顯色培養(yǎng)基。微生物鑒定和藥敏系統(tǒng)有VITEK 2-COMPACT全自動微生物分析儀、真菌鑒定卡YST、ATB FUNGUS3藥敏試劑條和丹麥Rosco酵母菌藥敏紙片、德國Eppendorf公司的Mastercycler nexus PCR擴增儀和微量核酸蛋白檢測儀、以及美國Bio-Rad公司的電泳成像系統(tǒng)。

1.3 病原菌鑒定和ATB FUNGUS3藥敏試驗

按照操作規(guī)程，分純在沙保羅平板上的真菌菌落，轉(zhuǎn)種在科馬嘉顯色培養(yǎng)基，置于35℃培養(yǎng)18-24 h，同時用全自動微生物分析儀的YST卡對其進行進一步鑒定。對于鑒定為熱帶念珠菌的菌落，用ATB FUNGUS3藥敏試劑條檢測此菌種體外對抗真菌藥的敏感性?？拐婢幬锇?-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)，兩性霉素B(Amphotericin B，AMB)，氟康唑(Fluconazole，F(xiàn)CA)，伊曲康唑(Itraconazole，ITR)和伏立康唑(Voriconazole，VRC)，按照說明書操作進行藥敏試驗，其結(jié)果參照CLSI M27-A抗真菌藥敏試驗標準判定。5-FC的MIC≤4 μg/ml為敏感，≥32 μg/ml為耐藥；兩性霉素B的MIC≤1 μg/ml為敏感，≥8 μg/ml為耐藥；FCA的MIC≤8 μg/ml為敏感，≥64 μg/ml為耐藥；ITR的MIC≤0.125 μg/ml為敏感，≥1 μg/ml為耐藥；VRC的MIC≤1 μg/ml為敏感，≥4 μg/ml為耐藥。

1.4 基因組DNA 的提取

用酵母基因組 DNA 提取試劑盒(DP307)提取熱帶念珠菌基因組DNA，具體操作按說明書進行。用微量核酸檢測儀檢測提取DNA的純度和質(zhì)量，符合要求者置于-30℃冷凍保存，用于后續(xù)實驗。

1.5 MLST分型檢測本項目運用多位點序列分型方法(MLST)對熱帶假絲酵母進行同源性分析。首先，提取熱帶假絲酵母基因組，然后根據(jù)數(shù)據(jù)庫pubmlst以及相關(guān)文獻報告選擇6個熱帶假絲酵母菌的管家基因(ICL1、MDR1、SAPT2、SAPT4、XYR1、ZWF1a)進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物測序，測序結(jié)果與標準序列比對后上傳至數(shù)據(jù)庫，然后可分別獲得相應6對管家基因組成的等位基因譜和序列分型編號(ST)，PCR反應體系和引物序列見表1和表2。

表1 PCR反應體系

2) 擴增條件如下：以上6個管家基因擴增條件均為：

1.6 系統(tǒng)進化樹分析將每個菌株的6段管家基因序列片段連接為一整條，應用MEGA 5.2分析軟件，采用非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)對92株熱帶念珠菌進行同源性分型，并繪制進化樹圖，研究熱帶念珠菌菌株之間的相關(guān)性。

因此，小孩若有脾胃疾病如食欲不振、厭食、腹瀉、便秘，肺系疾病如反復感冒、咳嗽，神經(jīng)系統(tǒng)疾病如夜啼、睡眠不安、愛哭鬧等，捏脊療法有一定的治療作用。其中，因在治療小兒食積、食欲不振、消化不良等方面療效尤為突出，故捏脊法又有“捏積”之稱。

1.7 統(tǒng)計學處理采用世界衛(wèi)生組織細菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)提供的WHONET 5.6軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，應用 MEGA 5.2軟件中UPGMA方法進行數(shù)據(jù)處理。計量資料數(shù)據(jù)用(均數(shù)±標準差)表示。計數(shù)資料，采用卡方檢驗或 Fisher確切概率法對分類變量進行構(gòu)成比比較，采用配對卡方檢驗檢測兩種真菌藥敏方法是否具有一致性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表2 多位點序列分型法擴增管家基因引物序列及測序范圍

