頭頸鱗狀細(xì)胞癌中HSDL2的表達(dá)水平及臨床意義

王藝璇，王馨悅，林貞花，孫 潔，楊 洋，金愛(ài)花

頭頸鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)是指由口腔、口咽、喉部和下咽的鱗狀上皮細(xì)胞形成的一組惡性侵襲性腫瘤[1]，其發(fā)病率占頭頸部腫瘤總發(fā)病率的95%以上[2]。由于HNSCC發(fā)病的高隱匿性、高轉(zhuǎn)移性以及缺乏有效的早期診斷標(biāo)志物，患者的5年生存率僅40%～50%[3-4]。因此，探尋HNSCC的早期診斷標(biāo)志物刻不容緩。人類(lèi)羥基類(lèi)固醇脫氫酶樣蛋白2(hydroxysteroid dehydrogenase like 2, HSDL2)作為短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)超家族中的成員之一，在乳腺癌[5]、甲狀腺乳頭樣癌[6]、卵巢癌[7]和胃癌[8]等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)且發(fā)揮重要作用。目前，關(guān)于HSDL2在HNSCC中的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在探討HSDL2在HNSCC中的表達(dá)及臨床意義，為篩選HNSCC的早期診斷標(biāo)志物和藥物治療靶點(diǎn)提供可能的分子生物學(xué)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 組織芯片購(gòu)自西安艾麗娜公司，包括61例HNSCC組織標(biāo)本和11例癌旁正常組織標(biāo)本。61例HNSCC中男性51例，女性10例；年齡<60歲者34例，≥60歲者27例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者42例；組織分化程度：高分化16例，中分化32例，低分化13例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期28例，Ⅲ+Ⅳ期33例。

1.1.2主要試劑 HSDL2抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司(15631-1-AP)，免疫組化SP兩步法試劑盒、檸檬酸緩沖液、PBS緩沖液、DAB顯色劑和蘇木精染料，均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1生信分析 應(yīng)用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)[9]分析HNSCC組織和正常組織中HSDL2 mRNA的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系；應(yīng)用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www. proteinatlas.org/)[10]分析HSDL2蛋白(抗體編號(hào)HPA050453)在HNSCC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平及其與患者總生存期的關(guān)系；應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)[11]分析HSDL2的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及其可能參與的生物學(xué)進(jìn)程。

1.2.2免疫組化 采用免疫組化SP兩步法檢測(cè)HSDL2蛋白的表達(dá)水平，60 ℃烤片45 min，常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化，熱檸檬酸鹽緩沖液水浴30 min進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加一抗HSDL2(稀釋濃度為1 ∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜；次日，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封固。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照組。

1.3 結(jié)果判斷以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為HSDL2蛋白陽(yáng)性染色。(1)根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項(xiàng)評(píng)分相乘作為最終得分：0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為()，9～12分為()。其中≤4分為低表達(dá)，>4分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析，HSDL2表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性分析，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HNSCC組織中HSDL2 mRNA的表達(dá)通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析520例HNSCC組織和44例正常組織中HSDL2 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與正常組織相比，HSDL2 mRNA的表達(dá)水平在HNSCC中顯著降低(P<0.01，圖1A)。進(jìn)一步分析HSDL2 mRNA的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其與HNSCC臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)：HSDL2 mRNA在臨床分期Ⅰ～Ⅳ期HNSCC組織中的表達(dá)水平顯著低于正常組織(圖1B)；HSDL2 mRNA表達(dá)水平從淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的N1～N3期呈逐漸降低趨勢(shì)(P<0.05，圖1C)。本組HPV陰性HNSCC組織中，HSDL2 mRNA表達(dá)水平亦顯著低于正常組織和HPV陽(yáng)性HNSCC組織(P<0.01，圖1D)，提示HSDL2與HNSCC的惡性演進(jìn)密切相關(guān)。

圖1 UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)檢索HSDL2 mRNA的表達(dá)：A.HSDL2 mRNA在正常組織和頭頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)；B.HSDL2 mRNA表達(dá)水平與臨床分期的關(guān)系；C.HSDL2 mRNA表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N分期的關(guān)系；D.HSDL2 mRNA表達(dá)水平與HPV感染的關(guān)系

