75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對3種昆蟲的急性毒性與初級風險評估

李崗，徐吉洋，郭海坤，呂露，柳新菊,*

1. 浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質量與營養(yǎng)研究所，杭州 310021 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢測重點實驗室，杭州 310021 3. 浙江省農(nóng)藥殘留檢測與控制研究重點實驗室，杭州 310021 4. 農(nóng)產(chǎn)品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室(籌)，杭州 310021

蜜蜂參與約87.5%的蟲媒植物授粉，包括87種主要糧食作物，蜜蜂不但對生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定有重要作用，而且對世界糧食生產(chǎn)有著極為重要的作用[1-3]。赤眼蜂是膜翅目寄生性天敵昆蟲，有620余種[4]，可寄生400多種害蟲，尤其是鱗翅目害蟲，廣泛用于農(nóng)林害蟲的防治，是國內(nèi)外研究最多和應用最廣的天敵昆蟲之一，為我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)做出巨大貢獻[5-6]。家蠶是一種原產(chǎn)于我國的鱗翅目泌絲昆蟲，桑葉是其唯一食料，家蠶已有5 000年人工馴化史，目前養(yǎng)蠶業(yè)仍然是許多農(nóng)民的主要收入來源[7-9]。

農(nóng)藥是當前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可替代的生產(chǎn)資料，可減少約15%～25%的由病蟲草害引起的作物產(chǎn)量損失[10]。但是農(nóng)藥在生產(chǎn)中的使用方式、方法，不可避免地使上述非靶標益蟲暴露其中，造成中毒事件頻發(fā)。例如，自2006年以來在美洲和歐洲爆發(fā)的蜂群衰竭失調癥(colony collapse disorder, CCD)[11]。稻田農(nóng)藥造成稻螟赤眼蜂顯著的羽化畸形[12]。我國南方水稻和桑樹混栽區(qū)多有家蠶農(nóng)藥中毒事件[13]。農(nóng)藥和非靶標益蟲之間的矛盾引起“產(chǎn)學研”各方的極大關注，認為農(nóng)藥的不合理使用是造成上述非靶標益蟲藥害的主要原因[1]，在分析農(nóng)藥的毒性、用法和用量等綜合信息的基礎上，提出將農(nóng)藥的風險評估作為農(nóng)藥管理的有效措施。國際經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)、歐洲及地中海植物保護組織(European and Mediterranean Plant Protection Organization, EPPO)和歐洲食品安全局(European Food Safety Authority, EFSA)等都制定了農(nóng)藥對蜜蜂風險評估的相關標準和指南[14-17]。在我國，2014年以來相繼發(fā)布了《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》(GB/T 31270—2014)[18-20]和《農(nóng)藥登記 環(huán)境風險評估指南》(NY/T 2882—2016)[21-23]。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，殺蟲劑對有益昆蟲的毒性研究較多，而殺菌劑的風險經(jīng)常被忽略，但是殺菌劑對有益昆蟲亦有毒害，如百菌清對赤眼蜂有較高毒性風險[24]。而現(xiàn)在階段用量最大的2種殺菌劑三唑類和甲氧基丙烯酸酯類的復配劑對蜜蜂、赤眼蜂和家蠶的風險研究較少。

戊唑醇是由德國拜耳公司于1986年開發(fā)的三唑類殺菌劑，具有抑制植物病原菌細胞膜成分麥角甾醇脫甲基活性[25]，對植物白粉病等防效優(yōu)異，1998年首先在法國登記以來，已在50多個國家的60多種作物上登記使用。1995年在我國首次登記，2008年國內(nèi)有32家企業(yè)登記生產(chǎn)戊唑醇原藥[26]。戊唑醇的連年大量使用導致病原物抗藥性問題突出[25,27-28]，進而造成含有戊唑醇的復配劑大量出現(xiàn)。截至2020年，我國共登記含戊唑醇農(nóng)藥766個，其中，原藥49個，單劑324個，復配劑393個[29]。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑來源于Strobilurin類微生物，捷利康(現(xiàn)為先正達)于20世紀80年代首先發(fā)現(xiàn)其生物活性，現(xiàn)已經(jīng)成為全球市場最大的殺菌劑類別，代表品種有嘧菌酯等，可抑制線粒體呼吸活性。嘧菌酯由捷利康(現(xiàn)為先正達)于1997年登記上市，是世界上用量最大的殺菌劑品種[30]。截至2013年，已經(jīng)有小麥等幾十種作物的60余種植物病原真菌對甲氧基丙烯酸酯類農(nóng)藥產(chǎn)生了抗藥性[31]。這促使含甲氧基丙烯酸酯類復配劑的出現(xiàn)，截至2020年，我國共登記含嘧菌酯農(nóng)藥589個[29]。

