釀酒酵母酚類(lèi)抑制物耐受性脂質(zhì)組學(xué)研究

顧翰琦 邵玲智 劉冉 劉曉光 李玲 劉倩 李潔 張雅麗

（1. 河北民族師范學(xué)院生物與食品科學(xué)系，承德 067000；2. 河北琢酒集團(tuán)有限公司，承德 067600）

木質(zhì)纖維素具有環(huán)境友好性和可再生性的特點(diǎn)，是纖維素乙醇最具發(fā)展?jié)摿Φ纳a(chǎn)原料［1］。但在利用木質(zhì)纖維素原料之前需要進(jìn)行預(yù)處理破壞其復(fù)雜致密的結(jié)構(gòu)［2］。在預(yù)處理過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生酚類(lèi)、呋喃類(lèi)和有機(jī)弱酸類(lèi)毒性物質(zhì)，這對(duì)微生物細(xì)胞活性以及乙醇發(fā)酵具有很大的抑制作用。其中酚類(lèi)物質(zhì)的毒性最強(qiáng)，特別是酚酸抑制物種類(lèi)多、濃度高，對(duì)纖維素乙醇生產(chǎn)過(guò)程產(chǎn)生嚴(yán)重影響［3］。因此有必要篩選或構(gòu)建酚酸耐受性釀酒酵母，并對(duì)其耐受機(jī)制進(jìn)行研究。

為應(yīng)對(duì)木質(zhì)纖維素預(yù)處理衍生抑制物的毒害作用，已有研究通過(guò)脫毒法、基因工程改造和適應(yīng)進(jìn)化等策略提高酵母細(xì)胞對(duì)抑制物的耐受性［4-5］。其中，適應(yīng)進(jìn)化方法是在無(wú)需相關(guān)遺傳信息和分子作用機(jī)制的背景下，通過(guò)定向的適應(yīng)和篩選能夠有效獲得耐受菌株的策略［6］。其具有能夠在較短的時(shí)間內(nèi)有效定向的改變菌株的某些表型或者生理特性并且基本不會(huì)影響目的表型以外的其他優(yōu)良性狀的優(yōu)點(diǎn)。在前期研究中已經(jīng)通過(guò)適應(yīng)進(jìn)化策略構(gòu)建了酚酸耐受性酵母菌株，并且發(fā)現(xiàn)適應(yīng)進(jìn)化菌株在酚酸脅迫下能表現(xiàn)良好的細(xì)胞膜完整性［7］，但是其耐受性提高的作用機(jī)制尚不明確。

細(xì)胞膜作為細(xì)胞與外界環(huán)境的屏障，對(duì)于維持細(xì)胞膜內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)、控制物質(zhì)進(jìn)入、信息傳遞及能量流動(dòng)都有著重要作用［8］。在工業(yè)微生物抗逆性研究方面，已有大量研究從酵母細(xì)胞質(zhì)膜組分代謝和調(diào)控應(yīng)答、細(xì)胞膜信號(hào)途徑、質(zhì)膜抗逆基因等方面揭示酵母細(xì)胞質(zhì)膜抗逆應(yīng)答機(jī)制［9］。當(dāng)外界環(huán)境中存在抑制物、高滲、低滲、pH等脅迫因素時(shí)，首先對(duì)細(xì)胞膜造成嚴(yán)重的破壞。研究發(fā)現(xiàn)木質(zhì)纖維素衍生的酚酸化合物對(duì)發(fā)酵微生物抑制作用主要因其具有疏水性芳香環(huán)，從而容易進(jìn)入細(xì)胞膜并破壞膜的完整性［7，10］。鞏林林等［11］研究發(fā)現(xiàn)乙腈會(huì)溶解細(xì)胞膜表面脂質(zhì)，增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性，導(dǎo)致酵母細(xì)胞膜部分出現(xiàn)裂痕，從而增加致死率。郭紅等［12］研究表明極端高糖產(chǎn)生的高滲脅迫下通過(guò)干預(yù)脂肪酸的組成和含量影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性和滲透性，從而提高細(xì)胞對(duì)高滲的耐受性。其他多項(xiàng)研究表明脂肪酸飽和度和?；L(zhǎng)度的變化可以維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性，提高酵母細(xì)胞對(duì)乙醇的耐受性［8］。Tian等［13］研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)降低細(xì)胞中飽和脂肪酸和短鏈脂肪酸含量，同時(shí)提高麥角固醇含量能夠抵御環(huán)境脅迫。上述研究說(shuō)明壓力脅迫下細(xì)胞膜的性質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)組成變化對(duì)微生物抗逆性起到非常重要作用。

