胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠肺損傷的保護(hù) 作用及機(jī)制

李帥，黃啟林，王冰，原小惠，孫紅玉,3*，湯禮軍*

1西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，成都 610031；2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院全軍普外科中心/四川省胰腺損傷與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610083；3西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，成都 610083

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是一種由胰腺局部病變誘發(fā)機(jī)體瀑布式炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的炎癥性疾病，發(fā)病急、病情重、病死率高[1]。 急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是SAP最為常見(jiàn)的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致SAP高病死率的主要原因之一[2]。 SAP時(shí)，機(jī)體免疫失衡所致的級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)是引發(fā)ALI的重要原因，其中肺巨噬細(xì)胞極化失衡在ALI發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[3]，然而現(xiàn)有的治療策略不能有效糾正機(jī)體免疫失衡。因此，尋找可重塑機(jī)體免疫平衡的治療策略對(duì)減輕SAP相關(guān)性肺損傷具有重要意義。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有較強(qiáng)的抗炎與免疫調(diào)節(jié)能力，被廣泛應(yīng)用于炎癥性疾病的治療與研究。近年來(lái)，通過(guò)MSCs調(diào)控炎癥微環(huán)境中巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)以減輕組織炎性損傷已成為研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，骨髓與臍帶來(lái)源的MSCs可有效減輕急性胰腺炎大鼠的胰腺損傷和全身炎癥反應(yīng)[4-7]， 但目前關(guān)于胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(placental-derived mesenchymal stem cells，P-MSCs)與SAP大鼠肺損傷的研究鮮少報(bào)道。本研究旨在探討外源性P-MSCs移植對(duì)SAP大鼠肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 MSCs無(wú)血清培養(yǎng)基購(gòu)自友康恒業(yè)生物科技(北京)有限公司；?；悄懰徕c購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；白介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、淀粉酶、脂肪酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；髓過(guò)氧化物酶(MPO)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；One-step SYBR PrimerScript RT-PCR Kit Ⅱ購(gòu)自日本TaKaRa公司；小鼠抗大鼠抗體CD68購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；兔抗大鼠抗體CD163和iNOS購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。動(dòng)物麻醉機(jī)及異氟烷購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 P-MSCs的分離培養(yǎng) P-MSCs由本課題組前期研究分離培養(yǎng)所得[8]，選取第3～5代細(xì)胞用于本研究。

1.2.2 動(dòng)物分組及SAP大鼠模型制備 SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠36只，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體重200～240 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、SAP組與P-MSCs組，每組12只，給予12 h晝夜交替光照。采用4%?；悄懰徕c膽胰管逆行注射法構(gòu)建SAP大鼠模型。大鼠術(shù)前12 h禁水，術(shù)后禁食，自由飲水。對(duì)照組大鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，開(kāi)腹翻動(dòng)胰腺數(shù)次然后關(guān)閉腹腔，術(shù)后6 h經(jīng)尾靜脈注射1 ml PBS溶液。SAP組大鼠麻醉后開(kāi)腹，采用微量注射泵經(jīng)膽胰管注入4%?；悄懰徕c(0.1 ml/100 g)，術(shù)后6 h經(jīng)尾靜脈注射1 ml PBS溶液制備SAP大鼠模型。P-MSCs組大鼠造模結(jié)束后6 h，經(jīng)尾靜脈注射P-MSCs(1×106個(gè)/100 g，2×106個(gè)/ml)。所有大鼠在P-MSCs輸注后12 h和24 h處死，收集血清、胰腺組織及肺組織備用。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定。

1.2.3 肺濕干重比測(cè)定 取部分右肺組織，用濾紙將表面水分沾干后稱量濕重，然后置于60 ℃恒溫烤箱中烘烤72 h，稱量干重，計(jì)算肺濕干重比。

1.2.4 支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本處理及檢測(cè) 取出左肺后，將灌洗針插入氣管，用生理鹽水反復(fù)灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液，離心，用200 μl PBS重懸。取10 μl細(xì)胞懸液滴在蓋玻片上，行Wright-Giemsa染色。顯微鏡下隨機(jī)選擇8個(gè)100倍視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。

1.2.5 胰腺組織與肺組織病理學(xué)觀察及病理評(píng)分 取胰腺組織與肺組織，用4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色，顯微鏡下觀察胰腺組織及肺組織的病理學(xué)變化。依據(jù)Schmidt等[9]報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)胰腺水腫、腺泡細(xì)胞壞死、出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等進(jìn)行評(píng)分，計(jì)算10個(gè)獨(dú)立視野，取平均分作為每張胰腺切片的最終評(píng)分。參照Shen等[10]報(bào)道的肺組織損傷病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)肺臟水腫、肺泡細(xì)胞破壞、肺泡間隙增寬、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)行評(píng)分，計(jì)算10個(gè)獨(dú)立視野，取平均分作為每張肺臟切片的最終評(píng)分。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)血清炎性因子、淀粉酶、脂肪酶濃度 采用ELISA法檢測(cè)血清炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10)、淀粉酶、脂肪酶濃度，每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)3次，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(OD)值。

