耐碳青霉烯類高毒力肺炎克雷伯菌的研究進展

鄭 茂， 鄒 玉， 劉 曉，袁成良

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是臨床常見的條件致病菌，可引起肺部感染、尿路感染以及血流感染等多種疾病，嚴(yán)重時還可引起膿毒血癥、化膿性腦膜炎等致死率極高的危急重癥[1]。伴隨莢膜多糖的差異和細(xì)菌毒力的變遷，肺炎克雷伯菌還進化出新變種——高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella pneumoniae，hvKP）。hvKP具有獨特的表型特征（如高黏液型、特殊血清型）和基因型特征（如攜帶特殊的毒力基因），臨床致病力更強，不僅可以導(dǎo)致免疫功能低下的患者感染，還可以使免疫功能正常的年輕人群發(fā)生重癥社區(qū)獲得性感染，如肝膿腫、化膿性眼內(nèi)炎、化膿性腦膜炎甚至骨髓炎等，并可呈現(xiàn)遷徙性播散[2]。傳統(tǒng)研究觀點認(rèn)為，高毒力和多重耐藥在hvKP基因組上沒有重疊，大部分hvKP對常用抗菌藥物（氨芐西林除外）保持高度敏感，耐藥率極低，故臨床針對hvKP感染可進行及時有效治療[3]。碳青霉烯類抗生素是目前治療產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）、頭孢菌素酶（AmpC）等多重耐藥菌所致重癥感染的一線用藥，但隨著臨床廣泛應(yīng)用，耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（CRE）檢出率呈逐年上升的態(tài)勢，特別是耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（carbapenemresistantKlebsiella pneumoniae，CR-KP）上升幅度明顯[4-5]。以其高毒力和高耐藥匯聚在同一種細(xì)菌，成為“超級細(xì)菌”，耐碳青霉烯類高毒力肺炎克雷伯菌（carbpenem-resistant hypervirulentKlebsiella pneumoniae，CR-hvKP）的出現(xiàn)，給全球公共衛(wèi)生及臨床抗感染治療帶來極大挑戰(zhàn)[6]。本文對近年來CR-hvKP的研究進展作綜述。

1 CR-hvKP的流行情況

上世紀(jì)八十年代，我國臺灣地區(qū)首次報道hvKP感染引起肝膿腫病例后，hvKP逐漸成為臨床關(guān)注的重點。亞洲地區(qū)尤其是中國hvKP感染率非常高，肺炎克雷伯菌臨床分離株中超過三分之一為高毒力株，地理分布呈多樣性[3]。近年來，由于碳青霉烯類耐藥基因和耐藥質(zhì)粒的傳播，全球各地陸續(xù)出現(xiàn)CR-hvKP的報道。2014年，阿根廷Cejas等[7]報道從老年患者中分離的1株CR-hvKP，該菌株攜帶多種耐藥基因和毒力基因，在南美洲屬首次分離，患者最終因多種基礎(chǔ)疾病及感染惡化而死亡。2016年，印度連續(xù)報道攜帶NDM-1、OXA-232、OXA-181、OXA-1的4株CR-hvKP全基因組序列，分別來源于不同血流感染和尿路感染的患者[8-9]。2017年，意大利Arena等[10]報道1株分離自肝膿腫繼發(fā)血流感染患者的CR-hvKP，并詳細(xì)描述了其臨床流行病學(xué)和遺傳學(xué)特征。2018年，伊朗Mohammad等[11]報道德黑蘭一家醫(yī)院ICU內(nèi)實施機械通氣的5例患者暴發(fā)CR-hvKP醫(yī)院感染，并導(dǎo)致4例患者死亡。2019年，美國Karlsson等[12]報道從門診患者尿液標(biāo)本中分離的1株CR-hvKP，該菌株攜帶多種毒力基因。2020年，新加坡Chen等[13]對住院患者的556株CR-KP進行回顧性調(diào)查，分離到來源于7例患者的18株CR-hvKP，所有菌株均攜帶pKPC-2耐藥質(zhì)粒。

相對于全球其他地區(qū)的CR-hvKP感染情況，中國的CR-hvKP感染蔓延趨勢更為嚴(yán)重，已成為CRE研究的熱點問題。2015年，北京大學(xué)Zhang等[14]進行的一項全國多中心流行病學(xué)調(diào)查，首次從血液樣本中分離出1株高黏液性肺炎克雷伯菌，亞胺培南對其MIC＞32 mg/L，鑒定為CR-hvKP，該菌株產(chǎn)ESBL伴外膜孔蛋白OmpK35/36低表達，攜帶多種毒力基因，與CR-KP非高毒力株相比表現(xiàn)出更高的血清抗性及小鼠致死率。此后，北京、上海、江西、浙江、四川、湖南等多省市陸續(xù)出現(xiàn)CR-hvKP的研究報道[15-20]。