2 結(jié)果

2.1 年齡分布本研究共鑒定出的非重復熱帶念珠菌92株，在各個年齡組均可見。 21-40歲，41-60歲，61-80歲年齡組菌株數(shù)相近，分別為24株(26.09%)，25株(27.17%)，22株(23.91%)。 而0-20歲和81-100歲年齡組菌株較少，分別為8株(8.70%)和13株(14.13%)。 平均年齡為(51.56±24.04)歲。

2.2 性別分布92株熱念菌株來自男性55株，女性37株，構(gòu)成比分別為59.78%和40.22%。

2.3標本類型分布標本主要來源于尿液(40株)，傷口分泌物(14株)，血液(10株)，灌洗液(8株)，生殖道分泌物(7株)，引流液(7株)。余下6株分別來自胸水，膽汁，膿液，腦脊液，穿刺液和大便各1株。

2.4 臨床科室分布分離出的熱帶念株菌來源于前三的臨床科室分別為： ICU20株(21.74%)，急診病區(qū)12株(13.04%)，神經(jīng)外科12株(13.04%)。 婦產(chǎn)科和兒科的菌株分別來自陰道分泌物標本5株(5.43%)和全血標本4株(4.35%)。除去 ICU、急診病區(qū)、婦產(chǎn)科和兒科，在普通病房中，外科病房分離出28株(30.43%)，略高于內(nèi)科病房分離率(25.00%)。在外科病房中，神經(jīng)外科分離率最高。內(nèi)科病房的熱帶念株菌主要分離自腫瘤內(nèi)科(4株)、血液內(nèi)科(4株)、腎病風濕科(4株)、內(nèi)分泌科(3株)和呼吸內(nèi)科(3株)。

2.5 藥敏結(jié)果藥敏試驗用ATB FUNGUS3試劑條。92株熱帶念珠菌從21-40歲患者分離出的熱帶念珠菌的FCA、ITR和VRC敏感率最高，分別為為87.5%、66.7%，91.7%。 而從41-60歲患者分離出的菌株對FCA、ITR和VRC敏感率最低，分別為為68.0%、44.0%和72.0%。來自女性和男性患者的分離株的 FCA、 ITR和 VRC敏感率依次為75.7%和 78.2%、51.4%和50.9%、81.1%和80.0%。來不同科室熱帶念珠菌的抗真菌制劑敏感率是不一致的，其中，分離自婦產(chǎn)科病區(qū)的熱念菌敏感性最高，對5- FC、 AMB、 FCA和 VRC的體外敏感性全是100%，而對 ITR的敏感性是80%； 然而，內(nèi)科病區(qū)分離出的熱念菌體外對唑類制劑的敏感性最低，其 FCA，ITR和 VRC敏感率分別為56.50%、39.10%和56.50%。兒科病區(qū)分離出的熱念菌對FCA和ITR敏感率也偏低，分別為75%和50%。 卡方檢驗結(jié)果表明：只有不同科室分離出的熱帶念珠菌的FCA、ITR和VRC體外藥敏試驗結(jié)果的差異性分布具有統(tǒng)計學意義。不同年齡、不同性別及不同科室來源分離的熱念菌株的FCA、ITR和VRC敏感率見表3。

用ROSCO紙片法對92株熱念菌進行藥敏實驗，結(jié)果為： AMB 、FCA、ITR和VRC敏感率分別為100%、84.78%、41.30%和84.78%；而用ATB FUNGUS3試劑條進行藥敏試驗，結(jié)果為AMB、FCA、ITR和VRC敏感率分別為100%、85.87%、56.52%和89.13%，藥敏結(jié)果比較詳見表4。