1.2.7 胰腺組織及肺組織中M P O 活性測(cè)定 取-80 ℃凍存的肺組織及胰腺組織，超聲波勻漿，離心收集上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，測(cè)定胰腺組織及肺組織中MPO的活性。

1.2.8 RT-qPCR檢測(cè)肺組織中IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)水平 稱取相同重量的肺組織，用Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-qPCR檢測(cè)肺組織中IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)水平。IL-1β、TNF-α、GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.9 免疫熒光染色觀察肺巨噬細(xì)胞極化表型的變化 肺組織石蠟切片脫蠟、抗原修復(fù)、封閉、一抗[小鼠抗大鼠抗體CD68(1:500)、兔抗大鼠抗體iNOS與CD163(1:1000)]孵育、二抗[山羊抗兔與山羊抗小鼠(1:500)]孵育、DAPI復(fù)染核，顯微鏡下觀察M1型巨噬細(xì)胞(CD68+iNOS+)與M2型巨噬細(xì)胞(CD68+CD163+)浸潤(rùn)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，方差齊時(shí)，多組間比較采用兩因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，多組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis檢驗(yàn))，進(jìn)一步兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 P-MSCs可有效減輕SAP大鼠胰腺病理?yè)p傷 HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組胰腺組織形態(tài)未見(jiàn)明顯異常；SAP組可見(jiàn)胰腺間質(zhì)水腫，腺泡細(xì)胞壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與紅細(xì)胞滲出；與SAP組比較，P-MSCs組胰腺損傷明顯減輕，僅部分胰腺水腫，腺泡細(xì)胞少量壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與紅細(xì)胞滲出減少(圖1A)。

胰腺組織病理評(píng)分結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SAP組胰腺水腫、腺泡細(xì)胞壞死、出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與SAP組比較，P-MSCs組胰腺水腫、腺泡細(xì)胞壞死、出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖1B-E)。

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SAP組血清淀粉酶與脂肪酶濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與SAP組比較，P-MSCs組血清淀粉酶與脂肪酶濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖1F、G)。MPO活性測(cè)定結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SAP組胰腺組織中MPO活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與SAP組比較，P-MSCs組胰腺組織中MPO活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖1H)。

2.2 P-MSCs可有效減輕SAP大鼠肺組織病理?yè)p傷 HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)明顯形態(tài)學(xué)變化；SAP組大鼠肺組織可見(jiàn)明顯的形態(tài)學(xué)異常，如大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間隔明顯增寬、嚴(yán)重的間質(zhì)水腫等；而P-MSCs組大鼠肺組織損傷嚴(yán)重程度較SAP組明顯減輕，僅見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫與肺泡間隔增寬均顯著改善(圖2A)。

肺組織病理評(píng)分結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SAP組肺組織病理評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與SAP組比較，P-MSCs組肺組織病理評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001， 圖2B)。

圖1 重癥急性胰腺炎大鼠胰腺病理?yè)p傷嚴(yán)重程度評(píng)估Fig.1 Severity assessment of pancreatic pathological injury of rats with severe acute pancreatitis

2.3 P-MSCs可有效減輕SAP大鼠肺組織局部炎癥反應(yīng) 肺濕干重比測(cè)定結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SAP組大鼠肺濕干重比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與SAP組比較，P-MSCs組大鼠肺濕干重比明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001， 圖3A)。MPO活性測(cè)定結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SAP組大鼠肺組織MPO活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與SAP組比較，P-MSCs組大鼠肺組織MPO活性明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖3B)。肺泡灌洗液中有核細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SAP組中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞與巨噬細(xì)胞數(shù)均明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與SAP組比較，P-MSCs組中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞與巨噬細(xì)胞數(shù)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖3C、D、E)。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SAP組肺組織中TNF-α、 IL-1β mRNA的表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與SAP組比較，P-MSCs組肺組織中TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖3F、G)。

2.4 P-MSCs可有效減輕SAP大鼠全身炎癥反應(yīng) ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SAP組大鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6與TNF-α水平明顯升高，抗炎因子IL-10水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與SAP組比較，P-MSCs組大鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6與TNF-α水平明顯降低，抗炎因子IL-10水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖4)。

