山羊支原體山羊亞種TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立

林裕勝，江錦秀，張靖鵬，游 偉，胡奇林

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013）

山羊支原體山羊亞種（Mycoplasma capricolum sub?sp. capricolum，Mcc）是引起小反芻動(dòng)物關(guān)節(jié)炎、乳腺炎、角膜炎、敗血癥和呼吸道疾病的病原，同時(shí)也是引起傳染性無乳癥（Contagious agalactia，CA）的主要病原之一[1]。Mcc 能夠感染山羊、綿羊、牛、駱駝和人，感染往往是慢性的，且抗生素治療效果很差[2-3]。在法國[4]、意大利[5]、丹麥[3]、美國[6]等均有Mcc 感染的報(bào)道，成年羊的發(fā)病率為0～20%，哺乳母羊的發(fā)病率為3%～50%，青年羊的發(fā)病率為10%～98%，成年羊的病死率為3%～40%，哺乳母羊的病死率為10%～80%，青年羊的病死率為20%～98%[4]。儲岳峰等于2011 年對我國13 省區(qū)（市）采集的122 份臨床診斷為山羊傳染性胸膜肺炎（Contagious caprine pleuropneumonia，CCPP）或疑似羊支原體性肺炎（Mycoplasma pneumonia of sheep and goats，MPGS）的病料進(jìn)行病原分離和PCR 檢測，首次檢測和分離到1 株Mcc[7]，表明我國羊群中存在Mcc 感染，山羊支原體疾病的病原日趨復(fù)雜，給有效防治CCPP 和MP?GS 帶來了新的挑戰(zhàn)。目前，羊呼吸道疾病和乳腺炎是臨床上影響福建省養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展的主要疾病，這些疾病的頻繁發(fā)生是否與Mcc 有關(guān)？由于未對Mcc 在福建省的感染狀況進(jìn)行調(diào)查，情況不明，因此很有必要開展Mcc 感染的分子流行病學(xué)調(diào)查。此外，由于絲狀支原體山羊亞種（Mycoplasma mycoides subsp.capri，Mmc）、無乳支原體（Mycoplasma agalactiae，M. agalactiae）、腐敗支原體（Mycoplasma putrefaciens，M. putrefaciens）和Mcc 均可引起CA，且臨床癥狀極為相似，因此Mcc 的感染只能通過實(shí)驗(yàn)室檢測后確診[8]。目前國外關(guān)于Mcc 的檢測方法主要有病原的分離鑒定、血清學(xué)方法[9]、PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）[5]、PCR-限制性酶切分析（PCRREA）[10]，但Mcc 對培養(yǎng)基營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)非常困難，培養(yǎng)周期長，且其生長容易被其他支原體所抑制；與同屬支原體在血清學(xué)上的交叉反應(yīng)使血清學(xué)方法不適用于該病的診斷。因此，診斷該病的首選方法是分子生物學(xué)方法。然而常規(guī)PCR 方法存在靈敏度低、假陽性結(jié)果、不能定量等缺點(diǎn)，這些方法均不適用于Mcc 的快速、準(zhǔn)確檢測。因此，建立一種準(zhǔn)確、快速、高通量的Mcc 檢測方法對Mcc 感染的流行病學(xué)調(diào)查、快速診斷和有效防控尤為重要。熒光定量PCR（qPCR）方法具有操作簡便、特異性強(qiáng)、敏感性高且結(jié)果全程可監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)。目前尚無關(guān)于Mcc 熒光定量PCR 檢測方法的報(bào)道，因此本研究根據(jù)MCAP_0033 基因利用軟件設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立Mcc TaqMan 熒光定量PCR（qPCR）方法，以期為Mcc感染的早期快速檢測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料Mcc California Kid 株和山羊支原體山羊肺炎亞種（Mycoplasma capricolum subsp. cap?ripneumoniae，Mccp）F38 株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供；精氨酸支原體（Mycoplasma argi?nine，M. arginini）PG2 株由西南民族大學(xué)提供；大腸桿菌（Escherichia coli，Ec）、巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus au?reus，SA）等由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病研究室提供；綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovi?penunimoae，Mo）、偽結(jié)核棒狀桿菌（Corynebacterium psedotuberculosis，CP）、溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica，Mh）、萊氏無膽甾原體（Acholeplas?ma laidlawii，AL）、牛支原體（Mycoplasma bovis，Mb）及Mmc 均為本研究室分離、鑒定和保存。47 份肺臟組織樣品來自2017 年～2019 年福建省福州市、三明市、南平市和莆田市臨床上疑似羊支原體性肺炎的患羊。組織/細(xì)菌DNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程股份有限公司；Premix Ex TaqTM（Probe PCR）、pMD19-T載體均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)合成根據(jù)GenBank 登錄的Mcc ATCC27343 株的MCAP_0033 基因序列（CP000123.1），利用Beacon Design 7.9 軟件設(shè)計(jì)1 對特異性引物和探針：MccF：5'-GCTAGTTGGAATATATGATAATG-3'/MccR：5'-CCACCTGCTAATCCTAAA-3'。Mcc probe：5'-AATCAACTTCAACATTAGGTCTGCAA-3'。目的片段為101 bp。引物和探針均由福州白鯨生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 參考株和臨床樣品核酸的提取及標(biāo)準(zhǔn)品的制備將約1 g臨床肺臟樣品剪碎后與PBS按照1∶9的比例研磨成組織勻漿液后，反復(fù)凍融3 次，5 000 r/min 離心15 min，取上清用于提取組織DNA。利用試劑盒提取1.1 各菌株和47 份臨床肺臟樣品DNA。本研究是基于Mcc California Kid 模式株建立的Mcc TaqMan qP?CR 方法，因此在提取California Kid 菌株DNA 后，利用NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)測定該DNA 濃度，參照文獻(xiàn)[11-12]換算成拷貝數(shù)，作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品備用。

