基于液相PNA-FISH 技術(shù)的單增李斯特菌檢測方法研究

楊 彤，李 可，葉子弘，吳 姍，張曉峰*，帥江冰*

（1.中國計量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計量與檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州 310018；2.浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州 310016）

單核細(xì)胞增生李斯特菌（簡稱單增李斯特菌）（Listeria monocytogenes）廣泛存在于自然界中，該菌在4 ℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，且對酸性、堿性條件都有極強的適應(yīng)能力。單增李斯特菌同時是一種重要的人獸共患李斯特菌病的病原菌，也是李斯特菌屬中唯一對人致病的病菌，與其他所有人畜共患傳染病相比，李斯特菌病造成的致死率高達(dá)30%以上。單增李斯特菌病已被歐盟監(jiān)測認(rèn)定為最嚴(yán)重的食源性疾病之一，且近年來有顯著的增長趨勢[1-2]?？焖贆z測單增李斯特菌可有效預(yù)防和控制單增李斯特菌疾病的暴發(fā)，目前許多國家都已經(jīng)制定了相應(yīng)的檢驗檢測標(biāo)準(zhǔn)。但傳統(tǒng)檢測方法普遍存在耗時耗力，容易受到雜菌的干擾，或操作技術(shù)要求高，不能同時大批量檢測等問題[3]。因此急需一種可大批量快速檢測單增李斯特菌的方法。

基于液相方法的肽核酸熒光原位雜交（Peptide nucleic acids fluorescence in situ hybridization，PNAFISH）技術(shù)通常在熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀下檢測其熒光信號[4]。吳姍等首次使用熒光掃描技術(shù)，對檢測單增李斯特菌的熒光信號結(jié)果進(jìn)行快速初篩（完成2～3 個熒光波段的96 孔掃描，耗時不超過10 min），提高了檢測速率[5]。在此基礎(chǔ)上本研究根據(jù)酶標(biāo)儀所檢測到的熒光強度與溶液中靶標(biāo)的量成正比的原理，沿用液相熒光掃描技術(shù)及本研究室前期所設(shè)計的特異性肽核酸探針Lm-16S-2 對單增李斯特菌進(jìn)行檢測。液相PNA-FISH 技術(shù)克服了固相方法中洗滌不充分、檢測通量低、顯微鏡通道對不同熒光波段存在交叉的缺陷，同時本研究經(jīng)過重復(fù)性和再現(xiàn)性試驗測定了該方法精密度。該方法為檢測大批量單增李斯特菌樣品提供了一個快速、準(zhǔn)確的可行方案。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料本研究所使用的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌均購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，實驗涉及到的所有分離菌株均來自浙江省檢科院動物檢疫實驗室（表2）；PBS購自生工生物工程（上海）股份有限公司；RNase A酶購自賽默飛世爾科技公司；腦心浸出液BHI、李氏增菌肉湯LB1、LB2購自、PALCAM 瓊脂平板、NA平板均購自北京陸橋生物技術(shù)股份公司；李斯特菌顯色培養(yǎng)基購自CHROMagarMT法國科瑪嘉。本研究中Bacuni 探針是細(xì)菌通用型探針，作為陽性對照，序列為5'-CTGCCTCCCGTAGGA-3'[4]；Lm-16S-2 探針是本研究室針對單增李斯特菌16S rRNA 基因片段設(shè)計的特異性探針，序列為5'-TAGTACAAAGGGTCG-3'；所用探針5'均由韓國Daejeon 公司進(jìn)行FAM 熒光基團(tuán)標(biāo)記（494 nm～522 nm）并合成。28 份家禽組織樣品由浙江省檢科院動物檢疫實驗室提供，用于后續(xù)單增李斯特菌檢測。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)及液相PNA-FISH 雜交細(xì)菌在36 ℃，180 r/min 條件下振蕩過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長期，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)GB4789.2-2016[6]計算菌懸液的初始濃度。參照文獻(xiàn)[5,7]對本研究中Bacuni、Lm-16S-2 兩種探針均采用如下相同的雜交步驟：8 000 r/min 離心5 min 后棄培養(yǎng)基溶液，用PBS 懸浮洗滌菌體后再用80%的酒精加PBS 固定重懸1 h，取1 mL 菌懸液，8 000 r/min 離心5 min，棄固定液，加入500 μL雜交緩沖液[pH 8.0，10 mmol/L NaCl，300 pmol/mL PNA 探針，7.77%（w/v）硫酸葡聚糖，5.6%（v/v）甲酰胺，0.2%（v/v）Triton X-100；50 mmol/L Tris/HCl]，60 ℃作用58 min，8 000 r/min 離心5 min 后棄雜交緩沖液，加入1 mL 預(yù)熱的洗滌緩沖液（pH 9.0，10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA），60 ℃溫浴20 min，8 000 r/min 離心5 min，棄洗滌緩沖液，重復(fù)洗滌1 次，加入220 μL 洗滌緩沖液重懸。設(shè)置以細(xì)菌通用型探針Bacuni 為陽性對照；用相同體積不含PNA探針的雜交緩沖液代替重懸，為測定背景本底值，命名為陰性對照N1；加入雜交緩沖液前用40 μg/mL RNase 重懸裂解，水解RNA 磷酸二酯鍵，從而破壞靶向結(jié)合序列而不能與探針結(jié)合，測定PNA 探針雜交的目標(biāo)位點，命名為陰性對照N2。取200 μL 重懸的菌液加入96 孔板中，采用SpectraMax M5 微孔板檢測系統(tǒng)，激發(fā)光波長設(shè)置為494 nm，發(fā)射光波長設(shè)置為522 nm，進(jìn)行熒光檢測。對每個熒光掃描的樣品均用熒光顯微鏡100 倍物鏡及L5 通道（512 nm～542 nm）觀察確證，顯微鏡下具有明顯發(fā)光的菌體且符合目標(biāo)菌形態(tài)學(xué)特點即判定為陽性[8-10]。