2.5 P-MSCs可調(diào)控肺巨噬細(xì)胞M1型向M2型極化 免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SAP組肺組織中大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，且高表達(dá)iNOS，低表達(dá)CD163(P<0.001，圖5)，表明在SAP發(fā)生過(guò)程中，肺巨噬細(xì)胞發(fā)生了明顯的M1極化。與SAP組比較，P-MSCs組肺組織中iNOS表達(dá)明顯降低，CD163表達(dá)明顯升高(P<0.001，圖5)，表明P-MSCs在SAP大鼠的治療中可有效誘導(dǎo)肺巨噬細(xì)胞向M2型極化。

3 討 論

近年來(lái)大量研究表明，MSCs可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用來(lái)減輕組織炎性損傷，加速組織修復(fù)，進(jìn)而發(fā)揮治療作用[11-13]。然而，目前關(guān)于MSCs與SAP相關(guān)性肺損傷的報(bào)道較少，且主要集中于骨髓源性MSCs(bone marrow-derived MSCs，BM-MSCs)對(duì)SAP相關(guān)肺損傷的治療作用，而關(guān)于P-MSCs與SAP相關(guān)肺損傷的研究鮮見(jiàn)報(bào)道[14-15]。相較于BM-MSCs，P-MSCs的分離過(guò)程具有較高的細(xì)胞獲得率和較低的病毒污染率。此外，P-MSCs具有更強(qiáng)的增殖能力和免疫調(diào)節(jié)能力[16-17]。因此，本研究探討P-MSCs在SAP大鼠肺損傷治療中的有效性。

圖4 各組重癥急性胰腺炎大鼠血清炎性因子水平比較Fig.4 Comparison of levels of serum inflammatory factors in each group of rats with severe acute pancreatitis

圖5 各組重癥急性胰腺炎大鼠肺組織中巨噬細(xì)胞極化表型比較Fig.5 Comparison of polarization phenotype of macrophages in lung tissues of rats with severe acute pancreatitis

本研究結(jié)果顯示，相比SAP組，P-MSCs組胰腺水腫、出血、腺泡細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，血清淀粉酶與脂肪酶濃度明顯降低，肺水腫、肺泡細(xì)胞破壞、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，肺濕干重比明顯降低，支氣管肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞與巨噬細(xì)胞數(shù)明顯減少，肺組織中TNF-α、 IL-1β mRNA的表達(dá)水平明顯降低，表明P-MSCs可有效減輕胰腺組織與肺組織的病理?yè)p傷及炎癥反應(yīng)，有利于組織修復(fù)。

MPO為中性粒細(xì)胞特有的還原酶，主要存在于細(xì)胞的嗜天青顆粒中，其活性可反映組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況。本研究結(jié)果顯示，相比SAP組，P-MSCs組肺組織中MPO活性明顯降低，表明P-MSCs可減輕SAP大鼠肺組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，有利于促進(jìn)炎癥消退。

除肺損傷外，SAP還伴有嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)。若評(píng)估P-MSCs對(duì)大鼠SAP相關(guān)性肺損傷的治療效果，必須同時(shí)評(píng)估其對(duì)全身炎癥反應(yīng)的影響。全身炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度常通過(guò)測(cè)定血清中促炎因子與抗炎因子水平來(lái)間接反映。本研究結(jié)果顯示，相比SAP組，P-MSCs組大鼠血清中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低，抗炎因子IL-10水平明顯升高，表明P-MSCs可有效減輕SAP大鼠的全身炎癥反應(yīng)。

巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的可塑性，可根據(jù)局部微環(huán)境的變化調(diào)整表型以適應(yīng)其功能特性，在SAP的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[18]。在炎癥初期，巨噬細(xì)胞感受到炎性因子的刺激后主要表現(xiàn)為M1型，通過(guò)分泌大量IL-1、TNF-α等促炎因子參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展。而M2巨噬細(xì)胞可分泌IL-4、IL-10及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等抗炎因子，抑制過(guò)度活化的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)[19]。因此，如果能在炎癥初期調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，誘導(dǎo)其向M2型極化，或許可有效減輕組織的炎性損傷。

大量研究證實(shí)，肺巨噬細(xì)胞在SAP相關(guān)性肺損傷中發(fā)揮著極其重要的作用，因此探討P-MSCs移植對(duì)SAP大鼠肺巨噬細(xì)胞極化的影響具有重要意義。本研究免疫熒光染色結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，SAP組大鼠肺組織中有大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，且高表達(dá)iNOS，低表達(dá)CD163；相比SAP組，P-MSCs組大鼠肺組織中iNOS表達(dá)明顯降低，CD163表達(dá)明顯升高，提示P-MSCs可有效誘導(dǎo)SAP大鼠肺巨噬細(xì)胞向M2型極化。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，P-MSCs可有效減輕SAP大鼠肺組織的炎性損傷，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)肺巨噬細(xì)胞向M2型極化有關(guān)，但P-MSCs調(diào)控肺巨噬細(xì)胞向M2型極化的具體路徑尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。