本研究根據(jù)國標實驗準則，開展了戊唑醇和嘧菌酯復配劑對蜜蜂、赤眼蜂和家蠶的風險評估，旨在為我國農(nóng)藥的安全合理使用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

1.1.1 供試生物

根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第10部分: 蜜蜂急性毒性試驗》(GB/T 31270.10—2014)[18]，選擇意大利蜜蜂(ApismelliferaL.)以下簡稱蜜蜂為試驗生物，從浙江省義烏市佛堂鎮(zhèn)王煥興蜂場引入后常規(guī)飼養(yǎng)。試驗時選擇個體大小一致的健康成年工蜂，急性經(jīng)口毒性試驗暴露前還需要饑餓2 h。

根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第17部分: 天敵赤眼蜂急性毒性試驗》(GB/T 31270.17—2014)[19]，選擇玉米螟赤眼蜂(Trichogrammaostriniae)，以下簡稱赤眼蜂，作為寄生性非靶標節(jié)肢動物的代表生物，供試赤眼蜂卵從河北省農(nóng)林科學院旱作農(nóng)業(yè)研究所衡水市田益生防有限責任公司引入。試驗用寄生卵置于溫度23～27 ℃、相對濕度50%～80%的避光條件下預培養(yǎng)，48 h內(nèi)羽化的成蜂用于急性毒性試驗。

根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第11部分: 家蠶急性毒性試驗》(GB/T 31270.11—2014)[20]，選擇品種為“皓月×菁松”的家蠶(Bombyxmori)作為試驗生物，蠶種從浙江省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所引入，暴露前培養(yǎng)至2齡起蠶。

1.1.2 試驗農(nóng)藥與主要試劑

75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑(江蘇省南京惠宇農(nóng)化有限公司)，噴霧法(一個作物生長季噴霧3次，間隔期為7 d)防治水稻紋枯病和稻曲病，制劑用藥量為150～225 g；98%樂果原藥(湖南海利化工股份有限公司)；丙酮(分析純，永華化學科技(江蘇)有限公司)；蔗糖(江蘇白玫糖業(yè)有限公司)；去離子水(杭州潔露純凈水廠)；吐溫80(分析純，天津大茂化學試劑廠)；有機硅(廣東中迅農(nóng)科股份有限公司)；蜂蜜(寧波源彬蜂業(yè)發(fā)展有限公司)。

1.1.3 主要儀器和設備

蜜蜂急性毒性試驗：JA1003型電子天平(上海天平儀器廠，中國)，SPS402F型電子天平(梅特勒-托利多常州測量技術有限公司，中國)，Burkard PDE0003手動型微量點滴儀(Burkard Scientific公司，英國)，MDH-616-A型除濕機(MORⅡ公司，日本)，DSR-TH-RA型溫濕度記錄儀(佐格微系統(tǒng)有限公司，中國)，1 mL、5 mL移液槍(Eppendorf公司，德國)等。

赤眼蜂急性毒性試驗：BSA223S型電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，中國)，三洋MLR-351H植物培養(yǎng)箱(日本三洋電機株式會社，日本)，KQ2200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，中國)，DSR-THEXT-RA溫濕度記錄儀(佐格微系統(tǒng)有限公司，中國)，1 mL、5 mL移液槍(Eppendorf公司，德國)，RXK-7型烤熱狗機(上海一喜食品機械有限公司，中國)，試驗用指形管(直徑20 mm，長80 mm，內(nèi)表面積為53.38 cm2)等。

家蠶急性毒性試驗：JA2603B電子天平(上海精科天美科學儀器有限公司，中國)，MLR-351H植物培養(yǎng)箱(日本三洋電機株式會社，日本)，DSR-THEXT-RA溫濕度記錄儀(佐格微系統(tǒng)有限公司，中國)，玻璃培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樂果(參照物)對蜜蜂急性接觸毒性試驗

