18F-FDG PET/CT 圖像的影像組學分析在膠質(zhì)瘤MGMT 基因甲基化狀態(tài)評估中的初步應(yīng)用

寧靜 于 鵬 劉家金 黨浩丹 徐白萱

中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心核醫(yī)學科，北京 100853

替莫唑胺（temozolomide, TMZ）是初診或復發(fā)性膠質(zhì)瘤患者的重要化療藥物[1]。O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT）基因甲基化可使膠質(zhì)瘤患者對TMZ 治療產(chǎn)生更好的臨床反應(yīng)，特別是能顯著延長患者的生存期[2]。因此，MGMT 基因甲基化狀態(tài)的評估對于膠質(zhì)瘤患者治療方案的選擇至關(guān)重要。

18F-FDG PET/CT 已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷。葡萄糖代謝可以直接反映膠質(zhì)瘤的代謝特征，并進一步指示膠質(zhì)瘤的生物學特征，如腫瘤細胞的增殖狀態(tài)、膠質(zhì)瘤的分級和內(nèi)在的血管分布等[3-4]。盡管術(shù)中組織病理學檢查仍是診斷膠質(zhì)瘤的“金標準”，但利用分子探針來探索顯像劑與膠質(zhì)瘤分子特征之間的相關(guān)性逐漸成為研究焦點。已有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過分析18F-FDG 的代謝指標[腫瘤與正常組織攝取率（tumor-to-normal-tissue uptake ratio，TNR）]能夠預測MGMT 基因的甲基化狀態(tài)[5]。

影像組學通過提取ROI 高通量的圖像特征，能將肉眼不可見的影像信息轉(zhuǎn)化為多維可挖掘的空間特征數(shù)據(jù)[6]。相關(guān)研究結(jié)果表明，影像組學的研究方法相較于傳統(tǒng)的手動勾畫ROI，能夠從圖像中獲取更多有用的信息，此類信息對于提高確診率和預測預后至關(guān)重要[7-8]，特別是近年來，因其可無創(chuàng)、重復且整體分析腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性而愈發(fā)受到重視[9-10]。

據(jù)筆者所知，迄今尚未有已發(fā)表的研究通過分析18F-FDG PET/CT 圖像的紋理特征來探索膠質(zhì)瘤的特征與MGMT 基因甲基化狀態(tài)之間的關(guān)系。本研究嘗試以此來綜合評估MGMT 基因甲基化狀態(tài)，以預測膠質(zhì)瘤患者對TMZ 治療的反應(yīng)，并探索膠質(zhì)瘤的多種生物學特性，以服務(wù)于臨床診療。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016 年1 月至2018 年9 月在中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心核醫(yī)學科進行18F-FDG PET/CT 檢查的17 例膠質(zhì)瘤患者，其中男性13 例、女性4 例。納入標準：（1）經(jīng)病理學結(jié)果證實為膠質(zhì)瘤患者；（2）初診患者，做PET/CT 之前未接受過其他治療。排除標準：（1）患有其他重大疾病無法配合完成檢查的患者；（2）有幽閉恐懼癥等PET/CT 檢查禁忌癥的患者。

1.2 組織病理學分析

按照標準程序取部分腫瘤樣品固定在10%福爾馬林中，并包埋在石蠟中。每一份腫瘤樣品都進行蘇木精-伊紅染色，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）國際腫瘤組織學分類確定腫瘤分級。

1.3 基因組DNA 提取

腫瘤標本取出后立即放入液氮中冷凍并儲存在–80℃冰箱中。參照DNeasy Blood and Tissue 試劑盒（美國Qiagen 公司）說明書的步驟提取基因組DNA。

1.4 MGMT 基因甲基化分析

按照文獻[11]中的焦磷酸測序法來分析、確定MGMT 基因的甲基化狀態(tài)。根據(jù)說明書提示的步驟，使用EZ DNA Methylation-Gold 試劑盒（美國Zymo Research 公司）對從腫瘤組織中提取的DNA進行亞硫酸氫鹽修飾。使用PyroMark PCR 試劑盒（美國Qiagen 公司）將亞硫酸氫鹽修飾的DNA 用于PCR；PCR 的陰性對照組則用水代替模板DNA。將MGMT 基因的PCR 條件設(shè)定為95℃15 min；45 個循環(huán)，95℃持續(xù)20 s，53℃持續(xù)20 s，72℃持續(xù)20 s，在72℃下維持5 min，最后儲存在4℃條件下。將PCR 產(chǎn)物固定在珠子上并進行鏈分離。使用PyroMark CpG MGMT 試劑盒（美國Qiagen 公司）中提供的測序引物在PyroMark Q96ID 焦磷酸測序儀（美國Qiagen 公司）上進行焦磷酸甲基化測序。使用PyroMark CpG MGMT 試劑盒檢測MGMT基因外顯子1 上的5 個CpG 位點的甲基化水平；將未緊臨鳥嘌呤的胞嘧啶作為完成亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的內(nèi)部對照，記錄下每個CpG 位點的甲基化百分比（胞嘧啶的含量百分比）。甲基化高于任何單個CpG 島的10%或5 個CpG 島平均值的樣品視為陽性（甲基化組）；甲基化低于10%的樣品視為陰性（未甲基化組）。