2020年，Zhang等[21]再次報道一項全國多中心、縱向監(jiān)測CR-hvKP的研究，對2015－2017年全國56個中心的CR-KP進行回顧性調(diào)查，從1 052株CR-KP中鑒定出55株CR-hvKP；各地區(qū)的菌株構(gòu)成比差異較大，在山東、河南檢出的CR-KP中，CR-hvKP占比甚至高達25.8%（25/97）、25.4%（17/67）；另外，在產(chǎn)KPC-2酶的ST11型CR-KP中，CR-hvKP占比亦從2015年的2.1%（3/141）上升至2017年的7.0%（23/329）。由此可見，CR-hvKP在中國的流行形勢日趨嚴(yán)峻。

2 CR-hvKP的分子特征及毒力特征

根據(jù)莢膜多糖結(jié)構(gòu)和抗原性不同，可將肺炎克雷伯菌分為至少82個莢膜血清型，其中Kl、K2、K5、K20、K54和K57是hvKP的獨特血清型，故也是CR-hvKP的特征性血清型，與其引起的各種侵襲性感染密切相關(guān)。多位點序列分型（MLST）是一種基于核酸序列的細(xì)菌分型方法，可將CR-hvKP分為多種ST型，常用于分析菌株的分子流行特征。近年文獻中涉及CR-hvKP詳細(xì)分型總結(jié)于表1。目前的研究數(shù)據(jù)顯示CR-hvKP的血清型以Kl、K2最常見，其次是K47、K64，其他少見血清型如K20、K54、K62也有個別報道。CR-hvKP的ST分型以ST11、ST23最常見，其他如ST25、ST29、ST36、ST65、ST86、ST268、ST1797等也有少量報道。CR-hvKP的不同血清型與ST分型之間表現(xiàn)出一定程度的相關(guān)性，K1血清型以ST23為主，K2血清型以ST65、ST86為主，K47、K64血清型則均以ST11為主。

CR-hvKP的毒力特征多與hvKP相同，其高毒力的物質(zhì)基礎(chǔ)是莢膜多糖和鐵載體系統(tǒng)。莢膜多糖使CR-hvKP可以抗中性粒細(xì)胞吞噬作用以及抗血清補體殺菌活性，涉及的毒力基因包括rmpA、magA、wcaG等。鐵載體系統(tǒng)對于CR-hvKP的生長繁殖至關(guān)重要，同時也是其重要的毒力因子，涉及的毒力基因包括aerobactin、ybt、ent、kfu、iuc、iro等。此外，細(xì)菌菌毛介導(dǎo)與宿主細(xì)胞接觸或黏附于黏膜表面，是CR-hvKP感染機體的重要介質(zhì)，涉及的毒力基因包括fim、mrk等。如表1所示，目前文獻報道的CR-hvKP均攜帶多種毒力基 因。

除攜帶毒力基因外，CR-hvKP通常還攜帶碳青霉烯類耐藥基因，所編碼的碳青霉烯酶是一種能水解碳青霉烯類抗生素的β內(nèi)酰胺酶，在Ambler分子分類法中屬于A、B、D類酶。A類酶編碼基因包括KPC、NMC、SME等；B類酶又稱為金屬酶，編碼基因包括NDM、IMP、VIM等；D類酶為苯唑西林酶（OXA），對碳青霉烯類水解效率較低[4]。由表1數(shù)據(jù)可知，KPC-2、NDM-1是CR-hvKP最常見的碳青霉烯類耐藥基因，主要流行于ST11型菌株；VIM-1、VIM-2、OXA-232等在CR-hvKP中也有攜帶，但比例相對較低，主要流行于ST23型菌株。以往文獻多報道CR-hvKP僅攜帶單一碳青霉烯類耐藥基因，但隨著研究的深入和全基因組測序的普及，Wei等[22]、Liu等[23]還報道1株同時攜帶KPC-2和NDM-1的CR-hvKP，并獲得其完整的基因組序列；該菌株分離自1例老年男性的燒傷患者，表現(xiàn)出泛耐藥特征，對包括亞胺培南、美羅培南、厄他培南在內(nèi)的所有β內(nèi)酰胺類，以及喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類均耐藥。