1.3 細(xì)菌固定條件的優(yōu)化在細(xì)菌雜交前固定步驟中通常使用4%多聚甲醛對細(xì)菌形態(tài)進(jìn)行固定，為避免多聚甲醛對實驗人員健康的危害，本研究擬采用80%酒精加PBS（方法二）代替50%酒精加4%多聚甲醛（方法一）固定滲透細(xì)菌的方式，試驗測定兩種雜交前處理方法對雜交熒光強度的影響，采用F 檢驗和t 檢驗比較二者是否存在顯著性差異。

具體試驗方法為：選取單增李斯特菌ATCC 10890 株為目標(biāo)菌，利用方法一和方法二分別測定1.2 中該菌初始菌懸液和分別稀釋2 倍、3 倍、5倍、10 倍雜交后的熒光值，每個濃度樣品平行測定6 次，計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，同時按照1.2 中的方法設(shè)置陰性對照N1 和陽性對照實驗。

1.4 液相PNA-FISH 方法特異性試驗通過對17株單增李斯特菌、8 株非單增李斯特菌與14 株非李斯特菌（表2）測定液相PNA-FISH 方法的特異性。雜交體系按照課題組前期優(yōu)化好的方案進(jìn)行試驗（見1.2），所有細(xì)菌分別與特異性探針、細(xì)菌通用探針進(jìn)行雜交，比較兩種探針熒光強度差異，共測定5次，計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，同時設(shè)定N1、N2 兩組陰性對照實驗，試驗結(jié)果與國標(biāo)中（GB 4789.30-2016[11]）細(xì)菌生化鑒定法進(jìn)行比較。