磷脂、甾醇和鞘脂作為酵母細(xì)胞膜的主要組成成分，對(duì)于維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能有重要作用。脂質(zhì)組學(xué)研究方法作為代謝組學(xué)的一個(gè)分支主要對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝物進(jìn)行檢測(cè)、鑒定和系統(tǒng)的比較分析。本研究在適應(yīng)進(jìn)化構(gòu)建酚酸耐受性釀酒酵母的基礎(chǔ)上，通過(guò)脂質(zhì)組學(xué)分析方法對(duì)酚酸脅迫下野生型和適應(yīng)進(jìn)化型菌株的脂質(zhì)成分進(jìn)行系統(tǒng)分析。主要從細(xì)胞膜磷脂的種類(lèi)分布及其脂酰鏈結(jié)構(gòu)變化等方面進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法篩選酚酸耐受性酵母的顯著差異的磷脂成分。為細(xì)胞膜工程改造理性構(gòu)建抗逆性菌株提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），購(gòu)自安琪酵母股份有限公司。以其作為原始菌株經(jīng)過(guò)混合酚酸適應(yīng)進(jìn)化得到耐受性菌株S. cerevisiaePAT01（能耐受導(dǎo)致酵母細(xì)胞產(chǎn)生50%生長(zhǎng)抑制的酚酸濃度），保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)CGMCC No.18021。

1.1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純（德國(guó)Merck公司）；甲酸、L-2-氯-苯丙氨酸為色譜純（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；香草酸、對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸為分析純（上海阿拉丁化工有限公司）；Yeast Extract為生物試劑（英國(guó)Oxoid公司）；其他試劑均為分析純，購(gòu)自天津科密歐化學(xué)試劑公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖、2 g/L K2HPO4、1 g/L MgSO4、1 g/L（NH4）2SO4、10 g/L Yeast Extract溶于水后121℃高壓滅菌20 min。混合酚酸培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基中加入適量香草酸、對(duì)羥基苯甲酸和丁香酸溶于二甲基亞砜的母液，使培養(yǎng)基中最終濃度分別1.44 g/L、0.87 g/L和0.72 g/L。PBS緩沖液：8.00 g/L NaCl，0.20 g/L KCl，1.42 g/L Na2HPO4，0.24 g /L KH2PO4，pH7.4。

1.2 方法

1.2.1 酵母細(xì)胞培養(yǎng)收集 將釀酒酵母野生型菌株WT和適應(yīng)進(jìn)化菌株P(guān)AT01分別在20 mL合成培養(yǎng)基中活化18 h，取適量菌液調(diào)節(jié)菌體密度至600 nm吸光值（OD600）為7-8，以10%（V/V）接種量轉(zhuǎn)接至混合酚酸培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 h后收集菌體。2 mL菌液與等體積預(yù)冷的60%（V/V）甲醇溶液混合［10］，4427×g，4oC離心10 min，棄上清。稱(chēng)取菌體沉淀（濕重）不少于200 mg，-80oC保存?zhèn)溆谩⒖枷嚓P(guān)脂質(zhì)組學(xué)研究［14-15］，確定每種菌株制備3個(gè)平行樣品。

1.2.2 細(xì)胞脂質(zhì)提取 稱(chēng)取酵母細(xì)胞樣品200 mg，加入甲醇溶液（含5 μg/mL L-2-氯-苯丙氨酸作為內(nèi)標(biāo)）300 μL，在50 Hz條件下勻漿2 min，冰水浴超聲20 min。在4℃，11167×g離心10 min，最后取200 μL上清液待測(cè)。