3 CR-hvKP的碳青霉烯類耐藥機制

產(chǎn)碳青霉烯酶是造成肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因，其編碼基因位于細(xì)菌質(zhì)粒或染色體上，通過轉(zhuǎn)座子或結(jié)合性質(zhì)粒等移動元件在菌株與人群之間廣泛傳播。2016年，Rafiq等[9]報道1株CR-hvKP存在OmpK36膜孔蛋白突變，使其在缺乏碳青霉烯類耐藥基因的情況下出現(xiàn)對碳青霉烯類耐藥的現(xiàn)象。2018年，Gu 等[26]報道浙江某大型醫(yī)院ICU內(nèi)發(fā)生由CR-hvKP引起的呼吸機相關(guān)性肺炎的醫(yī)院感染，導(dǎo)致5例患者死亡；深入研究證實所有CR-hvKP均為同一個ST11型克隆株，其高毒力通過獲得約170 kbp大小的pLVPK-like毒力質(zhì)粒進化而產(chǎn)生，當(dāng)消除該質(zhì)粒后其毒力大幅下降。2019年，Shen等[38]報道1株產(chǎn)NDM-5酶的ST35型CR-hvKP，該菌株在小鼠腹膜炎感染模型中表現(xiàn)出明顯的抗血清殺菌和抗中性粒細(xì)胞吞噬能力，但不攜帶pLVPK-like毒力質(zhì)粒，而是在特定的天冬酰胺-tRNA基因中發(fā)現(xiàn)了ICEKp1染色體整合，從而編碼多種毒力基因（iroBCDN、rmpA等）。通過對文獻數(shù)據(jù)的分析，CR-hvKP的碳青霉烯類耐藥機制可能存在3種途徑：①CR-KP非高毒力株獲得hvKP攜帶的毒力基因質(zhì)粒，如pLVPK-like毒力質(zhì)粒[26-27]；②hvKP獲得編碼碳青霉烯酶的質(zhì)粒進化為CR-hvKP[14，39-40]；

③hvKP在碳青霉烯類抗生素壓力誘導(dǎo)下外膜孔蛋白發(fā)生變異，產(chǎn)生耐藥表型[9，14]。

表1 近年來文獻報道的CR-hvKP的分子特征及毒力基因

質(zhì)粒在推動碳青霉烯類耐藥的全球快速傳播和適應(yīng)性變化方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，針對CR-hvKP攜帶的毒力質(zhì)粒及耐藥質(zhì)粒，香港理工大學(xué)開展了系統(tǒng)深入的研究。2018年，Dong等[41]利用納米孔測序技術(shù)獲得3株CR-hvKP的全基因組序列，確定了菌株攜帶質(zhì)粒的獨特遺傳特征，發(fā)現(xiàn)非結(jié)合性毒力質(zhì)粒與帶有結(jié)合性KPC-2的耐藥質(zhì)粒之間存在同源區(qū)域，提示毒力質(zhì)粒從ST23型hvKP到ST11型CR-KP的傳遞可能是通過這兩個質(zhì)粒的共整合轉(zhuǎn)移來實現(xiàn)。這是首次證實質(zhì)粒攜帶的碳青霉烯類耐藥基因可在hvKP傳播，并仍可保持其高毒力特性。此后，該團隊還首次發(fā)現(xiàn)混合編碼rmpA2和KPC-2的雜交質(zhì)粒[42]，這種質(zhì)粒是由IS26介導(dǎo)KPC-2和dfrA耐藥性移動元件插入毒力質(zhì)粒而形成，具有同時介導(dǎo)高耐藥和高毒力表型的能力，這種新興質(zhì)粒在肺炎克雷伯菌中傳播將導(dǎo)致CR-hvKP感染率顯著升高。2019年，Dong等[43]報道1株攜帶3個質(zhì)粒的ST11型CR-hvKP，包括1個pLVPK-like毒力質(zhì)粒和2個多重耐藥質(zhì)粒（pKPCCR-hvKP、pCTX-M-CR-hvKP），多重耐藥質(zhì)粒來源于單個pKPC-CR-hvKP-like質(zhì)粒的同源重組；KPC-2基因被串聯(lián)定位在具有NTEKPC-Id-like結(jié)構(gòu)的非結(jié)合性質(zhì)粒上，推測該質(zhì)粒可能是Tnp26通過催化可移動元件的活性進行保守反應(yīng)的結(jié)果，表明ST11型CR-hvKP克隆中的質(zhì)粒可以發(fā)生活躍的基因重組。同年，Dong等[35]還報道1株ST23型CR-hvKP，該菌株含有3個抗藥性編碼質(zhì)粒（pR210-2-vir、pR210-2-VIM、pR210-2-CTX），其中攜帶VIM-1的質(zhì)粒具有可能由多個基因動員事件產(chǎn)生的嵌合體結(jié)構(gòu)，表明hvKP通過基因水平轉(zhuǎn)移主動獲得了可移動的抗性編碼元件，促進超強毒力和碳青霉烯類耐藥性在CR-hvKP中同時表達。此外，Yang等[40]還發(fā)現(xiàn)一種可結(jié)合性毒力質(zhì)粒（p15WZ-82-vir），這類質(zhì)粒可與CR-KP結(jié)合，使其能同時表達高毒力和碳青霉烯類耐藥性，與非結(jié)合性pLVPK質(zhì)粒不同，可結(jié)合性毒力質(zhì)粒的出現(xiàn)可能會促進革蘭陰性細(xì)菌中毒力編碼元件的快速傳 播。

