免疫組化雙重染色技術(shù)在胸腺腫瘤PD-L1檢測(cè)中的應(yīng)用

邢 杰，趙繼開(kāi)，丁聞潔，韓昱晨

PD-1/PD-L1通路已經(jīng)在多種腫瘤中進(jìn)行了廣泛深入的研究，如黑色素瘤、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等，并且PD-1/PD-L1表達(dá)可能與惡性腫瘤的臨床病理特征或不良預(yù)后相關(guān)[1-3]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于胸腺瘤PD-1/PD-L1的研究較少，但均表明PD-L1表達(dá)與胸腺腫瘤(包括胸腺瘤和胸腺癌)的組織學(xué)類型、Masaoka分期以及療效相關(guān)，并且能夠提示腫瘤的惡性程度及預(yù)后[4-7]。常規(guī)PD-L1檢測(cè)方法為免疫組化，但PD-L1在正常的胸腺上皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞中也有表達(dá)[8-9]，可能使得免疫組化染色結(jié)果判讀困難，為解決這一問(wèn)題，作者嘗試采用p63+PD-L1免疫組化雙重染色法對(duì)胸腺腫瘤進(jìn)行染色，由于p63廣泛表達(dá)于上皮源性腫瘤細(xì)胞胞核，p63+PD-L1免疫組化雙重染色法能夠更加清楚的判斷胸腺源性上皮細(xì)胞的PD-L1陽(yáng)性率。

1 材料與方法

1.1 材料收集上海市胸科醫(yī)院病理科存檔的胸腺腫瘤手術(shù)切除樣本60例，其中B1、B2及B3型胸腺瘤各15例，胸腺癌15例，每例胸腺腫瘤連續(xù)切片3張，分別用于HE染色、PD-L1免疫組化染色、p63+PD-L1免疫組化雙重染色。

1.2 染色方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，免疫組化染色采用Multimer法，染色平臺(tái)為Dako Link 48全自動(dòng)免疫組化染色平臺(tái)，一抗PD-L1(22C3，1 ∶50，Dako公司)、p63(1 ∶300，上海長(zhǎng)島生物公司)，其他試劑均為Dako Autostainer Link48全自動(dòng)免疫組化染色平臺(tái)專用試劑，購(gòu)自安捷倫科技(上海)公司。

1.3 結(jié)果判斷將染色后的切片交由科內(nèi)經(jīng)過(guò)PD-L1判讀專業(yè)訓(xùn)練的3名醫(yī)師閱片，并根據(jù)判讀的難易程度進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分內(nèi)容包括染色效果、特異性著色部位及非特異性著色部位判斷，然后進(jìn)行綜合評(píng)分，易于判讀為Ⅰ級(jí)，判讀難度一般為Ⅱ級(jí)，難以判讀為Ⅲ級(jí)，3名醫(yī)師分別就相應(yīng)的切片進(jìn)行分級(jí)，每個(gè)級(jí)別取3名醫(yī)師打分的平均值。將判讀結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，分析方法為χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

PD-L1在胸腺腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)評(píng)分結(jié)果顯示(表1，圖1～4)，B1型、B2型、B3型胸腺瘤PD-L1免疫組化染色與PD-L1+p63免疫組化雙重染色相比，在判讀難易程度上差異有顯著性(P值分別為<0.001、0.001、0.033)；胸腺癌PD-L1免疫組化染色與PD-L1+p63免疫組化雙重染色評(píng)分結(jié)果相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.583)。

表1 兩種免疫組化染色結(jié)果判讀難易程度對(duì)比

①A①B①C②A②B②C③A③B③C④A④B④C

3 討論

胸腺屬于人體中樞免疫器官，是T細(xì)胞分化、發(fā)育和成熟的場(chǎng)所，胸腺瘤主要起源于胸腺上皮及淋巴細(xì)胞，PD-L1不僅在胸腺上皮源性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，在正常胸腺上皮細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞中也有部分表達(dá)，這就給PD-L1在腫瘤性上皮細(xì)胞中表達(dá)的免疫組化染色的結(jié)果判讀帶來(lái)了很大挑戰(zhàn)。p63是p53抑癌基因家族的成員，在胚胎外胚層的發(fā)育和上皮組織的發(fā)育、分化以及維持細(xì)胞形態(tài)等方面發(fā)揮著重要作用，p63蛋白廣泛表達(dá)于上皮組織細(xì)胞核。將p63和PD-L1兩種抗體結(jié)合起來(lái)，使用免疫組化雙重染色法，使得胸腺上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞胞核呈p63免疫組化染色的紅色，細(xì)胞膜呈現(xiàn)PD-L1免疫組化染色的棕色，而部分淋巴細(xì)胞僅在細(xì)胞膜上有PD-L1表達(dá)，細(xì)胞核無(wú)p63表達(dá)。借助p63+PD-L1雙重免疫組化染色，我們不僅能夠判斷PD-L1在胸腺腫瘤性上皮中的表達(dá)，也能夠在一定程度上反映出在胸腺中各種淋巴細(xì)胞PD-L1的表達(dá)狀態(tài)，為今后進(jìn)一步分析胸腺組織中各種細(xì)胞成分PD-L1表達(dá)狀況，與胸腺腫瘤臨床病理特點(diǎn)及免疫治療的相關(guān)性，提供更多的數(shù)據(jù)支持。

綜上，PD-L1+p63免疫組化雙重染色能夠很好的幫助病理醫(yī)師在判讀PD-L1陽(yáng)性率的過(guò)程中，準(zhǔn)確地識(shí)別非特異性著色。