1.4 MccTaqMan qPCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立按照Premix Ex TaqTM（Probe PCR）試劑盒說明書建立25 μL 反應(yīng)體系：MccF、MccR 引物（10 μmol/L）各0.5 μL，Mcc probe（5 μmol/L）1 μL，模板2 μL，Premix Ex TaqTM（Probe PCR）12.5 μL，去離子水補(bǔ)足至25 μL。以出現(xiàn)最高熒光值及最小的Ct 值作為判斷依據(jù)，分別對退火溫度（50 ℃～65 ℃）、引物濃度（5 μmol/L～10 μmol/L）和探針濃度（5 μmol/L～10 μmol/L）進(jìn)行優(yōu)化。將提取的標(biāo)準(zhǔn)品10 倍倍比稀釋（108拷貝/μL～101拷貝/μL）后作為模板，按照優(yōu)化好的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，試驗(yàn)重復(fù)4 次。反應(yīng)結(jié)束后利用電腦軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 MccTaqMan qPCR 的特異性試驗(yàn)利用1.4 優(yōu)化的反應(yīng)體系和條件分別對Mcc、CP、Mmc、Mo、Ec、Pm、SA、Mccp、M. arginini、Mb、AL、Mh 的核酸進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，以去離子水作空白對照，評估該方法的特異性。

1.6 MccTaqMan qPCR的敏感性試驗(yàn)利用建立的TaqMan qPCR和Cillara等[5]建立的常規(guī)PCR方法分別對10倍倍比稀釋的Mcc DNA（108拷貝/μL～100拷貝/μL）進(jìn)行擴(kuò)增，比較兩種方法的敏感性。

1.7 MccTaqMan qPCR 的重復(fù)性試驗(yàn)將1×108拷貝/μL、1×107拷貝/μL、1×106拷貝/μL和1×105拷貝/μL 4 個(gè)濃度的Mcc DNA 按照1.4 優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行3 次qPCR 檢測，每次設(shè)3 個(gè)重復(fù)，根據(jù)Ct值計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù)；將上述4 個(gè)濃度的Mcc DNA每間隔3 d 進(jìn)行1 次qPCR 檢測，重復(fù)3 次，每次設(shè)3個(gè)重復(fù)，根據(jù)Ct 值計(jì)算出組間變異系數(shù)，對該方法的重復(fù)性進(jìn)行評估。

