正交試驗優(yōu)選雞血藤總黃酮提取工藝

王有娣， 鐘麗娟， 徐娟娟， 許潔涵， 張煥欣， 林 嫻， 陳心想， 姚小麗

（中山大學(xué)新華學(xué)院藥學(xué)院，廣東廣州 510520）

雞血藤為豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn）的干燥藤莖，其對控制機體正常的新陳代謝起著重要作用，也可在一定程度上維護動物體內(nèi)生物的平衡，促進動物體健康、防治疾病，所以雞血藤目前已作為飼料添加劑使用。雞血藤化學(xué)成分復(fù)雜多樣，含有蛋白質(zhì)、多種維生素和血質(zhì)紅色素、礦物質(zhì)，以及多種重要的黃酮類化合物（劉曉艷等，2020；Keiko Inami等，2019；廖輝等，2017；陳乾平等，2016）。黃酮類化合物是普遍存在于植物中的一類生物活性成分，具有抗氧化、增強免疫、抗感染、抗菌、抗病毒、抗過敏等多種生物活性；另外，黃酮類化合物對動物的生產(chǎn)性能有明顯的促進作用，其作為飼料添加劑有助于動物的健康育肥和免疫力的提高，同時對于提高肉類品質(zhì)具有重要意義，因此受到廣泛關(guān)注 （楊恒強等，2020；要瑞麗等，2014；馮香安等，2011）。目前 關(guān)于雞血藤的生物活性研究已有不少 （曹斌等，2017；許晴等，2016），但對其黃酮類成分提取工藝的研究卻不多，因此，本試驗在參考鄭潔旋等（2016）植物總黃酮的提取工藝研究方法上，以單因素考察為試驗基礎(chǔ)，再對乙醇濃度、提取時間、提取溫度、液料比四個因素進行正交試驗，研究雞血藤總黃酮的最佳提取工藝，為進一步開發(fā)利用雞血藤提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 組織搗碎機（FW-17型號）；六聯(lián)索氏提取器（SOX606型，海能）；紫外可見分光光度計 （UV-2201，日本島津公司）；電子天平（AUY120型，日本島津公司）。

雞血藤藥材采購于嶺南中藥飲片有限公司（粉碎備用）；蘆丁對照品購于中國藥品生物制品檢定所（純度為98%）；無水乙醇、石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鹽酸等試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制 蘆丁對照品母液：精密稱量蘆丁標準品9.3 mg，加少量50%乙醇溶解，超聲（100 Hz，30 min），移液至 100 mL 的容量瓶，用50%乙醇定容至刻度。精密稱取蘆丁對照品母液 0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 置 25 mL 容量瓶，分別加入5%亞硝酸鈉1 mL，靜置6 min，加入 10% 的硝酸鋁 1 mL，靜置6 min，加入 1 mol／L的氫氧化鈉溶液10 mL，用50%乙醇定容至標線，搖勻，靜置15 min，用紫外可見分光光度計（λ=510 nm）測定吸光度值，以吸光度為縱坐標（y），以蘆丁濃度為橫坐標（x）進行線性回歸，繪制蘆丁標準曲線。

1.2.2 雞血藤總黃酮提取率的測定 根據(jù)蘆丁標準曲線計算樣品中總黃酮的質(zhì)量濃度，通過以下公式計算提取率。

式中：C為雞血藤總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為樣品液體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 雞血藤總黃酮單因素試驗 以雞血藤總黃酮的提取率為指標，乙醇濃度 （40%、50%、60%、70%、80%、90%）、提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、提取溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）和料液比（1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1：40）為 考察因素進行單因素試驗。

1.2.4 正交試驗 以單因素試驗考察為基礎(chǔ)，用乙醇濃度（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）、料液比（D）為影響因素，采用四因素三水平設(shè)計正交試驗方案，以雞血藤總黃酮的提取率為衡量指標。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2016軟件對標準曲線數(shù)據(jù)和單因素試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、分析。采用正交設(shè)計助手II v3.1軟件對正交試驗數(shù)據(jù)進行方差統(tǒng)計等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制 以吸光度為縱坐標（y），以蘆丁濃度為橫坐標（x）進行線性回歸，得回歸方程為y=12.573x-0.0007，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9991，表明蘆丁在檢測濃度范圍內(nèi)線性良好，蘆丁標準曲線見圖1。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對雞血藤總黃酮提取率的影響乙醇是一種綠色的中藥材提取溶劑，適用于提取一些極性較大的成分，但如果乙醇的濃度過小容易導(dǎo)致一些水溶性的雜質(zhì)溶出，如果乙醇的濃度過大則容易導(dǎo)致色素等一些小極性雜質(zhì)溶出。雞血藤總黃酮成分主要染料木素、刺芒柄花素等一些多羥基取代的成分，如果乙醇濃度過高或者過低均會影響其黃酮成分的提取率，故必須選擇合適的乙醇提取液濃度。乙醇濃度對雞血藤總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖2，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，總黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)乙醇體積分數(shù)為50%時出現(xiàn)最高點，此時雞血藤總黃酮得率最高，然后趨勢逐漸下降。