將98%樂果溶解在丙酮中配制成濃度為0.360、0.277、0.213、0.164、0.126和0.0970 g·L-1的藥液，同時設置助劑丙酮對照組和空白對照組。根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第10部分: 蜜蜂急性毒性試驗》(GB/T 31270.10—2014)[18]要求，采用點滴法進行暴露，試驗時，用手動微量點滴儀在每只蜜蜂中胸背板處，分別點滴上述試驗藥液1 μL，助劑對照組用丙酮點滴1 μL，待藥液揮發(fā)后將蜜蜂移入蜂籠中，用脫脂棉浸泡適量50%蔗糖水(m∶m)，通過網(wǎng)眼供蜜蜂攝食?？瞻讓φ战M直接飼喂50%蔗糖水。處理組和對照組均設3個重復，每個重復10只蜜蜂(成年工蜂)。在溫度23～27 ℃、相對濕度50.0%～70.0%的黑暗條件下，試驗48 h。在暴露后24 h和48 h時調查試驗蜜蜂死亡數(shù)。

1.2.2 樂果(參照物)對蜜蜂急性經(jīng)口毒性試驗

先將98%樂果溶解在丙酮中配成母液，再用50%蔗糖水溶液(m∶m)(含0.1% (V∶V)吐溫80)稀釋該母液得到濃度為9.60×10-3、7.68×10-3、6.14×10-3、4.92×10-3、3.93×10-3和3.15×10-3g·L-1試驗藥液。同時設置50%蔗糖水溶液(m∶m)對照組和含最高濃度助劑的50%蔗糖水溶液(m∶m)對照組。根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第10部分: 蜜蜂急性毒性試驗》(GB/T 31270.10—2014)[18]要求，采用經(jīng)口飼喂法暴露，在飼喂器中加入200 μL上述濃度試驗溶液，飼喂3～4 h后測定消耗量。換用不含被試物的50%蔗糖水溶液(m∶m)進行飼喂。處理組和對照組均設3個重復，每個重復10只蜜蜂(成年工蜂)。在溫度23～27 ℃、相對濕度50.0%～70.0%的黑暗條件下，試驗48 h。在24 h和48 h時調查受試蜜蜂死亡數(shù)。

1.2.3 75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對蜜蜂急性接觸毒性試驗

用0.02%有機硅水(V∶V)將75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑配制成濃度為105 g·L-1試驗溶液，進行限度試驗，同時設置溶劑0.02%有機硅水溶液(V∶V)對照組和空白對照組。暴露方法、試驗條件和癥狀調查方法同1.2.1。

1.2.4 75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對蜜蜂急性經(jīng)口毒性試驗

用去離子水將75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑配制成母液，然后用去離子水配制50%蔗糖水溶液(m∶m)，用該蔗糖水溶液稀釋母液得到濃度1.49、2.08、2.92、4.08、5.71和8.00 g·L-1試驗溶液，同時設置50%蔗糖水溶液(m∶m)為空白對照組。暴露方法、試驗條件和癥狀調查方法同1.2.2。

1.2.5 75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對赤眼蜂急性毒性試驗

用丙酮將75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑配制成濃度2.00×10-5、1.00×10-5、5.00×10-6、2.50×10-6、1.25×10-6和6.25×10-7mg·cm-2試驗溶液，同時設置丙酮空白對照。根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第17部分: 天敵赤眼蜂急性毒性試驗》(GB/T 31270.17—2014)[19]，采用“藥膜法“暴露。取上述藥液0.500 mL加入指形管中滾吸成藥膜管，待指形管藥膜干后，將羽化后48 h內(nèi)的成蜂移入藥膜管中爬行1 h后轉入無藥指形管，用黑布封口并飼喂蜂蜜水。每管轉入赤眼蜂約100頭，每個處理3個重復，每管為1個重復。試驗組和對照組同時進行。在溫度23～27 ℃、相對濕度50.0%～80.0%的黑暗條件下試驗，并在1 h和24 h時調查赤眼蜂死亡數(shù)。

1.2.6 樂果(參照物)對家蠶急性毒性試驗

用去離子水將98%樂果配制成濃度1.93×103、2.31×103、2.78×103、3.33×103、4.00×103和4.80×103mg·L-1藥液，同時設置空白對照組。根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第11部分: 家蠶急性毒性試驗》(GB/T 31270.11—2014)[20]的規(guī)定，試驗采用“浸葉法”暴露。試驗時，分別將整張桑葉浸沒于上述試驗溶液中，時間約為10 s，自然晾干后剪成長條形并轉入培養(yǎng)皿中。將2齡起蠶置于培養(yǎng)皿中桑葉表面，每皿20頭，每處理3個重復，每一培養(yǎng)皿為1個重復。在溫度23～27 ℃、相對濕度70.0%～85.0%、光暗比16 h∶8 h條件下試驗。試驗期間以新鮮桑葉飼養(yǎng)家蠶。在暴露后24、48、72和96 h，調查各處理組家蠶的中毒癥狀和死亡情況。

