牛源乳腺致病性大腸桿菌JL05 全基因測(cè)序及毒力和耐藥基因分析

曲星霖，肖 丹，吳 健，馬曉媛，白 翠，王 妍*，王 楠*

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130033；3.吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林 長(zhǎng)春 130062）

乳腺致病性大腸桿菌（Mammary pathogenic E.coli，MPEC）是奶牛乳房?jī)?nèi)感染（Intramammary infection，IMI）的主要病原體，因存在fec 基因座可使細(xì)菌從檸檬酸鹽中捕獲鐵而具有在牛乳腺中定植的能力[1]，其導(dǎo)致的急性乳腺炎不僅影響奶牛產(chǎn)奶量，同時(shí)也影響牛奶品質(zhì)，增加了治療費(fèi)用，給奶牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。為了治療由MPEC 引起的乳腺炎，抗菌藥物被大量使用，導(dǎo)致MPEC 耐藥性不斷增強(qiáng)，出現(xiàn)多重耐藥（Multidrug-resistant organism，MDRO）現(xiàn)象，給公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重威脅。由于MDRO 產(chǎn)生機(jī)制十分復(fù)雜，涉及到細(xì)菌的質(zhì)粒、染色體、轉(zhuǎn)座子、整合子等單個(gè)或多個(gè)耐藥基因的積聚[3]，藥敏試驗(yàn)、PCR、基因芯片、微流體芯片等研究方法已難以滿足細(xì)菌耐藥性研究的要求?；驕y(cè)序技術(shù)的發(fā)展為細(xì)菌耐藥性研究提供了便捷的工具，已成為發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性（SNP）、插入、缺失、倒置和復(fù)雜重組等各種基因變異的終極工具[4]，如鄧雯文等應(yīng)用PacBio平臺(tái)在1 株大熊貓?jiān)粗虏. coli 中發(fā)現(xiàn)了包含耐藥和毒力基因的基因島[5]；陳定強(qiáng)等應(yīng)用Illumina 平臺(tái)在1 株多重耐藥E. coli 的contigs 中發(fā)現(xiàn)了blaCMY-42 基因與ISEcp1 插入序 列、blc 和sug E 等基因相關(guān)聯(lián)[6]。這些研究顯示高通量測(cè)序技術(shù)在細(xì)菌耐藥性研究方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

2015 年～2019 年 本 實(shí) 驗(yàn) 室 從 吉 林 省15 個(gè) 奶 牛場(chǎng)采集的300 份乳樣中分離到60 株E. coli[7]，其中JL05 株的耐藥性最強(qiáng)。為研究JL05 的進(jìn)化分群情況、致病力、耐藥表型和耐藥基因之間的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)采用PCR 法、微量肉湯稀釋法和高通量測(cè)序法對(duì)其進(jìn)化分群、16 種抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC）、fec 基因座、毒力基因、耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)和分析，為進(jìn)一步研究E. coli JL05 的基因組特征、致病力及耐藥傳播機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌 株E. coli JL05 分離自吉林省白城市某奶牛場(chǎng)患乳房炎奶牛的乳樣，經(jīng)OptiRead 微生物生化分析儀鑒定，并在乳內(nèi)感染小鼠模型上進(jìn)行了鑒定。質(zhì)控E. coli 菌株為ATCC25922，由吉林省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2 主要試劑AMPure XP 核酸純化試劑盒購(gòu)自Beckman Coulter 公司；血瓊脂板、CAMHBT 肉湯、CMV3AGNF 革蘭氏陰性藥敏板、GeneJET DNA 提取試劑盒、dsDNA 定量試劑盒、Nuclease-Free Water、SuperFi II Green PCR Master Mix、Ion Xpress Plus 文庫(kù)構(gòu)建試劑盒、Ion Xpress Barcode 文庫(kù)標(biāo)記試劑盒、Ion Library TaqMan 文庫(kù)定量試劑盒、530 OT2 試劑盒及測(cè)序芯片，均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 細(xì)菌基因組提取及定量利用DNA 提取試劑盒提取E. coli JL05 基因組，采用熒光計(jì)測(cè)定提取的DNA 濃度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果用Nuclease-Free Water 調(diào)整DNA 濃度至100 ng/μL。