1.8 臨床樣品檢測以47 份臨床肺臟樣品的DNA為模板，利用建立的TaqMan qPCR 方法擴(kuò)增，設(shè)California Kid 株作為陽性對照。并與Cillara 等[5]建立的常規(guī)PCR 及儲岳峰等[7]建立的支原體分離鑒定方法進(jìn)行比較，并分別計(jì)算本研究建立的方法與這兩種方法的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 MccTaqMan qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果通過對引物和探針濃度以及退火溫度等條件的優(yōu)化，最終確定25 μL 反應(yīng)體系：MccF/MccR 引物（10 μmol/L）各0.5 μL，Mcc probe（5 μmol/L）1 μL，模板2 μL，Pre?mix Ex TaqTM（Probe PCR）12.5 μL，去離子水補(bǔ)足至25 μL。優(yōu)化的反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃10 s；95 ℃5 s，54 ℃10 s，72 ℃20 s，共40 個(gè)循環(huán)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立經(jīng)NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)測定，Mcc DNA 濃度為55.6 ng/μL，換算成拷貝數(shù)為3×1010拷貝/μL。利用優(yōu)化后的反應(yīng)條件對濃度為108拷貝/μL～103拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，Mcc TaqMan qPCR 方法對California Kid 菌株DNA 陽性標(biāo)準(zhǔn)品在1×108拷貝/μL～1×103拷貝/μL 與Ct 值有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.988，擴(kuò)增效率為101%（圖1）。

2.3 MccTaqMan qPCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果利用建立 的TaqMan qPCR 方 法 對Mcc、CP、Mmc、Mo、Ec、Pm、SA、Mccp、M. arginini、Mb、AL、Mh 和ddH2O 進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，除Mcc 能擴(kuò)增出S 型曲線外，其他樣品均未見擴(kuò)增（圖2），表明本研究建立的TaqMan qPCR 方法特異性較強(qiáng)。

圖2 TaqMan qPCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig. 2 Specificity analyses using TaqMan qPCR

2.4 MccTaqMan qPCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果將提取的Mcc California Kid 株DNA 10 倍倍比稀釋成1×108拷貝/μL～1×100拷貝/μL，利用建立的TaqMan qPCR方法檢測，同時(shí)利用常規(guī)PCR 方法進(jìn)行檢測，以比較二者的敏感性。結(jié)果顯示TaqMan qPCR 對Mcc 的檢測限為10 拷貝/μL（圖3），常規(guī)PCR 的檢測限為104拷貝/μL（圖略），TaqMan qPCR 敏感性為常規(guī)PCR 的10 00 倍。表明TaqMan qPCR 敏感性較高。

圖3 TaqMan qPCR 的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig. 3 Sensitivity analyses using TaqMan qPCR

2.5 MccTaqMan qPCR 的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果選取1×108拷貝/μL、1×107拷貝/μL、1×106拷貝/μL 和1×105拷貝/μL 的Mcc DNA 分別進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)。經(jīng)計(jì)算結(jié)果顯示，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2%（表1），表明建立的Mcc TaqMan qPCR 方法具有較好的重復(fù)性及穩(wěn)定性。

2.6 臨床樣品檢測將建立的TaqMan qPCR 方法、常規(guī)PCR 和支原體分離鑒定方法同時(shí)對47 份臨床肺臟樣品進(jìn)行檢測， TaqMan qPCR 方法和常規(guī)PCR 結(jié)果顯示，除Mcc DNA 檢測結(jié)果呈陽性外，臨床樣品均未檢測到Mcc，47 份臨床樣品也均未分離到Mcc。表明福建省尚無Mcc 的流行，但可能也與檢測樣品僅為肺臟組織有一定關(guān)系。

表1 Mcc TaqMan qPCR 的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Reproducibility assay of the TaqMan qPCR assay for detecting Mcc

3 討 論

Mcc 屬于絲狀支原體簇成員之一，絲狀支原體簇是柔膜體綱、支原體目、支原體科、支原體屬下一群遺傳上和血清學(xué)關(guān)系相近的支原體，同屬成員還有Mmc、Mccp、絲狀支原體絲狀亞種小菌落型（Mycoplasma mycoides subsp. mycoides Small Colony，MmmSC）和李奇氏支原體（Mycoplasma leachii，Ml）[13]，由于絲狀支原體簇成員之間同源性較高，Mcc 在血清學(xué)上與同屬其它成員之間存在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致Mcc 檢測方法的研究進(jìn)展緩慢。目前國外實(shí)驗(yàn)室常以支原體的分離培養(yǎng)鑒定和PCR 方法為主，但支原體分離鑒定法存在分離率低，培養(yǎng)時(shí)間長等不足，而常規(guī)PCR 方法存在不能定量且假陽性率高等缺點(diǎn)。因此，亟需建立Mcc 快速準(zhǔn)確的檢測方法，為該病的早期診斷供技術(shù)支持。