1.2.7 75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑家蠶急性毒性試驗

1.3 急性毒性試驗的數(shù)據(jù)處理

采用寇氏法[18-20]計算LD50(LC50或LR50)及其各自95%置信限。logLD50=Xm-i×(∑P-0.5)，式中：Xm為最高濃度的對數(shù)；i為相鄰濃度對數(shù)的比值；∑P為各組死亡率的總和(以小數(shù)表示)。logLD50的95%置信限=logLD50±1.96SlogLD50，式中：SlogLD50=i×(∑pq/n)1/2，式中：p為1個組的死亡率；q為1-p；n為各濃度組蜜蜂的數(shù)量。

2 結果(Results)

2.1 樂果(參照物)對蜜蜂的急性毒性

用寇氏法計算得到參照物樂果對蜜蜂接觸毒性24 h-LD50為0.177 μg·蜂-1(95%置信限為0.161～0.196 μg·蜂-1)，48 h-LD50為0.174 μg·蜂-1(95%置信限為0.158～0.192 μg·蜂-1)。試驗開始至試驗結束時，對照組死亡率不超過10%；樂果對該批次試驗蜜蜂的急性接觸毒性24 h-LD50在《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第10部分: 蜜蜂急性毒性試驗》(GB/T 31270.10—2014)[18]要求的0.10～0.30 μg·蜂-1范圍之內(nèi)，符合試驗有效性要求，說明試驗蜜蜂、條件和方法符合試驗要求，試驗有效。

用寇氏法計算得到參照物樂果對蜜蜂經(jīng)口毒性24 h-LD50為0.168 μg·蜂-1(95%置信限為0.166～0.170 μg·蜂-1)，48 h-LD50為0.167 μg·蜂-1(95%置信限為0.165～0.189 μg·蜂-1)。試驗開始至試驗結束時，對照組死亡率不超過10%；樂果對該批試驗蜜蜂的急性經(jīng)口毒性24 h-LD50在《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第10部分: 蜜蜂急性毒性試驗》(GB/T 31270.10—2014)[18]要求的0.10～0.35 μg·蜂-1范圍之內(nèi)，符合試驗有效性要求，說明試驗蜜蜂、條件和方法符合試驗要求，試驗有效。

2.2 75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對蜜蜂的急性毒性和初級風險評估

2.2.1 75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對蜜蜂的急性毒性

試驗蜜蜂暴露于75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑后，在48 h內(nèi)未見明顯異常。其對蜜蜂急性接觸毒性48 h-LD50>105 μg·蜂-1。根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第10部分: 蜜蜂急性毒性試驗》(GB/T 31270.10—2014)[18]中農(nóng)藥對蜜蜂的毒性分級標準，該藥對蜜蜂48 h的急性接觸毒性為“低毒”級。

用寇氏法計算得到75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對蜜蜂的急性經(jīng)口48 h-LD50為65.9 μg·蜂-1，95%置信限為52.6～112 μg·蜂-1。根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第10部分: 蜜蜂急性毒性試驗》(GB/T 31270.10—2014)[18]中農(nóng)藥對蜜蜂的毒性分級標準，該藥對蜜蜂48 h的急性經(jīng)口毒性為“低毒”級。

2.2.2 75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對蜜蜂初級風險評估

2.2.2.1 蜜蜂初級暴露分析

75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑，用噴霧法防治水稻紋枯病和稻曲病時，制劑用藥量為150～225 g·hm-2，使用時間為水稻發(fā)病時，此時在水稻田中有開花的植物，因此蜜蜂有暴露可能，需進行風險評估。根據(jù)指南《農(nóng)藥登記 環(huán)境風險評估指南第4部分: 蜜蜂》(NY/T 2882.4—2016)[21]，直接采用其單次最高施藥劑量169 g·hm-2作為預測暴露劑量(PED)。