1.5 液相PNA-FISH 方法敏感性試驗根據(jù)上述1.2 中所得初始菌液濃度結(jié)果，10 倍系列稀釋（101cfu/mL～108cfu/mL），分別取102cfu/mL、103cfu/mL、104cfu/mL 和105cfu/mL 濃度的單增李斯特菌1 μL，于李斯特菌顯色培養(yǎng)基上劃線接種（36 ℃，20 h），觀察其生長情況，測定方法敏感性。再取單增李斯特菌特征性單菌落于NA 培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)（36 ℃，24 h），取NA 培養(yǎng)基上新鮮菌落進(jìn)行液相PNAFISH 結(jié)合Lm-16S-2 探針方法和生化鑒定法[11]的單增李斯特菌檢測。

1.6 重復(fù)性試驗利用上述液相PNA-FISH 方法在短時間內(nèi)對同一單增李斯特菌樣品進(jìn)行20 次重復(fù)檢測，評價其批內(nèi)、批間的重復(fù)性。批內(nèi)重復(fù)性試驗將同一單增李斯特菌樣品分成數(shù)份，平行測定20次；批間重復(fù)性試驗將同一單增李斯特菌樣品分成20 份，每天測定1 份，連續(xù)測20 d。本試驗分別對8 種單增李斯特菌（1：單增李斯特菌Listeria monocy?togenes ATCC 10890，2：單增李斯特菌Listeria mono?cytogenes ATCC 19118，3：單增李斯特菌Listeria monocytogenes ATCC 19112，4：單增李斯特菌Liste?ria monocytogenes CMCC（B）54002，5：單增李斯特菌Listeria monocytogenes CMCC（B）54003，6：單增李斯特菌Listeria monocytogenes CMCC（B）54006，7：單增李斯特菌Listeria monocytogenes CMCC（B）54007，8：單增李斯特菌Listeria monocytogenes NCTC 5348）進(jìn)行雜交熒光值重復(fù)性測定，對所得數(shù)據(jù)經(jīng)分析處理，得到該方法批內(nèi)、批間的變異系數(shù)。

1.7 再現(xiàn)性試驗更換不同實驗室及操作人員，在1.3 中的5 個濃度單增李斯特菌菌液中挑選前4 個樣品進(jìn)行雜交后熒光值檢測，每個樣品做6 個平行，計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，同時按照1.2 中的方法設(shè)定陰性對照N1 和陽性對照。

1.8 家禽組織樣品的檢測將28 份家禽組織樣品按照國標(biāo)方法[11]增菌分離培養(yǎng)后，取NA 平板培養(yǎng)基上經(jīng)過純化的單增李斯特菌，利用液相PNAFISH 結(jié)合Lm-16S-2 探針方法和生化鑒定方法檢測樣品中的單增李斯特菌，比較2 種方法的檢測結(jié)果，并計算該方法同生化鑒定法的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌固定條件的優(yōu)化結(jié)果通過對平板計數(shù)法計算得到單增李斯特菌ATCC 10890 菌液原始濃度為6.2×109cfu/mL。對5 個不同濃度的單增李斯特菌樣品分別采用80%酒精加PBS 和50%酒精加4%多聚甲醛兩種雜交前細(xì)菌固定方式，檢測熒光強度（圖1）。結(jié)果顯示，隨著菌液濃度降低，陽性對照探針組與特異性探針組的雜交熒光值均隨之降低且兩種探針間無明顯差異。兩種細(xì)菌固定方法間的F 檢驗和t 檢驗均通過SPSS 統(tǒng)計軟件實現(xiàn)，結(jié)果顯示，5 個不同濃度單增李斯特菌樣品F 檢驗的p 值均大于0.05，兩種固定方法對每個濃度菌液雜交熒光值均呈現(xiàn)方差齊性，離散程度低，不存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著性差異，可靠性達(dá)95%，可進(jìn)行t 檢驗；對單增李斯特菌原液、稀釋2 倍、稀釋3 倍、稀釋5倍、稀釋10 倍4 個濃度樣品t 檢驗，兩種固定方法對原濃度菌液稀釋直至5 倍時的熒光檢測結(jié)果均在95%置信區(qū)間內(nèi)，不存在顯著性差異（p＞0.05），而濃度稀釋10 倍的單增李斯特菌樣品p 值為0.024，小于0.05，該濃度下兩種固定方法存在顯著性差異（表1）。其原因可能是由于稀釋倍數(shù)過高，菌量不足以達(dá)到儀器檢出水平。以上實驗結(jié)果表明，不同單增李斯特菌樣品經(jīng)過增菌處理，當(dāng)用于雜交的菌量大于109cfu 時可采用80%酒精加PBS 的雜交前處理方法，減少多聚甲醛的使用及其對實驗人員造成的健康危害。

