紅葉石楠耐鉛內(nèi)生細(xì)菌的分離及其16S rDNA鑒定

黃雅麗 ，賴安萍 ，侯柚銀 ，張華峰 ，劉希華

（1.三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建 三明 365004；2.福建省礦山生態(tài)修復(fù)工程技術(shù)研究中心，福建 三明 365004；3.廈門市森林病蟲害防治技術(shù)站，福建 廈門 361004）

我國(guó)作為一個(gè)礦產(chǎn)資源相對(duì)豐富的國(guó)家，礦產(chǎn)資源大量利用促進(jìn)了國(guó)民經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，同時(shí)因礦產(chǎn)資源的開發(fā)利用而產(chǎn)生了生態(tài)環(huán)境問(wèn)題。重金屬污染具有隱蔽性和高額治理成本等特點(diǎn)，特別是對(duì)土壤的污染具有不可逆的作用，并通過(guò)植物和作物產(chǎn)品轉(zhuǎn)接到人類的食物鏈環(huán)節(jié)，由此引起重金屬對(duì)人類的毒害。從2018年福建省環(huán)保廳下發(fā)文件《福建省涉重金屬行業(yè)污染防控工作方案》中提及，在所有福建省的重點(diǎn)污染物中，鉛位居5種重金屬污染之首。在修復(fù)重金屬污染土壤的技術(shù)中，化學(xué)、物理和生物修復(fù)這三種方法最為有效，前兩者或存在產(chǎn)生二次污染，或者費(fèi)用高等缺點(diǎn)，生物修復(fù)技術(shù)則避開了上述兩種修復(fù)方法的缺點(diǎn)，特別是微生物和植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤，這種方法克服了受鉛脅迫的植物生長(zhǎng)緩慢以及吸附的重金屬難以從土壤中除去等缺點(diǎn)，其修復(fù)效果逐步受到科學(xué)工作者的認(rèn)可[1-3]。

紅葉石楠（Photinia serrulata）是福建地區(qū)常見的小喬木或灌木，新梢和新葉為鮮紅色，且不受環(huán)境中鉛離子的毒害，目前作為公路街道路旁的行道樹而大量種植[4]。但由于紅葉石楠生物量較小，不適合于礦山等大面積鉛污染的修復(fù)，因此從耐鉛的植物上分離純化出耐鉛的內(nèi)生細(xì)菌，并接種到喬木上，從而選育出適合礦山種植的樹種，以達(dá)到修復(fù)礦山等大面積鉛污染土壤的目的。

關(guān)于耐鉛的內(nèi)生細(xì)菌的研究鮮有報(bào)道，僅本課題組從小飛蓬(Conyza canadensis)和龍葵(Solanum nigrum)等草本植物上成功分離出耐鉛的內(nèi)生細(xì)菌[5-6]，但由于草本植物多為一年本植物，且沒(méi)有木本植物的高大樹干，因此，無(wú)法確定分離出來(lái)的內(nèi)生細(xì)菌能否成功殖在木本植物。有研究表明，內(nèi)生細(xì)菌與宿主植物組織表面的親和機(jī)制如何,可能會(huì)影響到內(nèi)生細(xì)菌侵染宿主植物的效率，并可能是影響內(nèi)生細(xì)菌共生特異性的因素[7]。還有研究表明，許多的植物內(nèi)生細(xì)菌具有宿主專一性特點(diǎn)，同一植物不同品種因環(huán)境或其他原因，也具有不同種類的內(nèi)生細(xì)菌，同種內(nèi)生細(xì)菌定殖寄主體內(nèi)和促進(jìn)寄主的生長(zhǎng)的能力，也可能因同種植物不同的品種而有所差異[8]?；诖耍狙芯科谕麖哪豌U的小喬木紅葉石楠上分離純化出耐鉛的內(nèi)生細(xì)菌，為成功定殖在木本植物體內(nèi)并提高其耐鉛的能力打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

1.1.1 紅葉石楠

取自栽種于三明學(xué)院校門G205國(guó)道兩側(cè)綠化帶中紅葉石楠根莖葉3個(gè)部位，由于此路段有大量重型汽車行駛經(jīng)過(guò)且車流量較大，且汽車尾氣中的主要成分是含鉛化合物，所以此路段土壤在受到到汽車尾氣的長(zhǎng)期污染下已存在鉛重金屬污染，而栽種的植株必定受到一定程度的鉛脅迫。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，其中鉛離子濃度依次為 0、0.3、0.6、0.9、1.2 mol/mL[6]。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離和純化

紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌的分離方法參照本課題組小飛蓬耐鉛內(nèi)生細(xì)菌的分離方法[6]。

1.3 形態(tài)及生理生化鑒定

對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行檸檬酸鹽反應(yīng)、VP試驗(yàn)、革蘭氏染色、甲基紅試驗(yàn)和接觸酶反應(yīng)等檢驗(yàn)[6]。

1.4 分子鑒定

菌株基因組DNA用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒V2.2進(jìn)行提取，以通用引物8f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和 1492r（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）（上海華大基因）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。退火溫度為52℃。PCR產(chǎn)物為1 800 bp左右，用pMD19-T Vector連接PCR產(chǎn)物，挑取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，送往杭州有康生物科技有限公司測(cè)序[6]。