2.2.2.2 蜜蜂初級效應分析

根據(jù)指南《農(nóng)藥登記 環(huán)境風險評估指南第4部分: 蜜蜂》(NY/T 2882.4—2016)[21]，在噴施場景下，初級效應分析僅使用蜜蜂急性經(jīng)口或急性接觸毒性中毒性較高的LD50作為預測無效應濃度(PNED)。當同時具備有效成分及其制劑產(chǎn)品的LD50時，應選擇毒性較高的數(shù)據(jù)。75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對蜜蜂急性接觸48 h-LD50>105 μg·蜂-1，急性經(jīng)口48 h-LD50=65.9 μg·蜂-1，而從英國農(nóng)藥電子手冊[32]查得戊唑醇對蜜蜂接觸毒性48 h-LD50>200 μg·蜂-1，經(jīng)口毒性48 h-LD50>83 μg·蜂-1，嘧菌酯對蜜蜂的經(jīng)口毒性48 h-LD50>25 μg·蜂-1，接觸毒性48 h-LD50>200 μg·蜂-1。因此選擇嘧菌酯對蜜蜂的經(jīng)口48 h-LD50值25 μg·蜂-1作為PNED。

2.2.2.3 蜜蜂初級風險表征

對蜜蜂的初級風險用風險商值(RQsp)表征，按公式RQsp=AR/(LD50×50)計算，式中：RQsp為噴施農(nóng)藥暴露場景的風險商值；AR為推薦的農(nóng)藥單次最高施藥劑量，取值169 g·hm-2；LD50為經(jīng)口或接觸的蜜蜂半致死劑量，取值為25 μg·蜂-1。代入數(shù)據(jù)，最終計算得RQsp=0.135。根據(jù)《農(nóng)藥登記 環(huán)境風險評估指南第4部分: 蜜蜂》(NY/T 2882.4—2016)[21]，判定該藥對蜜蜂風險可接受(RQsp≤1)。

2.3 75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對赤眼蜂的急性毒性和初級風險評估

2.3.1 75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對赤眼蜂的急性毒性

用寇氏法計算得75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對赤眼蜂的24 h-LR50為2.81×10-6mg·cm-2，即0.281 g·hm-2，95%置信限為2.16×10-6～3.65×10-6mg·cm-2。安全系數(shù)=LR50/單位面積施用濃度，計算得0.002，根據(jù)國標《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第17部分: 天敵赤眼蜂急性毒性試驗》(GB/T 31270.17—2014)[19]的農(nóng)藥對赤眼蜂的風險等級標準，該藥對赤眼蜂有極高的風險。

2.3.2 75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對赤眼蜂的初級風險評估

2.3.2.1 赤眼蜂初級暴露分析

赤眼蜂的暴露情形與蜜蜂類似，故對其進行風險評估。根據(jù)指南《農(nóng)藥登記 環(huán)境風險評估指南第7部分: 非靶節(jié)肢動物》(NY/T 2882.7—2016)[22]，分為農(nóng)田內(nèi)暴露和農(nóng)田外暴露2種場景。

(1) 赤眼蜂農(nóng)田內(nèi)暴露場景初級暴露分析

農(nóng)田內(nèi)的預測暴露量PERin=AR×MAF，式中：PERin為農(nóng)田內(nèi)預測暴露量(g·hm-2)；AR為推薦的單位面積農(nóng)藥最高施藥劑量(g·hm-2)，數(shù)據(jù)值為169 g·hm-2；MAF為多次施藥因子，按照MAF=(1-e-n×i×ln2/DT50)/(1-e-i×ln2/DT50)計算，其中，n為施藥次數(shù)，這里取3次；i為施藥間隔期(d)，此處取值7 d；DT50為農(nóng)藥在植株表面的降解半衰期(d)，采用默認值10 d，計算得MAF=1.995。代入數(shù)據(jù)，最終計算得PERin=337 g·hm-2。

(2)赤眼蜂農(nóng)田外暴露場景初級暴露分析

農(nóng)田外預測暴露量PERoff=AR×MAF×PDF/VDF，式中：PERoff為農(nóng)田外預測暴露量(g·hm-2)；AR為推薦的單位面積農(nóng)藥最高施藥劑量(g·hm-2)，數(shù)據(jù)值為169 g·hm-2；MAF為多次施藥因子，與農(nóng)田內(nèi)暴露場景一致，數(shù)值為1.995；PDF為農(nóng)藥飄移因子，取噴藥距離作物邊界1 m的數(shù)值，即2.01%；VDF為農(nóng)藥植被分布因子，采用默認值5。代入數(shù)據(jù)，最終計算得PERoff=1.36 g·hm-2。