2.6 MLST分型分析和系統(tǒng)進行樹分析92株熱帶念珠菌的ICL1、MDR1、SAPT2、SAPT4、XYR1、ZWF1a管家基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳圖譜結(jié)果與預期結(jié)果一致，且條帶清晰，后測序結(jié)果上傳與標準MLST數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)熱熱帶念珠菌的4個管家基因ICL1、MDR1、SAPT2、SAPT4等位基因編號為1、7、22、52，對XYR1和ZWF1a管家基因的比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在突變，為新的ST型(STnew1-STnew72)，占總菌數(shù)的78.3%(72株)。92株臨床分離株聚成三大簇，26株唑類耐藥株在進化樹中呈集中分布，其中有24株分布于第一簇(平均遺傳距離為0.007)中，且22株聚集于一個分支上；有2株分布于第二簇，但處于距離第一簇接近的位置。

表3 不同年齡、不同性別及不同科室來源分離的熱帶念珠菌對氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的敏感率

表4 K-B法和MIC法對92株熱帶念珠菌的敏感性

3 討論

除了白色念珠菌，熱帶念珠菌是侵襲性真菌病的最主要致病菌，可引起真菌血癥和全身播散性感染。熱帶念珠菌常被認為在毒力和臨床重要性上僅次于白念珠菌，盡管近年來 在一些區(qū)域這種流行病學特點轉(zhuǎn)移到光滑念珠菌和其它非白念珠菌[4]。不同地區(qū)之間的熱念菌分離率、臨床分布特點和耐藥性存在一定差異。熱帶念珠菌具有獨特的熱帶氣候分布性，其在念珠菌血癥的分離率隨著地理位置不同而改變： 美國12%-25%、歐洲4.5%-9%、巴西20%-24%、南亞20%-60%以上[6]。有研究證實，熱帶念珠菌血癥常見于血液系統(tǒng)腫瘤、中性粒細胞缺乏的病患[7]。 同其它研究一致，本研究92株熱帶念珠菌有10株分離自血液標本，主要來源于血液科、腫瘤內(nèi)科和ICU患者。 值得注意的是，有4株(4.35%)分離自兒童血液標本，其中3株來自新生兒。 早產(chǎn)兒、極低體重兒、使用呼吸機、留置中心靜脈導管、長時間使用抗生素特別是三代頭孢抗生素、靜脈營養(yǎng)是新生兒發(fā)生真菌血癥的高危要素[8]。 最近的一份研究報道指出：兒童突破性真菌血癥是引起死亡的一個顯著獨立因素[9]。真菌血癥的早發(fā)現(xiàn)、診斷及治療對于新生兒是至關(guān)重要的。

除了菌血癥，念珠菌還常感染泌尿系統(tǒng)，且常以院內(nèi)感染的形式出現(xiàn)，而社區(qū)獲得性感染在尿路結(jié)構(gòu)正常的人群中較少發(fā)生[10]。念珠菌可通過血流進入尿路(順行感染)或在尿道處或附近定植而上行進入尿路(逆行感染)[11]。熱帶念珠菌是侵襲泌尿系統(tǒng)最常見的非白念珠菌。 本研究中40株熱帶念珠菌分離自尿液標本，主要來自ICU、急診病區(qū)、神經(jīng)外科病房患者。 這可能因為這些科室患者多為病情危重復雜，需長期臥床、留置導尿管、長期使用抗菌藥物或糖皮質(zhì)激素而導致菌群分布異常和失調(diào)。

關(guān)于本研究中的92株熱帶念珠菌，ICU科室分離鑒定率最高(21.74%)。 20株分離自 ICU患者的熱帶念珠菌標本分別是尿液(8株)、引流液(6株)、傷口分泌物(3株)、外周靜脈血(2株)和腦脊液(1株)。 由于基礎(chǔ)疾病重、免疫力下降、身上多種留置管道(導尿管、引流管、中心靜脈管路和氣管插管或切開等)和廣譜抗菌藥物泛用，入住 ICU的病患易受真菌侵襲，且感染率較普通病區(qū)高[12]。除了白念和近平滑念珠菌，熱念菌亦是ICU常見致病真菌。而留置管道的地方常易受真菌感染，比如血液、尿道、呼吸道和胸腹腔等。