1.2.3 液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析 使用Agilent 1290 Infinity和Agilent 6545 UHD Accurate-Mass Q-TOF系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）進(jìn)行LC-MS分析。液相色譜條件：色譜柱為Waters XSelect HSS T3（2.5 μm，100 mm×2.1 mm）（美國(guó)Waters公司），柱溫35oC，流動(dòng)相A為0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸的乙腈溶液，流速350 μL/min，梯度 洗 脫：0-2 min，5% B；2-10 min，5%-95% B；10-15 min，95% B；15-18 min，95%-5% B， 進(jìn)樣量2 μL；質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓為3.5 kV，干燥氣體流速10 L/min，溫度325℃，噴霧器壓力為20 psig。正、負(fù)離子模式下質(zhì)譜的掃描范圍分別為100-3000 m/z和100-1700 m/z。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 LC-MS數(shù)據(jù)處理：將LC-MS檢測(cè)的原始數(shù)據(jù)通過(guò)Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.08.00軟件（美國(guó)Agilent公司）轉(zhuǎn)換成mz.data格式。然后使用XCMS 3.2.0程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行峰識(shí)別、保留時(shí)間校正、峰匹配等操作，得到包含m/z、RT和樣品特征信號(hào)強(qiáng)度匹配信息的.csv格式數(shù)據(jù)包。將數(shù)據(jù)包通過(guò)LipidFinder在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得樣品脂質(zhì)信息，然后對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行內(nèi)標(biāo)歸一化處理。最后通過(guò)正交偏最小二乘判別分析（OPLSDA）方法篩選WT和PAT01兩酵母菌株顯著性差異脂質(zhì)分子。

2 結(jié)果

2.1 酵母細(xì)胞主要脂質(zhì)成分分析

脂質(zhì)分子是細(xì)胞膜的酵母細(xì)胞膜組成成分，不同種類(lèi)脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)存在明顯差異直接影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。因此，通過(guò)LC-MS方法對(duì)釀酒酵母WT和PAT01兩菌株脂質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步分析適應(yīng)進(jìn)化酵母對(duì)酚酸耐受性的分子機(jī)制。結(jié)果如圖1所示，同一菌株的平行樣品在正、負(fù)離子模式總離子流譜圖中的色譜峰信號(hào)強(qiáng)度和保留時(shí)間均表現(xiàn)良好的重現(xiàn)性。而兩菌株在特定保留時(shí)間區(qū)域的峰信號(hào)強(qiáng)度存在明顯差異。這說(shuō)明檢測(cè)系統(tǒng)穩(wěn)定，所得數(shù)據(jù)可靠，而且兩菌株脂質(zhì)成分含量存在差異。進(jìn)一步對(duì)兩菌株脂質(zhì)成分進(jìn)行鑒定和統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖2所示。WT和PAT01菌株在正、負(fù)離子模式下共檢測(cè)到565種脂質(zhì)分子，所有脂質(zhì)分子共涉及21種亞類(lèi)，分別歸屬于甾醇（Ste、C24-Pr-S、Sec、Stigma、Ste-con、Erg、Other-ST），鞘脂（Cho、Sul、Other-SP、N-GLS、Cer、PSL、Sph、GM）和磷脂（PA、PC、PE、PG、PI、PS）三大類(lèi)脂質(zhì)。其中，磷脂的種類(lèi)最多，占總脂質(zhì)種類(lèi)的80%以上，這與酵母細(xì)胞膜中磷脂含量基本一致［16］。