2.3.2.2 赤眼蜂(非靶標節(jié)肢動物)初級效應分析

根據(jù)指南《農(nóng)藥登記 環(huán)境風險評估指南第7部分: 非靶節(jié)肢動物》(NY/T 2882.7—2016)[22]，選擇75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對赤眼蜂的24 h-LR50=0.281 g·hm-2作為毒性終點。

2.3.2.3 赤眼蜂初級風險表征

在農(nóng)田內(nèi)場景下對非靶標節(jié)肢動物的初級風險用危害商值HQin=PERin/LR50表征，式中：PERin為農(nóng)田內(nèi)預測暴露量，取值337 g·hm-2；LR50為半致死用量，取值0.281 g·hm-2；代入數(shù)據(jù)，最終計算得HQin=1 199，根據(jù)指南《農(nóng)藥登記 環(huán)境風險評估指南第7部分: 非靶節(jié)肢動物》(NY/T 2882.7—2016)[22]，農(nóng)田內(nèi)風險不可接受(HQin>5)。

在農(nóng)田外場景下對非靶標節(jié)肢動物的初級風險用危害商值HQoff=PERoff×UF/LR50表征，式中：PERoff為農(nóng)田外預測暴露量，取值1.36 g·hm-2；LR50為半致死劑量，取值0.281 g·hm-2；UF為不確定性因子，默認值為5。代入數(shù)據(jù)，最終計算得HQoff=24.2，根據(jù)指南《農(nóng)藥登記 環(huán)境風險評估指南第7部分: 非靶節(jié)肢動物》(NY/T 2882.7—2016)[22]，農(nóng)田外風險不可接受(HQoff>5)。

2.4 樂果(參照物)對家蠶的急性毒性

用寇氏法計算得到參照物樂果對家蠶急性毒性96 h-LD50為2.65×103mg·L-1(95%置信限為2.54×103～2.78×103mg·L-1)。試驗開始至試驗結束時，對照組死亡率不超過10%；本試驗條件下對家蠶96 h的急性毒性為“低毒”(LC50>200 mg·L-1)，符合《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第11部分: 家蠶急性毒性試驗》(GB/T 31270.11—2014)[20]試驗有效性要求，說明試驗家蠶、條件和方法符合試驗要求，試驗有效。

2.5 75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對家蠶的急性毒性和初級風險評估

2.5.1 75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對家蠶的急性毒性

用寇氏法計算得75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對家蠶的96 h-LC50為596 mg·L-1。根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第11部分: 家蠶急性毒性試驗》(GB/T 31270.11—2014)[20]中農(nóng)藥對家蠶的毒性等級劃分標準，75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對家蠶96 h的急性毒性為“低毒級”(LC50>200 mg·L-1)。

2.5.2 75%戊唑·嘧菌酯可溶性粉劑對家蠶的初級風險評估

2.5.2.1 家蠶初級暴露分析

在噴霧場景下家蠶可能暴露，故對其進行風險評估。根據(jù)指南《農(nóng)藥登記 環(huán)境風險評估指南第5部分: 家蠶》(NY/T 2882.5—2016)[23]，計算3次噴霧后最外圍桑樹上的預測暴露濃度PECma-fr=AR×PDFfr×RUD95×MAF×DFPHI(單位為mg·kg-1桑葉)和次外圍桑樹上的預測暴露濃度PECma-sr=AR×PDFsr×RUD95×MAF×DFPHI(單位為mg·kg-1桑葉)，式中：AR為單位面積農(nóng)藥噴霧量，取值0.169 kg·hm-2；PDFfr為最外圍一行桑樹的飄移因子，采用默認值9.8%；PDFsr為次外圍一行桑樹的飄移因子，采用默認值0.6%；RUD95為桑樹上第95百分位的單位殘留量，采用默認值950 (mg·kg-1桑葉)·(kg·hm-2)-1；MAF為3次施藥因子，數(shù)值為1.995；DFPHI=e-ln2×PHI/DT50為桑葉上農(nóng)藥的降解系數(shù)，其中，DT50為農(nóng)藥在桑葉上的降解半衰期(d)，采用默認值10 d，PHI為農(nóng)藥最后一次使用距離桑葉采收的間隔期(d)，采用默認值1 d。代入數(shù)據(jù)，計算得DFPHI=0.933，PECma-fr=29.3 mg·kg-1桑葉，PECma-sr=1.79 mg·kg-1桑葉。