1.4 進(jìn)化分群鑒定根據(jù)Clermont 等方法對(duì)E. coli JL05進(jìn)行四重PCR檢測(cè)[8]，擴(kuò)增arpA、chuA、TspE4.C2和YjaA 基因，引物序列見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)體系：2×SuperFi II Green PCR Master Mix 25 μL，0.5 μmol/L 的上下游引物各0.5 μL，DNA 模板2 μL，加Nuclease-Free Water 至50 μL。PCR 反 應(yīng) 條 件：98 ℃30 s；98 ℃10 s、60 ℃10 s、72 ℃30 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。擴(kuò)增后在Experion 自動(dòng)電泳系上電泳，判定分群結(jié)果。

1.5 MIC 及耐藥性檢測(cè)根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法的操作方法和標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)8 類(lèi)16 種常用抗菌藥物MIC 值的結(jié)果進(jìn)行判定[9]。將E. coli JL05 接種于血瓊脂板培養(yǎng)基中，36 ℃孵育24 h 后從血瓊脂板中挑取3～5 個(gè)菌落，在CAMHBT 肉湯中乳化并比濁調(diào)整至0.5 McFarland 標(biāo)準(zhǔn)管，隨后接種于CMV3AGNF 革蘭氏陰性藥敏板，36 ℃孵育24 h 后在OptiRead 微生物生化分析儀上讀取MIC 值。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 基因文庫(kù)構(gòu)建利用文庫(kù)構(gòu)建試劑盒將E. coli JL05 基因組DNA 酶切為200 bp～300 bp 的片段，末端修復(fù)及標(biāo)記后純化，根據(jù)測(cè)定的片段長(zhǎng)度及濃度，采用2%的分離膠回收目的片段。回收的目的片段在熒光定量PCR 儀上定量，根據(jù)定量值調(diào)整輸入濃度至25 ng/μL。利用530 OT2 試劑盒進(jìn)行油包水乳化PCR 反應(yīng)，經(jīng)富集后的模板裝載至530 芯片。

1.7 全基因測(cè)序及數(shù)據(jù)處理在Ion Torrent S5 測(cè)序儀上完成測(cè)序。測(cè)序后提取有效Reads 后運(yùn)行Ge?neious Prime 2020.0 軟件進(jìn)行拼接，拼接獲得的Con?tigs 上傳至PATRIC（https://patricbrc.org）數(shù)據(jù)庫(kù)利用Similar Genome Finder 比對(duì)，尋找最接近的參考序列，并以此為模板利用延展法組裝基因，最終形成0 gap 的基因全圖。

1.8 基因組的生物信息學(xué)分析組裝完成的E. coli JL05 全基因及質(zhì)?；蛏蟼髦罭CBI，經(jīng)PGAP 注釋后，檢測(cè)是否存在fec 基因座，并利用VFDB（https://card.mcmaster.ca）和CARD（https://card.mcmaster.ca）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)毒力基因和耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，分析E. coli JL05 耐藥表型和耐藥基因之間的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 進(jìn)化分群結(jié)果以arpA、chuA、TspE4.C2 和YjaA 為目的基因，采用四重PCR 方法檢測(cè)E. coli?JL05 的系統(tǒng)進(jìn)化分群情況。結(jié)果顯示，對(duì)E. coli JL05 僅擴(kuò)增出arpA 和TspE4.C2 目的基因。進(jìn)化分群結(jié)果表明，JL05 屬于E. coli 的B2 群。

2.2 MIC 及耐藥性檢測(cè)結(jié)果采用微量肉湯稀釋法測(cè)定JL05 對(duì)16 種抗菌藥物的MIC，分析其耐藥性。結(jié)果顯示，JL05 對(duì)β-內(nèi)酰胺、頭孢菌素、氨基糖苷、抗葉酸、喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酯、四環(huán)素、苯丙醇類(lèi)等8 類(lèi)14 種抗生素均耐藥，僅對(duì)磺胺異惡唑中介，對(duì)呋喃妥因敏感（表2）。MIC 檢測(cè)結(jié)果表明E. coli JL05 呈多重耐藥，且耐藥性嚴(yán)重。