2.2 HNSCC組織中HSDL2蛋白的表達(dá)應(yīng)用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析HSDL2蛋白在HNSCC組織和正常組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSDL2蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，少量表達(dá)于細(xì)胞核，在正常口腔組織中高表達(dá)(圖2A)，在HNSCC組織中低表達(dá)(圖2B)，提示HSDL2表達(dá)下調(diào)與HNSCC發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。免疫組化結(jié)果顯示HSDL2蛋白表達(dá)及定位與HPA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果一致，即HSDL2蛋白在正常組織中高表達(dá)，且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)(圖2C)，在HNSCC組織中低表達(dá)(圖2D)。61例HNSCC組織中，HSDL2蛋白的陽(yáng)性率(57.4%，35/61)和強(qiáng)陽(yáng)性率(34.4%，21/61)均顯著低于癌旁正常組織(陽(yáng)性率90.9%，強(qiáng)陽(yáng)性率81.8%)，且差異有顯著性(P<0.05，表1)。

ABCD

表1 正常組織和頭頸鱗狀細(xì)胞癌組織中HSDL2蛋白的表達(dá)

2.3 HNSCC組織中HSDL2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系通過(guò)分析HSDL2蛋白表達(dá)與HNSCC臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：HSDL2蛋白低表達(dá)與HNSCC患者性別、年齡及分化程度無(wú)關(guān)，與臨床分期(P<0.01)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)密切相關(guān)(表2，圖3)。HSDL2蛋白在臨床分期Ⅲ+Ⅳ期HNSCC組織中的強(qiáng)陽(yáng)性率(5/33，15.2%)明顯低于Ⅰ+Ⅱ期HNSCC組織(16/28，57.1%)(P=0.001)；HSDL2蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HNSCC組織中的強(qiáng)陽(yáng)性率(3/19，15.8%)明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HNSCC組織(18/42，42.9%)(P=0.047)；提示HSDL2蛋白可能參與HNSCC的發(fā)生、發(fā)展。

ABCD

表2 頭頸鱗狀細(xì)胞癌中HSDL2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 HSDL2蛋白與HNSCC患者預(yù)后的關(guān)系應(yīng)用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析HSDL2蛋白表達(dá)與HNSCC患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSDL2蛋白低表達(dá)組患者(n=393)的生存期低于高表達(dá)組患者(n=106)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014，圖4)；提示HSDL2蛋白低表達(dá)HNSCC的患者預(yù)后不良。

圖4 HSDL2表達(dá)與HNSCC患者生存期的關(guān)系

2.5 HSDL2參與的生物學(xué)進(jìn)程及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析HSDL2參與的生物學(xué)進(jìn)程及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。GO富集分析結(jié)果顯示，HSDL2主要參與調(diào)控脂肪酸分解代謝、脂肪酸氧化、靶向調(diào)控過(guò)氧化物酶體、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)進(jìn)程(圖5A)。蛋白網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果顯示，與HSDL2互作的蛋白主要包括ACSF2、ALDH3A2等(圖5B，表3)。

圖5 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析HSDL2可能參與的生物學(xué)進(jìn)程及互作蛋白：A.HSDL2可能參與的生物學(xué)進(jìn)程(GO富集分析)；B.HSDL2互作蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

表3 HSDL2 互作蛋白參與的生物學(xué)進(jìn)程

3 討論

HNSCC具有病情進(jìn)展隱匿、早期臨床癥狀不典型的特點(diǎn)，多數(shù)患者診斷時(shí)已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，致使HNSCC的發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)逐年升高[12-13]。由于HNSCC復(fù)雜的異質(zhì)性，其機(jī)制尚未完全闡明；因此亟需進(jìn)一步探索HNSCC中的分子標(biāo)志物明確其可能的分子機(jī)制。

HSDL2最初鑒別于人胎腦組織的cDNA文庫(kù)中，定位于染色體9q32位點(diǎn)，編碼HSDL2蛋白[14]。該蛋白由418個(gè)氨基酸組成，包含N-端SDR結(jié)構(gòu)域，C-端SCP-2結(jié)構(gòu)域和過(guò)氧化物酶體靶向信號(hào)ARL[15]，對(duì)糖、類(lèi)固醇和脂肪酸的能量代謝具有重要作用[16]。HSDL2作為類(lèi)固醇脫氫酶家族成員之一，不僅與過(guò)氧化物酶體結(jié)合，而且還能夠與輔酶NADPH相互作用形成復(fù)合體[15]，進(jìn)而調(diào)控膽固醇代謝[17-18]。近年研究顯示，HSDL2作為脂代謝中有效的調(diào)節(jié)因子在多種腫瘤中異常表達(dá)。Ruokun等[19]研究發(fā)現(xiàn)，HSDL2在人腦膠質(zhì)瘤組織中異常高表達(dá)，且可正向調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、周期阻滯和凋亡。Shi等[20]研究亦證實(shí)，下調(diào)HSDL2表達(dá)不僅可體外抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，還可降低體內(nèi)荷瘤的形成率及轉(zhuǎn)移率。然而，HSDL2在HNSCC發(fā)生、發(fā)展中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