2.5.2.2 家蠶初級效應分析

根據(jù)指南《農(nóng)藥登記 環(huán)境風險評估指南第5部分: 家蠶》(NY/T 2882.5—2016)[23]，采用家蠶的急性毒性(浸葉法)96 h-LC50為急性毒性終點。按照公式PNEC=EnP/UF計算PNEC(mg·kg-1桑葉)，式中：EnP為毒性試驗終點(mg·kg-1桑葉)；UF為不確定性因子，取值70。EnP采用急性毒性試驗的LC50(mg·L-1)，因單位不同，需按公式LC50-C=LC50×FC修正，式中：LC50-C為修正半致死濃度(mg·kg-1桑葉)；LC50取值596 mg·L-1；FC為修正系數(shù)，采用默認值0.46 L·kg-1桑葉。代入數(shù)據(jù)，最終計算得LC50-C=274 mg·kg-1桑葉，PNEC=3.92 mg·kg-1桑葉。

2.5.2.3 家蠶初級風險表征

對家蠶的風險以風險商值RQ=PEC/PNEC表征，式中：PEC為預測暴露濃度，取值29.3(最外圍) mg·kg-1桑葉和1.79(次外圍) mg·kg-1桑葉；PNEC為預測無效應濃度，取值3.92 mg·kg-1桑葉。代入數(shù)據(jù)，最終計算得RQ=7.47(最外圍)和0.457(次外圍)。根據(jù)指南《農(nóng)藥登記 環(huán)境風險評估指南第5部分: 家蠶》(NY/T 2882.5—2016)[23]，最外圍桑樹風險不可接受(RQ>1)，次外圍桑樹風險可接受(RQ≤1)。

3 討論(Discussion)

作為農(nóng)藥管理的重要環(huán)節(jié)，農(nóng)藥進入市場前必須提供登記資料，包括行為、殘留、毒理學和環(huán)境風險評估等資料。1997年，美國[33]和歐盟[34]在農(nóng)藥管理法規(guī)中就發(fā)布了農(nóng)藥的環(huán)境風險評估指南和準則，并且要求農(nóng)藥登記時提供環(huán)境風險評估報告，近年來農(nóng)藥的環(huán)境風險評估更加受到重視[35-36]。在我國，2014年以來發(fā)布了農(nóng)藥風險評估的準則《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》(GB/T 31270—2014)和指南《農(nóng)藥登記 環(huán)境風險評估指南》(NY/T 2882—2016)，涉及的生物包括水生生物、鳥類、蜜蜂、家蠶、非靶標節(jié)肢動物和土壤生物等，要求用于評估的關鍵數(shù)據(jù)必須來自依據(jù)國標準則《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》(GB/T 31270—2014)等開展的試驗。本研究根據(jù)上述國標要求進行試驗，獲得了蜜蜂、赤眼蜂和家蠶的急性毒性數(shù)據(jù)，然后運用這些數(shù)據(jù)進行風險評估，其過程包括暴露風險分析、效應風險分析和風險表征。這種評估方法與歐美等國家一致，因而為中外數(shù)據(jù)互認奠定了基礎。

在上述3種非靶標益蟲的初級風險評估中，指南《農(nóng)藥登記 環(huán)境風險評估指南》(NY/T 2882—2016)規(guī)定采用RQ(蜜蜂、家蠶)或HQ(赤眼蜂)來表征風險，這比《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》(GB/T 31270—2014)中規(guī)定的單一使用LD50(LC50或LR50)來判定毒性和風險要科學合理。因為，RQ或HQ與農(nóng)藥的AR成正比，與LD50(LC50或LR50)成反比，也是就說RQ或HQ由2個因素決定。但是LD50(LC50或LR50)是在實驗室條件下測得的對成蟲的毒性結果，并不能準確客觀地反映田間實際施用農(nóng)藥對非靶標益蟲的危害情況。因此，科學評價農(nóng)藥對非靶標益蟲的安全性，還必須綜合考慮農(nóng)藥的殘留、行為、毒理和蟲態(tài)蟲齡等因素的影響。另外除了強調成蟲的急性死亡終點指標，還需要關注慢性中毒對非靶標益蟲造成的生理和生態(tài)行為等方面的影響，例如覓食、飛行和方向感等的改變，以及低濃度農(nóng)藥對非靶標益蟲的亞致死效應和毒性累積效應，從而做出系統(tǒng)全面而準確的風險判斷。