圖2 乙醇濃度對提取率的影響

2.2.2 提取時間對雞血藤總黃酮提取率的影響提取過程的完成需要一定的時間，當(dāng)有效成分擴散達到平衡狀態(tài)時，該中藥材的提取過程即已完成，長時間進行提取，高分子雜質(zhì)溶出增加，并可能導(dǎo)致已溶出的有效成分降解。提取時間對雞血藤總黃酮提取率的試驗結(jié)果見圖3，隨著提取時間的增加，總黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)提取時間為2 h時出現(xiàn)最高點，此時雞血藤總黃酮得率最高，隨后提取率下降。

圖3 提取時間對提取率的影響

2.2.3 提取溫度對雞血藤總黃酮提取率的影響一般而言，升高溫度可以加快中藥材有效物質(zhì)的溶出，但如果溫度太高，高分子雜質(zhì)增加且容易導(dǎo)致熱敏性的成分降解。提取溫度對雞血藤總黃酮提取率的試驗結(jié)果見圖4，隨著提取溫度的增加，總黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)提取溫度為70℃時出現(xiàn)最高點，此時雞血藤總黃酮得率最高，然后提取率趨勢緩慢下降。

圖4 提取溫度對提取率的影響

2.2.4 料液比對雞血藤總黃酮提取率的影響 料液比對雞血藤總黃酮提取率的影響試驗結(jié)果見圖5，隨著料液比的增大，總黃酮的提取率也逐漸增大，當(dāng)提取率料液比為1：20時出現(xiàn)最高點，此時雞血藤總黃酮得率最高，之后提取率呈下降趨勢。

圖5 料液比對提取率的影響

2.3 正交試驗結(jié)果

2.3.1 正交試驗提取方案的優(yōu)化 以單因素試驗考察結(jié)果為基礎(chǔ)，進一步得出提取工藝的最佳條件，用乙醇濃度、提取時間、提取溫度、料液比為影響因素，采用四因素三水平設(shè)計正交試驗方案，分析總黃酮提取率。正交試驗因素和水平如表1所示。

表1 正交試驗因素和水平

2.3.2 正交試驗和方差分析結(jié)果 采用L9（34）進行正交試驗，正交試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。從正交試驗直觀分析結(jié)果可以看出，各因素對雞血藤總黃酮提取率的影響程度不同，四個因素對提取率的影響由大到小依次為提取時間＞提取溫度＞乙醇濃度＞料液比。從方差分析結(jié)果可以看出，四個因素對提取率均無顯著性影響。結(jié)合直觀分析和方差分析結(jié)果，篩選出雞血藤總黃酮的最優(yōu)提取方案為B3A3C2D1，即稱取雞血藤粉末，用20倍量的60%乙醇作提取劑，70℃加熱回流提取2.5 h。

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果（直觀分析）

表3 正交試驗方差分析結(jié)果

2.4 提取工藝的驗證 根據(jù)以上正交試驗的結(jié)果，在最優(yōu)的提取工藝B3A3C2D1條件下進行三次平行試驗，通過雞血藤總黃酮的提取率驗證最優(yōu)提取工藝的可行性和合理性。試驗結(jié)果顯示，用20倍量的60%乙醇作提取劑，70℃加熱回流提取2.5 h的提取方案提取雞血藤總黃酮，提取率為34.90%。

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，四個影響因素中提取時間對提取率影響最大，其次是提取溫度和乙醇濃度，對提取率影響最小的是液料比。在單因素試驗得出各因素范圍的基礎(chǔ)上，綜合考慮主次水平，以取最好水平為主要因素，再考慮次要因素時間、成本等，由此得出雞血藤總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇提取液濃度60%、提取溫度70℃、提取時間2.5 d、提取料液比1：20，在該條件下雞血藤總黃酮的提取率可達34.90%。