2.2 酵母細(xì)胞膜磷脂組成分析

磷脂雙分子層作為細(xì)胞膜的基本支架，磷脂的親水頭部基團(tuán)種類(lèi)和疏水尾脂酰鏈的長(zhǎng)度與飽和度等對(duì)細(xì)胞膜的性質(zhì)和功能起決定作用［17］。因此，進(jìn)一步從以上3個(gè)方面對(duì)WT和PAT01菌株細(xì)胞膜磷脂分布進(jìn)行比較分析。主要包括：磷脂酸（PA）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰絲氨酸（PS）。結(jié)果如圖3所示，不同頭部基團(tuán)種類(lèi)的磷脂分布方面，WT菌株中PE、PG和PS相對(duì)含量較高，含量分別超過(guò)20%，而酚酸耐受的進(jìn)化菌株P(guān)AT01中相對(duì)含量最高的磷脂分別為PE、PC和PI，比WT中相應(yīng)磷脂增加1.8、3.8和2.22倍（圖3-a）。根據(jù)脂酰鏈不飽和鍵數(shù)量對(duì)磷脂分布統(tǒng)計(jì)，WT菌株中含飽和脂酰鏈、一個(gè)不飽和鍵和兩個(gè)不飽和鍵脂酰鏈的磷脂含量分布相對(duì)平均，相對(duì)含量均在30-40%。而適應(yīng)進(jìn)化菌株P(guān)AT01中含兩個(gè)不飽和鍵的磷脂含量明顯增加，占總磷脂含量的70%以上（圖3-b）。進(jìn)一步根據(jù)磷脂脂酰鏈碳的原子數(shù)量統(tǒng)計(jì)含有不同脂酰鏈長(zhǎng)度的磷脂分布，WT菌株磷脂脂酰鏈長(zhǎng)度主要分布在C28、C32、C34和C36，另外少量分布在超長(zhǎng)鏈C40以上，其中C28的磷脂含量最高。而PAT01菌株集中分布在含C32、C34和C36的磷脂組分，大部分由C16、C18和C20的長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸構(gòu)成（圖3-c）。結(jié)果表明，適應(yīng)進(jìn)化酵母細(xì)胞膜磷脂發(fā)生了明顯的重塑現(xiàn)象。

2.3 顯著性差異磷脂成分分析

利用正交偏最小二乘判別對(duì)WT和PAT01菌株的脂質(zhì)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（OPLS-DA），篩選對(duì)適應(yīng)進(jìn)化菌株酚酸耐受性起重要作用的顯著差異磷脂標(biāo)志物。結(jié)果如圖4所示，OPLS-DA得分結(jié)果表明WT和PAT01菌株組間具有明顯的分離趨勢(shì)，x軸第一主成分t［1］反映了組間差異最大化，y軸to［1］正交主成分表現(xiàn)出兩組數(shù)據(jù)的組內(nèi)變異情況（圖4-a-b）。Permutation檢驗(yàn)圖用于反映模型的可靠性，其中R2代表模型解釋率，Q2代表模型預(yù)測(cè)率，數(shù)值越大說(shuō)明模型具有更好的解釋和預(yù)測(cè)能力。正離子模式下兩組累積R2Y=0.99，Q2=0.82；負(fù)離子模式累積R2Y=1.00，Q2=0.90（圖4-c-d）。該模型的S-plot圖中，分布在右上角和左下角離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的點(diǎn)表明對(duì)組間差異的貢獻(xiàn)度越大，模型得到的變量權(quán)重值（VIP）也越大，這些點(diǎn)代表WT和PAT01兩菌細(xì)胞中存在顯著差異的脂質(zhì)分子（圖4-e-f）。