測(cè)序后的序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，BLAST比對(duì)分析，用Clustal X 1.83對(duì)同源性超過(guò)95%序列進(jìn)行分析，用軟件 MEGA（7.0）利用 Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)生菌的分離與純化

紅葉石楠表面滅菌處理的最后一遍無(wú)菌水涂布檢測(cè)分析，7 d后，沒(méi)有長(zhǎng)出菌落，說(shuō)明外植體表面消毒干凈。從不同鉛濃度的培養(yǎng)基上分離得到的細(xì)菌為內(nèi)生細(xì)菌，共分離純化出44株內(nèi)生細(xì)菌，其中在根、莖、葉的部位分別分離出17株、16株和11株（表 1）。

表1 紅葉石楠分離菌株情況

2.2 形態(tài)學(xué)與耐鉛生理濃度檢測(cè)

菌落為圓形，邊緣無(wú)鋸齒狀，乳白色，表面光滑。經(jīng)顯微鏡觀察，所有菌株革蘭氏染色結(jié)果均為G+菌，其菌株形態(tài)為桿狀和球狀。淀粉水解酶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都為陽(yáng)性（+），40株甲基紅試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果為陰性（-），39株菌 VP試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性（+），40株過(guò)氧化氫酶結(jié)果為陽(yáng)性（+）（表2）。

表2 生理生化結(jié)果

2.3 內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA分子鑒定

根據(jù)細(xì)菌的形狀、甲基紅試驗(yàn)、VP試驗(yàn)結(jié)果和過(guò)氧化氫實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提取S5、S11、S12、S13、S15、S16、S17、S22、S25和S43這些內(nèi)生細(xì)菌的DNA，擴(kuò)增各自的16S rDNA序列，并送去測(cè)序。測(cè)序分析結(jié)果表明，這些內(nèi)生細(xì)菌16SrDNA序列有3種，其中，S43為一種菌，S5、S12、S13和S25的16S rDNA序列相同，S11、S15、S16、S17和S22的16SrDNA序列相同。將這3段16S rDNA序列上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，收集同源性高的序列。

利用MEGA（7.0）將紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌菌株與其同源性較高的菌株16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹 （圖1）。從不同菌株的遺傳距離上進(jìn)行比較分析，初步推斷出S5為假單胞菌屬(Pseudomonas)，S17為蠟樣芽孢桿菌屬(Bacillus cereus)，S43為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)。

2.4 討論

生長(zhǎng)在重金屬污染的地區(qū)植物，隨著人類和動(dòng)物的取食，積累在植物體內(nèi)的重金屬也會(huì)隨之進(jìn)入人類體內(nèi)，進(jìn)而危害人類的健康[10]。因此在重金屬污染的土壤修復(fù)過(guò)程中，應(yīng)避免可食用的植物如蔬菜和一些易被動(dòng)物食用的草本植物用于重金屬污染土壤生物修復(fù)。大部分木本植物因?yàn)槠洳贿M(jìn)入食物鏈，在植物修復(fù)重金屬污染過(guò)程中將發(fā)揮重要的角色。

微生物與植物的共生關(guān)系促進(jìn)植物在鉛脅迫的條件下生長(zhǎng)的現(xiàn)象，在小白菜[11]、扁豆[12]等植物上也有發(fā)現(xiàn)相類似情況。芽孢桿菌屬能幫助植物在重金屬離子脅迫下，產(chǎn)生生長(zhǎng)激素如IAA等[13]，以利于植物生長(zhǎng)。芽孢桿菌屬能幫助小白菜在鉛脅迫下，減少Pb的吸附量，以提高葉綠素含量，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[11]。不動(dòng)桿菌和假單胞菌屬在Pb的脅迫下能產(chǎn)生出IAA等生長(zhǎng)素，在植物某個(gè)部位、組織或結(jié)構(gòu)中生長(zhǎng)素含量越多，對(duì)植物生長(zhǎng)和吸收重金屬便越有利[14-16]。芽孢桿菌屬和假單胞菌屬可以溶解土壤中有機(jī)磷，促進(jìn)植物對(duì)磷的吸收[17]；假單胞菌屬具有ACC脫氨酶，能夠阻止植物產(chǎn)生乙烯，可以促進(jìn)植物根的生長(zhǎng)[18]。因此推斷出這些內(nèi)生細(xì)菌與紅葉石楠的共生關(guān)系在一定程度上能防止鉛離子對(duì)其的傷害。

圖1 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的紅葉石楠內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

本研究是以紅葉石楠根莖葉在含有不同鉛離子濃度的培養(yǎng)基中分離出耐鉛內(nèi)生細(xì)菌，共分離出44株耐鉛的內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)所分離的菌株進(jìn)行生理生化分析，并通過(guò)16S rDNA序列的遺傳距離聚類分析等分子鑒定相結(jié)合的方法，將這些菌株分別歸為假單胞菌屬、蠟樣芽孢桿菌屬和不動(dòng)桿菌屬。本研究為鉛污染地區(qū)土壤的微生物與植物聯(lián)合的生物修復(fù)提供了行之有效的技術(shù)理論基礎(chǔ)。