在hvKP與質(zhì)粒相互作用方面，Long等[44]還報道了攜帶NDM質(zhì)粒的hvKP全局轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，位于質(zhì)粒pLVPK上的毒力相關(guān)基因下調(diào)是這種轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的主要特征。hvKP對碳青霉烯酶編碼質(zhì)粒的應(yīng)答是通過改變糖代謝、抗生素耐藥性、莢膜生物合成等相關(guān)基因表達來實現(xiàn)，該研究證實攜帶碳青霉烯類耐藥基因的質(zhì)粒除了具有耐藥性選擇優(yōu)勢外，還可能導(dǎo)致hvKP的毒力改變或?qū)μ囟ōh(huán)境的適應(yīng)。

4 CR-hvKP的抗菌治療

盡管CR-hvKP表現(xiàn)出泛耐藥特性，但仍然對少數(shù)幾種抗菌藥物保持敏感，如替加環(huán)素和黏菌素[33]。然而，有研究顯示長期使用替加環(huán)素或黏菌素（單獨或與幾種其他抗生素組合）治療不能根除產(chǎn)KPC-2酶的ST11型CR-hvKP[26]。值得注意的是，已有對替加環(huán)素或黏菌素耐藥的CR-hvKP報道出現(xiàn)。Gu等[45]從患者腸道中分離出的ST11型CR-hvKP，檢測到同時攜帶tet(A)、KPC-2的質(zhì)粒，其中acrA、acrB、ramA基因過表達，導(dǎo)致菌株對替加環(huán)素出現(xiàn)耐藥。Huang等[27]從1例腹腔內(nèi)膿腫死亡患者中分離到1株ST11型CR-hvKP，該菌株攜帶含多種毒力基因的pLVPK-like質(zhì)粒，除對碳青霉烯類耐藥外，對替加環(huán)素和黏菌素也耐藥。因此，CR-hvKP感染對有效抗生素的需求迫在眉 睫。

頭孢他啶-阿維巴坦是一種新型頭孢菌素-β內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合劑。國外一項多中心、前瞻性研究顯示治療CR-KP引起的CRE感染，頭孢他啶-阿維巴坦比黏菌素更有效，可明顯改善患者臨床結(jié)局，尤其是降低醫(yī)院死亡率[46]。Yu等[47]首次檢測了頭孢他啶-阿維巴坦和其他抗生素對65株CR-hvKP的抗菌活性，結(jié)果顯示頭孢他啶-阿維巴坦、黏菌素和替加環(huán)素在體外對CR-hvKP均具有很高的抗菌活性（MIC90≤1 mg/L），包括對產(chǎn)KPC-2酶的ST11型CR-hvKP，該研究表明頭孢他啶-阿維巴坦可能是治療CR-hvKP的合理選擇。

5 結(jié)語及展望

CR-hvKP在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)愈演愈烈的蔓延趨勢，該菌株既表達毒力因子，又?jǐn)y帶耐藥基因，一旦廣泛播散，將極大地增加臨床治療難度。研發(fā)有效的抗菌藥物是臨床控制CR-hvKP感染的有效手段，而探究其高毒力相關(guān)基因及耐藥基因的獲得機制，或?qū)⒊蔀檠邪l(fā)新型治療及抑制其傳播藥物的有效途徑。目前預(yù)防CR-hvKP傳播的關(guān)鍵是加強主動監(jiān)測，通過全面感染控制措施遏制其傳播，重點是防止醫(yī)院內(nèi)傳播。