圖1 酚酸脅迫下釀酒酵母脂質(zhì)成分LC-MS分析總離子流圖（TIC）

圖2 酚酸抑制物作用下釀酒酵母脂質(zhì)種類(lèi)分布

圖3 酚酸脅迫下酵母菌株細(xì)胞膜磷脂相對(duì)含量分布

圖4 酚酸適應(yīng)進(jìn)化菌株脂質(zhì)正負(fù)離子模式下OPLS-DA模型分析

根據(jù)OPLS-DA模型的VIP值（≥1），并結(jié)合獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)P值（＜0.05）以及差異倍數(shù)（FC＞2或＜0.5）作為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步篩選WT與PAT01菌株之間的顯著性差異脂質(zhì)代謝物［18］。FC代表兩菌株中不同磷脂分子相對(duì)含量的比值，以2為底取對(duì)數(shù)得到log2FC，可以直觀判斷不同磷脂分子相對(duì)含量的變化情況，log2FC＞0，表示磷脂相對(duì)含量增加，反之降低［19］。結(jié)果如表1所示，兩菌株顯著性差異變化的磷脂種類(lèi)主要集中在PC和PE。PAT01菌株相比WT菌株，PC類(lèi)中含有短脂酰鏈、飽和脂酰鏈的磷脂分子，以及只含有單個(gè)脂酰鏈的溶血磷脂酰膽堿（LPC）相對(duì)含量減少（LPC 4：0、LPC 5：0、LPC 14：0），而PC和PE含有長(zhǎng)鏈和不飽和脂酰鏈的磷脂相對(duì)含量增加（PC 34：2、PC 35：2、PC 36：1、PC 36：2、PE 34：2、PE 36：2、PE 40：2）。這與上述磷脂組成分布統(tǒng)計(jì)結(jié)果一致，說(shuō)明適應(yīng)進(jìn)化菌株P(guān)AT01對(duì)酚酸耐受性提高可能是由于細(xì)胞膜磷脂重塑導(dǎo)致，特別是PC和PE磷脂分子結(jié)構(gòu)和分布變化起重要作用。

表1 PAT01/WT顯著性差異磷脂分子

3 討論

木質(zhì)素降解產(chǎn)生酚酸化合物對(duì)發(fā)酵微生物抑制作用機(jī)制主要表現(xiàn)在其疏水性芳香環(huán)能夠進(jìn)入細(xì)胞膜并破壞其完整性，同時(shí)酚酸進(jìn)入細(xì)胞后解離釋放質(zhì)子，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外泄、ROS增加、pH紊亂及嚴(yán)重的細(xì)胞自噬等。我們前期研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)酚酸適應(yīng)進(jìn)化的釀酒酵母菌株P(guān)AT01與初始菌株WT相比，在酚酸作用下能夠保持更高的細(xì)胞膜完整性和較低的滲透性。細(xì)胞膜的這些性質(zhì)與其磷脂成分的頭部親水基團(tuán)種類(lèi)和尾部脂酰鏈結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。本研究通過(guò)脂質(zhì)組學(xué)分析方法對(duì)釀酒酵母細(xì)胞膜磷脂成分進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)酚酸有耐受性的進(jìn)化菌株磷脂種類(lèi)分布和脂酰鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，其顯著性差異的磷脂分子主要是PC和PE類(lèi)含長(zhǎng)鏈不飽和脂酰鏈的磷脂分子。首先，進(jìn)化菌株P(guān)AT01與WT菌株相比，PE、PC和PI相對(duì)含量增加。PC和PE是細(xì)胞膜中主要的磷脂成分，說(shuō)明進(jìn)化菌株P(guān)AT01在酚酸作用下仍能保持相對(duì)正常的細(xì)胞膜組分，而WT菌株則可能由于細(xì)胞膜被破壞導(dǎo)致磷脂成分分布發(fā)生明顯變化。PE和PC合成代謝之間存在密切聯(lián)系，PE主要在線粒體中合成，部分運(yùn)送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)過(guò)連續(xù)甲基化轉(zhuǎn)化為PC，因此PE的含量直接影響PC的合成。酵母細(xì)胞PC和PE相對(duì)含量對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜曲率、維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定方面起重要作用。PE由于頭部乙醇胺基團(tuán)很小呈圓錐形，自由組裝成膜時(shí)容易形成負(fù)向彎曲，而PC頭部基團(tuán)為帶有3個(gè)甲基乙醇胺基團(tuán)，相對(duì)較大，與脂酰鏈形成圓柱形，趨于形成平行的雙層膜。因此，兩種磷脂的分布比例能夠有效調(diào)節(jié)膜的曲率和橫向應(yīng)力，從而保持膜穩(wěn)定［17］。已有研究表明，釀酒酵母在含有木質(zhì)纖維素衍生抑制物乙酸、糠醛和苯酚壓力脅迫下，PE/PC比例明顯增加，有效提高了細(xì)胞膜完整性并降低了細(xì)胞膜通透性，從而提高酵母對(duì)抑制物的耐受性［20］。另外，真核細(xì)胞中PE是調(diào)節(jié)細(xì)胞膜流動(dòng)性的關(guān)鍵因素，PE的頭部基團(tuán)能夠與附近磷脂分子的氨基頭部基團(tuán)和磷酸殘基形成氫鍵，因此PE含量增加能夠有效提高膜穩(wěn)定性和剛性［17，21-22］，這有助于提高膜對(duì)外界毒性分子的屏蔽作用。已有研究報(bào)道，釀酒酵母在含有高濃度鎘、鋅、鐵或鋁離子的環(huán)境中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞磷脂含量明顯增加，其中PE含量增加最顯著，從而維持細(xì)胞膜穩(wěn)態(tài)［23-24］。此外，由于磷脂頭部基團(tuán)所帶電荷不同，PC和PE均屬于兩性離子類(lèi)磷脂，而其余PA、PG、PI和PS都屬于陰離子類(lèi)磷脂，細(xì)胞膜中陰離子類(lèi)與兩性離子類(lèi)磷脂的比例對(duì)膜電勢(shì)又調(diào)控作用，增加膜電勢(shì)有助于細(xì)胞去極化從而使細(xì)胞具有更大的柔韌性，對(duì)環(huán)境壓力不敏感。已有研究報(bào)道，陰離子類(lèi)與兩性離子類(lèi)磷脂的比值下降時(shí)釀酒酵母細(xì)胞對(duì)鹽離子表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受能力［25］。此外，另一種含量明顯增加的磷脂PI與細(xì)胞活性有關(guān)，在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)功能等方面起重要作用［13］。PI相對(duì)含量增加有助于提高釀酒酵母對(duì)木質(zhì)纖維素預(yù)處理抑制物耐受性。已有研究表明，含有長(zhǎng)脂酰鏈的PI對(duì)提高細(xì)胞膜流動(dòng)性和降低滲透性有重要作用［20］。通過(guò)補(bǔ)充PI的生物合成前體物質(zhì)肌醇能夠有效改善釀酒酵母對(duì)木質(zhì)纖維素衍生抑制物耐受性［26］。