圖1 兩種雜交前處理方法檢測結(jié)果Fig. 1 The results of two pre-hybridization methods

表1 兩種細(xì)菌固定處理結(jié)果的假設(shè)檢驗Table 1 Hypothesis testing of two pre-hybridization treatments

2.2 液相PNA-FISH 方法特異性試驗結(jié)果利用該方法對目標(biāo)菌與非目標(biāo)菌測定結(jié)果顯示，通用探針與全部細(xì)菌雜交，熒光檢測數(shù)值在300～600 間為陽性；特異性探針Lm-16S-2 與所有單增李斯特菌均雜交，數(shù)值多在200～500 之間，為陽性，在與非單增李斯特菌與非李斯特菌雜交時，特異性探針與之雜交均為陰性（表2），該探針具有高度特異性；統(tǒng)計分析熒光檢測數(shù)值，結(jié)果顯示，各組單增李斯特菌熒光檢測數(shù)值較為均一，且與陽性對照組熒光值無明顯差異，可作為結(jié)果判定依據(jù)；全部細(xì)菌陰性對照N1 的雜交熒光值均較低，數(shù)值小于10，該方法獲得與細(xì)菌生化鑒定法一致的特異性結(jié)果；比較N1、N2 兩組數(shù)據(jù)顯示，RNase 酶對目標(biāo)序列起到消化作用，PNA 探針雜交的靶位點為RNA 序列。上述試驗表明利用Lm-16S-2 探針的雜交熒光值可區(qū)分陰陽性，有效避免了假陽性的結(jié)果，本研究中液相PNA-FISH 方法具有較強的特異性。

2.3 液相PNA-FISH 方法敏感性試驗結(jié)果在10倍系列稀釋的單增李斯特菌菌液，涂板培養(yǎng)后觀察各個平板上菌落生長情況。結(jié)果顯示，102cfu/mL 和103cfu/mL 的增菌液在單增李斯特菌顯色培養(yǎng)基上沒有出現(xiàn)明顯可疑菌落，104cfu/mL 和105cfu/mL 的增菌液出現(xiàn)單增李斯特菌的特征性菌落。利用建立的液相PNA-FISH 方法和生化試驗檢測上述菌液，結(jié)果顯示特征性菌落即為單增李斯特菌。因此，本研究中液相PNA-FISH 方法對單增李斯特菌檢測的敏感性可達(dá)到與國標(biāo)中生化鑒定法相同的水平，即104cfu/mL。表明本研究建立的單增李斯特菌液相PNA-FISH 方法具有較高的敏感性。

2.4 重復(fù)性試驗結(jié)果利用液相PNA-FISH 檢測方法對8 個批次的不同種單增李斯特菌進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測，結(jié)果顯示變異系數(shù)均低于5%（表3），表明該方法具有較好的可重復(fù)性。

表2 液相PNA-FISH 方法的特異性試驗結(jié)果Table 2 Specificity of liquid phase PNA-FISH method evaluated by bacterial species

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 3 Results of repeatability test

2.5 再現(xiàn)性試驗結(jié)果選取4 個濃度的單增李斯特菌樣品，更換實驗室及操作人員后利用建立的液相PNA-FISH 方法檢測，結(jié)果顯示，單增李斯特菌原液樣品熒光值為440.96±17.49（未更換人員時為455.58±16.15），稀釋2 倍的樣品熒光值為229.73±12.25（未更換人員時為234.53±12.30），稀釋3 倍的樣品熒光值為139.67±6.99（未更換人員時為153.88±7.27），稀釋5 倍的樣品熒光值為93.56±8.02（未更換人員時為99.06±7.57），檢測結(jié)果較未經(jīng)更換實驗室及操作人員之前均有下降（圖2），表明不同的操作人員會對檢測結(jié)果造成一定影響，但該方法的檢測結(jié)果一致，穩(wěn)定性較好。