表2 E. coli JL05 MIC 的測(cè)定結(jié)果Table 2 MIC test of E. coli JL05

2.3 全基因測(cè)序結(jié)果利用Ion Torrent S5 測(cè)序儀對(duì)E. coli JL05 進(jìn)行全基因測(cè)序，共獲得≥Q20 的base 453 198 943 bp，總計(jì)2 028 231 條reads，其中最大讀長(zhǎng)541 bp，最小讀長(zhǎng)20 bp，平均讀長(zhǎng)237 bp。經(jīng)Geneious Prime 拼接后得到總長(zhǎng)4 731 796 bp 的環(huán)狀DNA（GC 含量50.84%）和總長(zhǎng)127 295 bp 的質(zhì)粒基因（GC 含量51.52%）。全基因測(cè)序結(jié)果表明，E. coli JL05 測(cè)序深度達(dá)144 重，滿足基因特征分析要求。

2.4 基因組注釋結(jié)果組裝完成的全基因及質(zhì)?；蛏蟼髦罭CBI，經(jīng)PGAP 進(jìn)行注釋得到E. coli JL05的基因總數(shù)為4 617 個(gè)（CP049936），其中包括4 507個(gè)編碼基因及110 個(gè)非編碼RNA。在非編碼基因中含78 個(gè)tRNA，10 個(gè)ncRNAs，22 個(gè)rRNA（5S，16S，23S）。E. coli JL05 質(zhì)粒pARG01 經(jīng)注釋得到的基因總數(shù)為145 個(gè)（CP049937）。經(jīng)BLAST 比對(duì)，在E. coli JL05 編碼基因中不僅檢索到arpA 和TspE4.C2 基因，還發(fā)現(xiàn)了包含fecI、fecR、fecA、fecB、fecC、fecD、fecE 的fec 基因座，且其上下游存在IS1、IS3 轉(zhuǎn)座酶基因（圖1），證實(shí)E. coli JL05 為MPEC，與前期的乳內(nèi)感染小鼠模型鑒定結(jié)果相符。

圖1 E. coli JL05 fec 基因座Fig. 1 fec locus of E. coli JL05

2.5 毒力基因分析結(jié)果采用VFDB 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)E.coli JL05 全基因組進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，E. coli JL05 攜帶黏附、侵襲、轉(zhuǎn)運(yùn)、鐵攝取、分泌系統(tǒng)、細(xì)菌毒素6 類(lèi)80 個(gè)毒力基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)包括fyuA、irp1、irp2、ybtA、ybtE、ybtP、ybtQ、ybtS、ybtT、ybtU、ybtX 毒力基因在內(nèi)的耶爾森菌強(qiáng)毒力島（HPI），其中包含酪氨酸重組酶（Tyrosine-type recombinase）、tRNA-Asn、tRNA-Ser 基因（圖2）。

圖2 E. coli JL05 中的耶爾森菌強(qiáng)毒力島Fig. 2 Yersinia high pathogenicity island of E. coli JL05

在E. coli JL05 所有的毒力基因中，屬于黏附與侵襲類(lèi)的毒力因子及相關(guān)基因數(shù)量最多, 包括CFA/I菌毛（CFA/I fimbriae）、大腸桿菌層粘蛋白結(jié)合菌毛（E. coli laminin-binding fimbriae，ELF）、大腸桿菌共生菌毛（E. coli common pilus，ECP）、粘附素EaeH、出血性大腸桿菌菌毛（Hemorrhagic E. coli pilus,HCP）、I 型菌毛（Type I fimbriae）、腦內(nèi)皮細(xì)胞侵襲（Invasion of brain endothelial cells，Ibes）7 種29 個(gè)毒力基因；其次是分泌系統(tǒng)中的ACE T6SS 基因，共18 個(gè)；再次為鐵攝取毒力因子，均為耶爾森菌素合成（Yersiniabactin siderophore）基因，共20 個(gè)。VFDB比對(duì)結(jié)果顯示，E. coli JL05 毒力因子的特征與E. coli O104∶H4 str. 2011C-3493 和E. coli VR50 接近（圖3）。

圖3 E. coli VR50、E. coli O104∶H4 str. 2011C-3493與E. coli JL05 毒力因子比較Fig. 3 Comparison of virulence factors of E. coli VR50,E. coli O104∶H4 str. 2011C-3493, and E. coli JL05