另一方面，磷脂尾部脂酰鏈結(jié)構(gòu)對(duì)膜的性質(zhì)功能同樣起到重要作用。已有大量研究通過(guò)基因工程改造調(diào)控細(xì)胞膜的飽和與不飽和脂肪酸比例或降低短鏈脂肪酸含量等策略應(yīng)對(duì)細(xì)胞膜損傷問(wèn)題［27］。飽和脂酰鏈在生理溫度下趨于形成不流動(dòng)緊密結(jié)合的凝膠狀態(tài)，而不飽和脂酰鏈?zhǔn)鼓ぞ哂辛鲃?dòng)性［28］。有研究證明增加不飽和脂肪酸含量不僅能提高釀酒酵母對(duì)辛酸的耐受性而且減輕膜滲漏［29］。通過(guò)過(guò)表達(dá)脂肪酸去飽和酶（ELO1和OLE1）能夠有效提高油酸含量，增加膜穩(wěn)定性，進(jìn)一步提高酵母對(duì)乙酸的耐受性［30-31］。脂酰鏈的長(zhǎng)度與磷脂雙分子層的厚度呈正相關(guān)，細(xì)胞膜厚度增加從而增加外界有毒物質(zhì)跨膜的行程和阻力，從而降低膜的通透性。有研究通過(guò)在釀酒酵母細(xì)胞過(guò)表達(dá)脂酰鏈酰基延長(zhǎng)酶能夠提高硬脂酸和油酸含量以及平均鏈長(zhǎng)度，從而使其細(xì)胞膜完整性增強(qiáng)［27］。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)釀酒酵母野生型菌株WT與酚酸耐受性適應(yīng)進(jìn)化菌株P(guān)AT01進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PE、PC和PI相對(duì)含量明顯增加，含有長(zhǎng)鏈脂酰鏈的磷脂成分以及含有兩個(gè)不飽和脂酰鏈的磷脂成分相對(duì)增加。據(jù)此推斷適應(yīng)進(jìn)化酵母菌株對(duì)酚酸耐受性提高的機(jī)制在于細(xì)胞膜發(fā)生磷脂成分重塑，有效提高細(xì)胞膜完整性，使細(xì)胞膜在酚酸壓力脅迫下仍能保持穩(wěn)態(tài)，從而對(duì)酚酸抑制物起到選擇性屏障作用。