1.5 18F-FDG PET/CT 檢查

18F-FDG PET/CT 檢查在手術(shù)前7 d 內(nèi)進行；患者禁食至少6 h。所有檢查均使用德國西門子公司 的Siemens Biograph 64 TruePoint PET/CT 掃 描儀，檢查前患者安靜休息約30 min，經(jīng)肘靜脈注射3.7 MBq/kg 的18F-FDG（由中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心核醫(yī)學科18F-FDG 自動化合成模塊合成，放射化學純度＞95%），繼續(xù)安靜休息40 min后，使用512×512 矩陣以螺旋模式進行CT 采集（管電壓120 kV、管電流110 mAs）。以三維模式進行PET 全身掃描（從下頜骨至股骨上部），頭部采集1 個床位，采集時間4 min。后行PET 顯像，采用迭代重建算法（迭代3 次，每次21 個子集），層厚5 mm。再使用CT 對PET 圖像進行衰減校正。經(jīng)CT 衰減校正后獲得橫斷面、矢狀面和冠狀面的PET/CT 圖像。

1.6 圖像分析

使用專用的圖像后處理軟件Multiparametric Analysis（德國西門子醫(yī)療系統(tǒng)有限公司）進行圖像分析。由2 位核醫(yī)學科醫(yī)師（1 位具有10 年神經(jīng)疾病診斷經(jīng)驗，另1 位具有3 年紋理特征分析經(jīng)驗）根據(jù)PET/CT 圖像手動勾畫腫瘤的感興趣體積（volume of interest，VOI）進行紋理分析。通過分析基于VOI 的信號強度直方圖，該軟件可提供圖像的一階紋理特征，包括排除了最小5%和最大5%體素的平均標準化攝取值（mean standardized uptake value，SUVmean）、Percentile 5th、Percentile 95th、Skewness、Kurtosis、DiffEntropy、DiffVariance、Contrast 和Entropy。此外，通過軟件也可計算常規(guī)參數(shù)，如全部體素的SUVmean、SUVmax、代謝腫瘤體積（metabolic tumor volume，MTV）、糖酵解總量（total lesion glycolysis，TLG）和皮質(zhì)TNR。為了計算正常的SUV 攝取，手動在PET 圖像上對腫瘤病變對側(cè)的頂葉皮質(zhì)繪制感興趣環(huán)形區(qū)域[5,12]。

1.7 統(tǒng)計學分析

使用SPSS23.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的定量指標用均數(shù)±標準差表示。若方差齊，定量變量均值的比較采用兩獨立樣本t檢驗；若方差不齊，則采用Levene檢驗。所有P值均設(shè)置為雙側(cè)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

17 例患者中，2 例（11.8%）經(jīng)組織病理學結(jié)果證實為WHO 國際腫瘤組織學分類Ⅰ級、1 例（5.9%）為Ⅲ級、14 例（82.4%）為Ⅳ級膠質(zhì)瘤。9 例（52.9%）患者的MGMT 基因甲基化（甲基化組）、8 例（47.1%）患者的MGMT 基因未甲基化（未甲基化組）。甲基化組與未甲基化組比較，患者的年齡和腫瘤分級的差異無統(tǒng)計學意義（t=?0.251、?0.016,P=0.806、0.198）；而性別之間的差異有統(tǒng)計學意義（t=?1.426，P=0.031）（表1）。MGMT 基因甲基化組的SUVmax高于MGMT 基因未甲基化組的SUVmax，且差異有統(tǒng)計學意義（t=?3.095，P=0.007）；MGMT 基因甲基化組的TNRmax也高于MGMT 基因未甲基化組，差異有統(tǒng)計學意義（t=?3.402，P=0.004）。18F-FDG PET/CT 圖像的常規(guī)半定量指標、直方圖特征及紋理特征間的差異均無統(tǒng)計學意義（表1）。典型病例的PET/CT 圖像見圖1，MGMT基因甲基化組與未甲基化組膠質(zhì)瘤患者18F-FDG PET 圖像的SUVmax和TNRmax比較見圖2。

