大黃酚通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞的TNF-α從而改善LPS誘導(dǎo)的小鼠炎癥反應(yīng)

朱 培，閆東梅，鄭 偉

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)系，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林省一汽總醫(yī)院 質(zhì)量控制部,吉林 長(zhǎng)春130061)

大黃是一種傳統(tǒng)中草藥。根據(jù)古代中醫(yī)書(shū)籍《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，大黃主要有三種主要的藥理作用：①清理腸道消化不良內(nèi)容物，使腸道通暢；②消除體內(nèi)毒素并減輕炎癥；③增強(qiáng)新陳代謝，改善器官功能[1]。大黃的主要活性成分包括大黃酚、大黃酸、大黃素等[2-3]，其中大黃酚是蒽醌家族的成員，具有抗癌、保肝、抗菌抗炎等生物學(xué)功能[4-5]，但是是否具有改善膿毒血癥的作用，以及其抗炎機(jī)制還不清楚。

膿毒血癥引起的全身炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致器官功能障礙綜合征的主要原因之一[6-7]，大黃與抗生素合用的方案治療膿毒血癥能夠起到明顯的改善及緩解全身炎癥反應(yīng)的作用，大大提高了患者的生存率和治愈率[8-9]。先天性免疫應(yīng)答的早期激活與膿毒血癥的發(fā)病機(jī)理有關(guān)[10]，其中激活的巨噬細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是膿毒血癥“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的主要來(lái)源之一，對(duì)宿主早期的炎癥發(fā)展至關(guān)重要[11]。

本研究通過(guò)給小鼠腹腔注射脂多糖(LPS)建立小鼠炎癥模型，觀察不同濃度的大黃酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠炎癥模型肝組織和肺組織損傷的影響以及血清中炎癥因子TNF-α水平，探究大黃酚在大黃抑制全身炎癥中的作用。此外，我們通過(guò)檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在基因水平上表達(dá)炎癥因子的情況，探討大黃酚是否能夠抑制巨噬細(xì)胞表達(dá)TNF-α。本研究為探究大黃在臨床全身嚴(yán)重炎癥中的作用機(jī)制提供了一個(gè)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 大黃酚(純度≥98%，貨號(hào)：SC8260)購(gòu)自中國(guó)北京索萊寶科技有限公司，用N,N二甲基甲酰胺∶吐溫80∶生理鹽水=1∶1∶8溶解； LPS(貨號(hào)：L8880-10 mg)購(gòu)自中國(guó)北京索萊寶科技有限公司； TNF-α酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(貨號(hào)：SEA133Mu)購(gòu)自武漢克隆科技股份有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)液(貨號(hào)：01-052-1ACS)、胎牛血清FBS(貨號(hào)：04-001-1A)均購(gòu)自沈陽(yáng)匯佰生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑及QPCR試劑均購(gòu)自長(zhǎng)春海靈科貿(mào)有限公司。

1.1.2主要儀器 細(xì)胞用超凈臺(tái)為中國(guó)蘇凈安泰產(chǎn)品；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱為日本SANYO產(chǎn)品；顯微鏡為德國(guó)蔡司倒置熒光顯微鏡；QPCR儀為美國(guó)ABI 7300；多功能酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Rad產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 6-8周清潔級(jí)BALB/C小鼠，體重(20±2)g，購(gòu)自長(zhǎng)春市億思實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(吉)2016-0003，飼養(yǎng)溫度26-28 ℃，濕度60 %-80 %，光照12 h/12 h。分組情況：小鼠隨機(jī)分為5組：正常組(Normal control)、LPS組(10 mg/kg LPS+vehicle)、大黃酚給藥組(10 mg/kg)(LPS+10 mg/kg)、大黃酚給藥組(1 mg/kg)(LPS+1 mg/kg)、大黃酚給藥組(0.1 mg/kg)(LPS+0.1 mg/kg)，每組6只。

1.2.2小鼠給藥方法 第一天：正常組給生理鹽水作為對(duì)照，其余4組小鼠腹腔注射給LPS(10 mg/kg)制備炎癥模型，1 h后腹腔注射給予大黃酚，24 h和48 h重復(fù)給藥1次。

1.2.3HE染色檢測(cè)小鼠肝和肺組織的病理改變 取小鼠肝組織和肺組織，固定在4%中性福爾馬林固定液中，經(jīng)脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片后，進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察組織的病理學(xué)改變，并進(jìn)行肝組織損傷評(píng)分和肺組織損傷評(píng)分[12]。

1.2.4ELISA檢測(cè)小鼠血清中TNF-α的含量 將取出的小鼠血液在常溫靜置4 h后，3 000 r/min離心20 min，取上層血清。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)TNF-α。

1.2.5小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的收取及培養(yǎng)方法 將處死的小鼠在75 %的醫(yī)用酒精中浸泡2 min，置于超凈臺(tái)中，無(wú)菌操作取出小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，400 g 離心5 min，棄去上清，用10 ml含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸將細(xì)胞置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)4 h后貼壁，收取細(xì)胞，并提取總RNA。