本組通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，HSDL2 mRNA表達(dá)在HNSCC中顯著降低，其低表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。HPV作為HNSCC的預(yù)后標(biāo)志物之一，可預(yù)示患者的轉(zhuǎn)歸。HPV陽(yáng)性HNSCC患者具有更長(zhǎng)的總生存期和無(wú)瘤生存期，且與治療模式無(wú)關(guān)[21]。本組通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析亦發(fā)現(xiàn)，HSDL2在HPV陰性HNSCC組織中的表達(dá)水平低于正常組織和HPV陽(yáng)性HNSCC組織(P<0.01)，因此HSDL2低表達(dá)提示HNSCC不良預(yù)后可能與HPV感染有關(guān)，但仍需深入分析。免疫組化染色結(jié)果顯示，HSDL2蛋白在HNSCC組織中的表達(dá)顯著低于正常癌旁組織(P<0.05)。該結(jié)果與HPA數(shù)據(jù)庫(kù)一致，HSDL2蛋白在正常組織中呈中～高表達(dá)，在HNSCC組織中呈低表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，HSDL2蛋白表達(dá)與HNSCC臨床分期(P=0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.047)呈負(fù)相關(guān)；提示HSDL2可能是作為抑癌基因在HNSCC的惡性演進(jìn)中發(fā)揮作用，與Zhang等[22]在膽管癌中的研究結(jié)果相符。進(jìn)一步通過(guò)HPA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)HSDL2蛋白表達(dá)與HNSCC患者預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HSDL2蛋白低表達(dá)患者的生存期更低，提示HSDL2蛋白低表達(dá)可能是判斷HNSCC不良預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。

此外，通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，HSDL2參與調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和脂質(zhì)代謝過(guò)程。這可能與HSDL2的特異性結(jié)構(gòu)域有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，HSDL2可通過(guò)C-端結(jié)構(gòu)域中包含的PTS1特異性靶向過(guò)氧化物酶體，參與脂肪酸的過(guò)氧化物酶體的氧化過(guò)程[17]。同時(shí)，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，HSDL2可與過(guò)氧化物酶體活化相關(guān)蛋白ECH1[23]、調(diào)節(jié)脂肪酸β-氧化過(guò)程的ALDH3A2[24]相互作用。上述結(jié)果說(shuō)明，HSDL2調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和脂質(zhì)代謝可能涉及多種生物學(xué)途徑，其具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步分析。

近年多項(xiàng)研究證實(shí)HSDL2在腫瘤中扮演的角色具有“雙重性”[5-8,22]，但HSDL2的所有研究?jī)H局限在細(xì)胞表型和分子標(biāo)志物，具體調(diào)控機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，推測(cè)HSDL2的“雙重性”可能與以下幾個(gè)方面有關(guān)：(1)HSDL2在不同腫瘤細(xì)胞中的定位不同，導(dǎo)致其參與的生物學(xué)過(guò)程以及信號(hào)通路不同；(2)不同腫瘤的組織特異性也可導(dǎo)致HSDL2的差異表達(dá)；(3)不同腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境也可導(dǎo)致HSDL2的基因雙重性；(4)相關(guān)的致癌/抑癌基因也可影響HSDL2的生物學(xué)作用?？傊?，HSDL2的“雙重性”取決于腫瘤細(xì)胞類(lèi)型、微環(huán)境、相關(guān)基因等因素，是HSDL2未來(lái)研究的重點(diǎn)。

綜上所述，HSDL2在HNSCC中的表達(dá)有不同程度的下調(diào)或缺失，其低表達(dá)提示腫瘤有較強(qiáng)的惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能，對(duì)HNSCC的早期診斷和預(yù)后評(píng)估具有一定的指導(dǎo)意義。