3 討論

在本研究中，我們通過對18F-FDG PET/CT 圖像的紋理研究分析了MGMT 基因甲基化狀態(tài)與膠質(zhì)瘤代謝特征之間的關(guān)系，同時發(fā)現(xiàn)18F-FDG 攝取與MGMT 基因甲基化狀態(tài)存在顯著相關(guān)性，其中SUVmax和TNRmax可用于區(qū)分MGMT 基因甲基化組和未甲基化組。通過手動勾畫VOI 及對側(cè)正常頂葉的圓形ROI 計算TNR 的方法客觀性較差，且僅僅靠半定量指標評定18F-FDG 代謝與MGMT 基因甲基化狀態(tài)有關(guān)，說服力較低。因此，本研究采用了基于放射組學的分析方法，探討更多與MGMT基因甲基化狀態(tài)相關(guān)的直方圖特征及紋理特征，以求定量精準化，同時探索這些圖像特征可否為解釋復雜的膠質(zhì)瘤生物學行為明晰方向。

表1 17 例膠質(zhì)瘤患者的臨床特征及18F-FDG PET/CT 圖像特征（±s）Table 1 Clinical and 18F-FDG PET/CT imaging characteristics of 17 glioma patients ( ±s)

表1 17 例膠質(zhì)瘤患者的臨床特征及18F-FDG PET/CT 圖像特征（±s）Table 1 Clinical and 18F-FDG PET/CT imaging characteristics of 17 glioma patients ( ±s)

注：表中，F(xiàn)DG：氟脫氧葡萄糖；PET/CT：正電子發(fā)射斷層顯像計算機體層攝影術(shù)；MGMT：O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶；TNRmax：最大腫瘤與正常組織攝取率；TNRmean：平均腫瘤與正常組織攝取率；Percentile 5t、Percentile 95th、Skewness、Kurtosis 為圖像的直方圖特征參數(shù)；DiffEntropy、DiffVariance、Contrast、Entropy 為圖像的紋理特征參數(shù)

MGMT基因未甲基化組（n=8） MGMT基因甲基化組（n=9） t值 P值臨床指標 年齡（歲） 45.7±19.6 47.9±16.3 ?0.251 0.806 性別（男∶女，例） 8∶0 5∶4 ?1.426 0.031 腫瘤級別（Ⅰ∶Ⅱ∶Ⅲ∶Ⅳ，例） 2∶0∶0∶6 0∶0∶1∶8 ?0.016 0.198圖像的常規(guī)特征 最大標準化攝取值 9.66±4.13 18.83±7.77 ?3.095 0.007 平均標準化攝取值 4.83±2.19 6.20±2.98 ?1.088 0.294 代謝腫瘤體積 39.71±62.87 49.34±77.73 ?0.282 0.782 糖酵解總量 123.41±179.85 216.06±250.27 ?0.884 0.390 TNRmax 1.20±0.52 2.37±0.87 ?3.402 0.004 TNRmean 0.61±0.27 0.77±0.34 ?1.044 0.313圖像的直方圖特征 中位標準化攝取值 4.66±2.11 6.03±2.98 ?1.098 0.289 Percentile 5th 3.00±1.73 2.57±1.10 0.599 0.558 Percentile 95th 7.20±3.12 10.41±5.29 ?1.548 0.142 Skewness 0.52±0.32 0.50±0.63 0.081 0.937 Kurtosis 0.25±1.27 0.49±2.91 ?0.224 0.826圖像的紋理特征 DiffEntropy 0.93±0.37 0.96±0.50 ?0.161 0.874 DiffVariance 0.27±0.16 0.42±0.46 ?0.879 0.404 Contrast 0.84±0.51 1.58±2.12 ?0.956 0.368 Entropy 1.76±0.72 1.81±0.73 ?0.159 0.876

與能體現(xiàn)代謝特征的常規(guī)半定量指標TNR 等相比，基于放射組學的紋理特征分析因能在短時間內(nèi)獲取、分析大量信息，在腫瘤學，特別是神經(jīng)腫瘤學研究領(lǐng)域中的優(yōu)勢日益突出[13]?；诖?，幾項研究利用PET 顯像，綜合了腫瘤的代謝學和形態(tài)學特征來評估WHO Ⅱ級膠質(zhì)瘤患者的異檸檬酸脫氫酶基因突變狀態(tài)[14-15]。此外，O-（2-[18F]氟乙基）-L 的酪氨酸PET 圖像的紋理分析也已應(yīng)用于臨床膠質(zhì)瘤分級、高級別膠質(zhì)瘤的假性進展鑒定以及放療導致的腦轉(zhuǎn)移復發(fā)改變等多個方面[16]。