1.2.6QPCR方法檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中TNF-α及iNOS的表達(dá)情況 用Trizol試劑提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，根據(jù)QPCR試劑盒說(shuō)明對(duì)β-actin、TNF-α進(jìn)行檢測(cè)?；蛞铮害?actin上游5’-GACTTCAACAGCAACTCCCACTC-3’，下游5’-TAGCCGTATTCATTGTCATACCAG-3’； TNF-α 上游5’- GGTGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3’，下游 5’- GCCATAGAACTGATGAGAGGGAG-3’。以β-actin為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt法計(jì)算TNF-α的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Student’s T test分析,P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)源于3至6個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可計(jì)算的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。

2 結(jié)果

2.1 黃酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠炎癥模型中肝和肺組織病理學(xué)改變的影響

我們通過(guò)觀察正常組(Normal control)、LPS組(LPS+vehicle)、大黃酚給藥組(LPS+10 mg/kg)3組小鼠肝和肺HE染色的組織切片發(fā)現(xiàn)，LPS組的小鼠表現(xiàn)為細(xì)胞密度降低、細(xì)胞間隙增大的肝組織損傷特征，而LPS+10 mg/kg大黃酚組顯示細(xì)胞間隙降低、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少(見(jiàn)圖1A)，圖1B為肝組織損傷評(píng)分。此外，LPS組的小鼠還表現(xiàn)出急性肺泡損傷和炎癥的特征，例如充血、中性粒細(xì)胞積聚和肺泡壁明顯增厚，而LPS+10 mg/kg大黃酚組顯示LPS誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥得到改善，甚至還可見(jiàn)到正常組織學(xué)特征(見(jiàn)圖1C)，圖1D為肺組織損傷評(píng)分。

2.2 大黃酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠炎癥模型血清中TNF-α水平的影響

用ELISA方法檢測(cè)血清中TNF-α的含量。結(jié)果顯示10 mg/kg的大黃酚給藥組(LPS+10 mg/kg)明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的血清中TNF-α水平的升高，見(jiàn)圖2。

圖1 小鼠肝組織和肺組織HE染色結(jié)果

圖2 小鼠血清中TNF-α水平

2.3 大黃酚對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠炎癥模型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)炎癥因子的影響

為了進(jìn)一步探討大黃酚抑制小鼠炎癥的相關(guān)機(jī)制，我們?nèi)⌒∈蟾骨痪奘杉?xì)胞，并提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用QPCR的方法檢測(cè)5組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中炎癥因子TNF-α的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3所示，10 mg/kg的大黃酚給藥組明顯抑制了LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表達(dá)TNF-α。

3 討論

全身炎癥反應(yīng)是膿毒血癥引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥的主要原因，且臨床膿毒血癥的死亡率極高，但是目前還沒(méi)有針對(duì)膿毒血癥的特定治療方法和高效藥物。大黃制劑與常規(guī)治療的聯(lián)合應(yīng)明顯降低了膿毒血癥的致死率，這值得我們?nèi)ヌ骄看簏S的作用機(jī)制。大黃酚是大黃的重要生物活性成分之一，近年來(lái)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)大黃酚單獨(dú)使用也具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。

圖3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表達(dá)TNF-α的情況

研究發(fā)現(xiàn)，大黃酚能夠通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NF-κB和caspase-1的活化從而抑制其表達(dá)TNF-α、白介素6(IL-6)和環(huán)氧化酶2(COX-2)[4]。此外，大黃酚還能夠抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥因子一氧化氮(NO)和TNF-α[13]，且在小鼠腦缺血再灌注模型中，大黃酚能夠通過(guò)抑制腦組織表達(dá)C0X-2和基質(zhì)金屬蛋白酶9( MMP-9)減輕炎癥反應(yīng)[14]，這表明大黃酚可能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)起到保護(hù)作用。近期研究發(fā)現(xiàn)大黃酚對(duì)乳腺癌、卵巢癌、絨毛膜癌、肺癌、肝癌以及結(jié)腸癌都顯示出抗腫瘤作用[15-16]，相關(guān)機(jī)制可能與大黃酚能夠抑制細(xì)胞增殖或通過(guò)靶向NF-κB、AKT/ERK1/2等信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡等途徑有關(guān)[5,17]。

在本研究中，LPS明顯誘導(dǎo)了小鼠的炎癥反應(yīng)，并且在LPS刺激72小時(shí)后，血清中的TNF-α依舊是正常對(duì)照組的2倍，而給10 mg/kg大黃酚治療的小鼠血清中TNF-α的水平幾乎接近正常組，這說(shuō)明大黃酚能夠明顯抑制機(jī)體全身炎癥的發(fā)展。通過(guò)收集腹腔巨噬細(xì)胞檢測(cè)其在基因水平上表達(dá)TNF-α的情況，我們進(jìn)一步明確了大黃酚能夠通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞表達(dá)炎癥因子來(lái)抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究為大黃酚在臨床上的治療提供了理論依據(jù)。