殺菌劑戊唑醇通過抑制植物病原菌細胞膜成分麥角甾醇脫甲基活性而干擾真菌細胞膜的形成，產(chǎn)生殺菌作用，而動植物細胞膜不含有麥角甾醇，故戊唑醇對動植物的細胞膜無干擾作用，從這點來說可實現(xiàn)對真菌的選擇性。但是動物內(nèi)分泌系統(tǒng)中含有甾體激素，如睪酮、二氫睪酮和雌二醇等，戊唑醇影響甾體激素的代謝，故對動物具有內(nèi)分泌干擾作用。例如，戊唑醇可造成非洲爪蟾血液中睪酮、二氫睪酮含量增加，而使雌二醇濃度降低[37]，非致死劑量的戊唑醇造成家蠶絲腺、蛻皮激素、全繭重、繭層重和繭層率顯著下降，而使保幼激素水平增加，故戊唑醇可對家蠶產(chǎn)生慢性毒性[38]。殺菌劑嘧菌酯通過抑制線粒體呼吸而殺菌，細胞器線粒體在細菌、真菌和動植物細胞中普遍存在，故嘧菌酯引起的毒性應該比較廣泛。例如，嘧菌酯對家蠶雖然是低毒性、低風險，但是對家蠶的發(fā)育歷期、眠蠶體質量和繁殖力等均有影響，嘧菌酯可對家蠶產(chǎn)生慢性毒性[9]。嘧菌酯可降低雌性斑馬魚的雌二醇、卵黃原蛋白含量和性腺指數(shù)，而增加睪酮含量，并造成卵巢和肝臟組織病理學改變，對斑馬魚有繁殖毒性[39]和發(fā)育毒性[40]，亞致死濃度的嘧菌酯可造成蜜蜂激素失調和代謝毒性[41]。

歐洲食品安全局的環(huán)境風險評估報告表明，戊唑醇[42]和嘧菌酯[43]對意大利蜜蜂和對非靶標節(jié)肢動物的典型代表蚜繭蜂(Aphidiusrhopalosiphi)和捕食螨(Typhlodromuspyri)均為低風險。我國的研究報道戊唑醇單劑對家蠶低毒[44]或低風險[45]，嘧菌酯單劑對家蠶低毒、中等風險[44]或低毒性、低風險[46]。本研究結果表明，戊唑醇和嘧菌酯復配后對意大利蜜蜂低風險，對玉米螟赤眼蜂高風險或風險不可接受，對家蠶的最外圍桑樹食物源的風險不可接受。與2種單劑毒性相比，復配劑對蜜蜂是低風險，風險沒有變化，可能原因是蜜蜂暴露時間短，只有48 h,同時蜜蜂雖然是人工養(yǎng)殖，但是蜜蜂自行外出采蜜，與自然環(huán)境接觸多，對環(huán)境的適應性強，所以抗性強，而戊唑醇和嘧菌酯主要造成慢性毒性，可能48 h內(nèi)未能表現(xiàn)毒性癥狀。另外，與其他昆蟲相比，蜜蜂基因組中缺乏解毒酶基因，這使得蜜蜂更容易受到農(nóng)藥的危害[47]，這種危害短期內(nèi)在成蟲態(tài)未能體現(xiàn)，從長期來看可能體現(xiàn)在成蟲以外的生活史中，可能造成蜂群衰竭失調，所以延長暴露試驗時間可能觀察到發(fā)生在非成蟲態(tài)上的慢性毒性。與單劑相比，復配劑對玉米螟赤眼蜂的風險增加且不可接受，可能因為戊唑醇和嘧菌酯產(chǎn)生增效作用，也不能排除助劑的影響，需要進一步試驗證實。與單劑相比，復配劑對家蠶風險與暴露量有關，暴露量越大則風險越大至不可接受，可能是劑量效應在起作用，暗示2個低毒性的農(nóng)藥復配后對非靶標生物也可能是高風險，這依賴用藥量和其是否具有慢性毒性等特性，也從另一個側面說明農(nóng)藥的減量使用可降低農(nóng)藥對非靶標生物的風險。

綜上所述，2個低毒且具有慢性毒性的農(nóng)藥復配后對非靶標益蟲可能存在風險，所以針對這種情況，應該在現(xiàn)行的風險評估方法中，增加慢性毒性等參數(shù)以改進現(xiàn)有的風險評估方法。