由于可口服、生物利用度高且副作用較小，F(xiàn)CA是臨床上最常用的唑類抗真菌制劑。熱念菌在世界范圍內(nèi)對唑類制劑的耐藥率是不同的： 亞洲地區(qū)熱帶念珠菌FCA耐藥率11%-15%，高于美國(常低于7%)和歐洲(0-12%)[12-13]。 CHIF- NET研究中心監(jiān)測中國10家三甲醫(yī)院獲取的數(shù)據(jù)可知，熱帶念珠菌對 FCA的 非敏感率從2010年的11.2%增長至2014年42.7%。 本研究中熱帶念珠菌的非敏感率將近23%，稍高于 CHIF- NET監(jiān)測網(wǎng)2014年廣州某醫(yī)院18%的非敏感率，這可能與近年本院加大使用 FCA來預防念珠菌感染有關(guān)。分離自內(nèi)科病房患者的熱念珠菌，其FCA非敏感率最高(43.5%)。值得注意的是，來自血液科患者全血的4株熱帶念珠菌，對FCA、ITR和VRC均耐藥。由于熱帶念珠菌易侵襲血液惡性腫瘤、中性粒細胞缺乏和骨髓移植病患，引起真菌血癥和全身播散性感染，所以唑類藥物常被血液科用于預防性真菌感染，這可能導致唑類耐藥率高于其他臨床科室[6]。

在本次研究中，92株熱帶念珠菌對5- FC、 AMB、 FCA和 VRC體外敏感率分別為100%、100%、85.87%和89.13%，而對 ITR的敏感率只有56.52%，劑量依賴性敏感率30.43%。 ITR體外藥敏的敏感率偏低，這可能是因為體外藥敏試驗中念珠菌對 ITR的判斷是參照黏膜感染的標準制定的，而親脂性很強的 ITR在多種組織中的濃度超過血液藥物濃度，且 ITR在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物羥基伊曲康唑同樣能抑制念珠菌[14]。 因此臨床使用的ITR對不同感染部位的抗真菌療效可能會不同。

值得注意的是，在唑類制劑耐藥性增加的同時，熱帶念珠菌對這類藥物出現(xiàn)了交叉耐藥。在ARTEMIS研宄里，其中對FCA耐藥的熱念菌中，只有17%的菌株對VRC敏感，而67.7%的菌株同時產(chǎn)生ITR交叉耐藥[1]。 而本研究中，13株對FCA、ITR和VRC交叉耐藥； 16株耐FCA的菌株100%對ITR和VRC非敏感，其中81.25%和87.5%菌株分別對ITR和VRC耐藥。大部分的耐藥菌株分離自ICU、急診病區(qū)和血液科。

MLST是目前分子分型經(jīng)常使用的方法，并在流行病學的應用已經(jīng)得到研究的支持，例如評估局部感染、評價菌群結(jié)構(gòu)等[15],本研究運用MLST對熱帶念珠菌進行同源性分析，92株熱帶念珠菌的ICL1、MDR1、SAPT2、SAPT4、XYR1、ZWF1a管家基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳圖譜結(jié)果與預期結(jié)果一致，且條帶清晰，后測序結(jié)果上傳與標準MLST數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)熱熱帶念珠菌的4個管家基因ICL1、MDR1、SAPT2、SAPT4等位基因編號為1、7、22、52，對XYR1和ZWF1a管家基因的比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在突變，共產(chǎn)生72株突變新系列型，92株臨床分離株聚成三大簇，26株唑類耐藥株在進化樹中呈集中分布，其中有24株分布于第一簇中，且22株聚集于一個分支上，說明這些唑類耐藥性在親緣關(guān)系上十分接近。