TaqMan 探 針 法qPCR 是 利 用Taq 酶 的3'～5'外 切核酸酶活性，切斷探針，從而產(chǎn)生熒光信號。在反應(yīng)過程中由于探針與模板的特異性結(jié)合，因此熒光信號的強(qiáng)弱能夠反映模板的數(shù)量。具有操作簡便、特異性強(qiáng)、敏感性高、反應(yīng)過程可視化等優(yōu)點(diǎn)[12]，已被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)領(lǐng)域研究中。

由于絲狀支原體GC 含量較低且其使用UGA 密碼子編碼色氨酸，很少使用UGG，這就使得支原體的引物設(shè)計(jì)更加困難[14]。本研究通過下載GenBank登錄的Mcc 全基因組序列，利用BLAST 在線軟件比對分析后發(fā)現(xiàn)MCAP_0033 基因僅存在于Mcc 和Mccp基因組中，利用MegAlign 軟件對Mcc 和Mccp 的MCAP_0033 基因進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示兩者核苷酸相似性僅為40.6%，因此本研究最終選擇MCAP_0033 基因作為靶基因設(shè)計(jì)引物。通過一系列條件優(yōu)化，建立了Mcc TaqMan qPCR 方法。構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，相關(guān)系數(shù)為0.988，擴(kuò)增效率為101%，表明該方法準(zhǔn)確性好；該方法僅能擴(kuò)增Mcc，而其他羊常見病原均不能擴(kuò)增，表明本研究建立的該方法特異性強(qiáng)；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于2%，表明該方法穩(wěn)定性好。武昱孜等建立了豬肺炎支原體和豬鼻支原體雙重qPCR 檢測方法，對這兩種病原的最低檢測限均為10 拷貝/μL[15]；李建等建立了牛支原體qPCR 檢測方法，對牛支原體的最低檢測限為10 拷貝/μL，比常規(guī)PCR 敏感性高10倍[16]；Lin 等建立了Mmc qPCR 檢測方法，對Mmc 的最低檢測限為11 拷貝/μL，比常規(guī)PCR 靈敏度高1 000倍[17]。本研究建立的Mcc檢測方法同樣具有較高的敏感性，對Mcc DNA 的最低檢測限為10 拷貝/μL，比常規(guī)PCR 方法敏感性高1 000 倍。

利用本研究建立的Mcc TaqMan qPCR 方法對福建省采集的47 份病羊肺組織樣品進(jìn)行了檢測，并與支原體分離鑒定法和常規(guī)PCR 方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明該方法與支原體分離鑒定法結(jié)果一致，進(jìn)一步證明了該方法的準(zhǔn)確性。本研究臨床樣品中未檢測到Mcc 的原因可能與樣品采集有一定關(guān)系，本研究采集的均為肺臟樣品，而國外研究報(bào)道該病在肺臟中的檢出率和分離率較低，在乳汁和耳道中檢出率高[4,8]，在今后樣品采集過程中應(yīng)當(dāng)注意采樣部位，以提高檢出率。此外，本研究僅利用了1 株國際標(biāo)準(zhǔn)株California Kid 檢測所建TaqMan qPCR 方法的特異性，缺少絲狀支原體簇成員中的MmmSC 和Ml菌株，使得特異性試驗(yàn)不夠完善，但是，本研究在設(shè)計(jì)引物和探針時(shí)，選定的引物和探針序列經(jīng)BLAST在線軟件比對分析后，與Mcc 菌株MCAP_0033 基因序列同源性為100%，與其他羊相關(guān)病原相應(yīng)基因的同源性均低于57.7%，說明本研究設(shè)計(jì)的引物和探針是特異的。今后還要用更多的Mcc、MmmSC 和Ml 菌株來驗(yàn)證該方法的特異性。

本研究首次建立了Mcc TaqMan qPCR 方法，可用于Mcc 的早期檢測，為該病的防控提供技術(shù)支撐，也為今后該病商品化診斷試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。