有研究結(jié)果顯示，腫瘤中高18F-FDG 攝取與MGMT 基因甲基化有關(guān)，且高18F-FDG 攝取的膠質(zhì)瘤患者預后不良[11]，而MGMT 基因甲基化與良好預后呈正相關(guān)[17]。這種悖論一種可能的解釋是18F-FDG 攝取與患者對化療藥物的耐藥程度呈負相關(guān)，類似之前研究報道的肺癌、胃腸道間質(zhì)瘤等[18]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，18F-FDG 是腫瘤耐藥表型的底物，所以其攝取與P-糖蛋白表達的耐藥表型相關(guān)[19]，再者，與患者對TMZ 治療反應(yīng)相關(guān)的MGMT 基因甲基化狀態(tài)在組織病理學上伴有多耐藥亞型[20]，因此，那些抗藥性亞型可能影響到不同MGMT 基因甲基化狀態(tài)的患者對分子探針攝取的模式。另一方面，與甲基化類型相比，MGMT基因未甲基化類型往往具有更廣泛的壞死區(qū)[12]，這也可能是未甲基化組中18F-FDG 攝取較低的原因。由于腫瘤代謝是一種復雜的生物學行為，這些涉及耐藥性的表型可能與MGMT 基因甲基化狀態(tài)的不同導致不同的18F-FDG 攝取有關(guān)。因此，為了找出獨立的預后成像參數(shù)和分子標志物，前瞻性隊列研究的多變量分析勢在必行。

圖1 不同MGMT 基因甲基化狀態(tài)的膠質(zhì)瘤患者（病例1，圖A～E，男性MGMT 基因未甲基化患者，41 歲；病例2，圖F～J，男性MGMT 基因甲基化患者，24 歲）的18F-FDG PET/CT 圖及紋理分析圖圖中，A、F：18F-FDG PET 圖；B、G：CT 圖；C、H：18F-FDG PET/CT 融合圖；D、I：18F-FDG PET/CT 圖的VOI；E、J：基于18F-FDG PET/CT 圖的VOI 紋理分析。病例1 的SUVmax 和TNRmax 分別為9.1 和0.8，病例2 的SUVmax 和TNRmax 分別為20.4 和3.8。MGMT：O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶；FDG：氟脫氧葡萄糖；PET：正電子發(fā)射斷層顯像術(shù)；CT：計算機體層攝影術(shù)；VOI：感興趣體積；SUVmax：最大標準化攝取值；TNRmax：最大腫瘤與正常組織攝取率Fig. 1 18F-FDG PET/CT and representative images of MGMT unmethylated glioma (case 1, male, aged 41, glioblastoma: A–E) and MGMT methylated glioma (case 2, male, aged 24, glioblastoma: F–J)

圖2 MGMT 基因甲基化組和未甲基化組膠質(zhì)瘤患者18F-FDG PET 圖像的SUVmax 和TNRmax 比較 圖中，a：與MGMT 基因未甲基化組相比，MGMT 基因甲基化組的SUVmax 和TNRmax 均更高，兩組之間的差異有統(tǒng)計學意義（t=?3.095， P=0.007；t=?3.402，P=0.004）。MGMT：O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶；SUVmax：最大標準化攝取值；TNRmax：最大腫瘤與正常組織攝取率；FDG：氟脫氧葡萄糖；PET：正電子發(fā)射斷層顯像術(shù)Fig. 2 Comparison of SUVmax and TNRmax in 18F-FDG PET images of patients with glioma in MGMT methylation group and unmethylation group

我們通過18F-FDG PET/CT 圖像的紋理分析對MGMT 基因甲基化狀態(tài)和膠質(zhì)瘤的生物學行為、顯像特征之間的關(guān)系進行了深度研究。研究結(jié)果表明，18F-FDG 攝取在MGMT 基因甲基化組和未甲基化組之間存在顯著差異，而18F-FDG PET/CT 圖像的SUVmax和TNRmax可能成為評估MGMT 基因甲基化狀態(tài)的關(guān)鍵指標。但本研究有兩點局限性。首先，受制于18F-FDG PET/CT 圖像腦部本底較高，本研究的樣本量較小，不足以降低分析過程中產(chǎn)生的選擇偏倚。鑒于治療方法的個體化差異和樣本數(shù)量有限，我們沒有采用ROC 曲線來分析鑒別效能或評估患者的生存率。本課題組下一步將采用對照良好的前瞻性設(shè)計，盡可能納入個體差異較小的患者來做進一步研究。其次，由于PET 圖像的空間分辨率低，本研究僅基于強度-體積直方圖分析了一些一階紋理特征。因此，未來需要更大的隊列研究來進一步有效地分析基于其他探針的多模態(tài)影像（如11C-MET PET/MR 等）的紋理特征與MGMT基因甲基化的相關(guān)性。

利益沖突 本研究由署名作者按以下貢獻聲明獨立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻聲明 寧靜負責數(shù)據(jù)的收集和分析、論文的撰寫；于鵬負責協(xié)助數(shù)據(jù)的分析；劉家金負責患者檢查的技術(shù)操作；黨浩丹負責部分數(shù)據(jù)的收集和分析；徐白萱負責指導論文的撰寫。