圖2 再現(xiàn)性試驗結(jié)果Fig. 2 Results of reproducibility test

2.6 家禽組織樣品的檢測結(jié)果利用本研究建立的液相PNA-FISH 方法與細(xì)菌生化鑒定法對28 份家禽組織樣品檢測，結(jié)果顯示兩種方法對相同的7 份家禽組織樣品檢測結(jié)果均為陽性，其余21 份家禽組織樣品檢測結(jié)果均為陰性，檢測符合率達(dá)到100%，但是國標(biāo)方法中的生化鑒定過程（動力試驗、過氧化氫酶試驗、糖發(fā)酵試驗、MR-VP 試驗、溶血試驗等）通常需要3 d～5 d，而本研究中的方法僅需要2.5 h，大大縮短檢測時間。因此本方法更有利于單增李斯特菌樣品的快速檢測。

3 討 論

本研究中所用的特異性PNA 探針Lm-16S-2 在基于液相掃描的方法中具有較強的特異性，雜交數(shù)值與陽性對照探針無差異，同時實驗發(fā)現(xiàn)在洗滌步驟中減少菌體的損失也可有效降低對同一單增李斯特菌樣品檢測的標(biāo)準(zhǔn)偏差（結(jié)果未顯示）。近期SAN?TOS 等在對不同類型革蘭氏菌的多因素雜交條件優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，具有較厚的肽聚糖層的細(xì)菌在接近50%（v/v）的甲酰胺濃度下，可獲得更高的熒光強度[12]，這與本研究所使用的濃度差異較大，同時此項研究認(rèn)為不同類型的革蘭氏細(xì)菌的最優(yōu)雜交體系各異，雖然在非最優(yōu)雜交體系下不會改變液相PNA-FISH方法的雜交結(jié)果，但在節(jié)約實驗成本、提高檢測效率的基礎(chǔ)上獲得更高的熒光強度，將是液相PNAFISH 方法研究的方向。

在FISH 技術(shù)固定步驟中常使用固定劑（如多聚甲醛）穩(wěn)定細(xì)胞形態(tài)，同時探針進(jìn)入細(xì)胞的必要條件是細(xì)胞膜的滲透作用，多數(shù)革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌均需要使用滲透劑（如乙醇），對細(xì)胞膜組織結(jié)構(gòu)造成物理損傷，使探針可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，乙醇最佳濃度通常為70%～80%[13]。本研究在細(xì)菌固定步驟未使用多聚甲醛，規(guī)避其對實驗人員造成的健康危害。本研究中細(xì)菌固定方式取得良好效果的主要原因可能在于液相方法的最終判定方式是對細(xì)菌累計的熒光量進(jìn)行判斷，可忽略細(xì)胞形態(tài)造成的影響。

本研究室在前期的液相PNA-FISH 研究中，同樣設(shè)置N1 和N2 兩組空白對照[5]，與本研究方法特異性試驗中N1、N2 數(shù)值結(jié)果相似，N2 值普遍高于N1值，可能是由于RNase 酶對靶序列的消化不徹底。但前期研究中是用測得的熒光值分別減去N1、N2兩組空白值進(jìn)行判定，由于檢測儀器存在本底值，一定程度上造成了假陰性的干擾。本研究在充分洗滌過量探針的前提下降低了N2 的值，并直接使用測定所得熒光值與空白對照數(shù)值的顯著性進(jìn)行判定，具有明顯差異的判定為陽性，因此針對該方法設(shè)定一個熒光值的檢出范圍，對于單增李斯特菌的檢測具有重要意義。本研究建立的液相PNA-FISH方法為批量檢測單增李斯特菌提供了一個快速、可行的新方案。