2.6 耐藥基因分析結(jié)果利用CARD 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)E.coli JL05 基因組及質(zhì)粒經(jīng)進(jìn)行抗性基因識(shí)別。結(jié)果顯示，E. coli JL05 染色體及質(zhì)粒共有抗生素外排、抗生素失活、抗生素靶點(diǎn)改變、降低對(duì)抗生素的滲透性等4 類(lèi)耐藥機(jī)制的53 個(gè)耐藥基因（表3）。在所有的耐藥基因中，涉及抗生素外排機(jī)制的耐藥基因最多，共42 個(gè)，占79.25%，主要分為耐藥結(jié)節(jié)分化家族（RND）、主要易化子超家族（MFS）、ATP 結(jié)合盒超家族（ABC）。且除acrD、baeR、baeS、emrA、em?rB、emrK、emrR、emrY、mdtA、mdtB、mdtC、mdtG、mdtH、msbA、tet（A）、YojI 基因僅對(duì)單類(lèi)抗菌藥物耐藥外，其他基因均對(duì)多種藥物耐藥。

在E. coli JL05 質(zhì) 粒pARG01 中 發(fā) 現(xiàn)aadA、dfrA17、TEM-1、sul2、APH（3''）-Ib、APH（6）-Id、tet（A）等耐藥基因高度集中在同一區(qū)域，且在這一區(qū)域中存在IS6、intI 等重組酶、轉(zhuǎn)座子及整合子基因（圖4）。

表3 E. coli JL05 耐藥基因分析結(jié)果Table 3 Resistance gene analysis results of E. coli JL05

圖4 質(zhì)粒pARG01 部分耐藥基因分布Fig. 4 Distribution of some of the resistance genes in plasmid pARG01

在所有僅對(duì)單類(lèi)抗菌藥物耐藥的基因中，以氨基糖苷類(lèi)耐藥基因（AAC（3）-IId、aadA、APH（3''）-Ib、APH（6）-Id、acrD、baeR、baeS、cpxA、kdpE、mdtA、mdtB、mdtC）最多，其次是氟喹諾酮類(lèi)耐藥基因（mdtH、emrB、emrR、emrA、gyrA）、肽類(lèi)耐藥基因（bacA、eptA、pmrF、YojI、ugd）、頭孢菌素類(lèi)耐藥基因（ampC、ampC1、ampH、PBP3）、核苷類(lèi)耐藥基因（mdtN、mdtO、mdtP）、抗四環(huán)素類(lèi)耐藥基因（emrK、emrY、tetA）、 磷 霉 素 耐 藥 基 因（mdtG、GlpT）、依法菌素耐藥基因（EF-Tu）、硝基咪唑耐藥基因（msbA）、二氨基嘧啶類(lèi)耐藥基因（dfrA17）、β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因（TEM-1）、葉酸類(lèi)耐藥基因（sul2）。耐藥基因分析結(jié)果表明，E. coli JL05 攜帶的耐藥基因所代表的耐藥性與耐藥表型基本一致。

3 討 論

根據(jù)臨床感染情況，E. coli 可分為共生性、腸道致病性和腸道外致病性3 個(gè)類(lèi)型，按照arpA、ch?uA、TspE4.C2 和YjaA 基因分為A、B1、B2、D 共4個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化群[8]。腸外致病性大腸桿菌（Extraintesti?nal pathogenic E. coli，ExPEC）是一類(lèi)能引起腸道以外器官疾病的病原菌，其特點(diǎn)是攜帶的一些特別的毒力基因使該菌能夠侵入宿主的非消化道器官定植并誘導(dǎo)疾病的產(chǎn)生[10]，大多數(shù)ExPEC 屬于B2 和D群[11]。作為ExPEC 的一種，MPEC 的致病機(jī)制近年來(lái)逐漸被發(fā)現(xiàn)，Shlomo 等證實(shí)了由fecI、fecR、fe?cA、fecB、fecC、fecD、fecE 組 成 的fec 基 因 座 是MPEC 的核心及特征，其高度表達(dá)可使MPEC 從檸檬酸鹽中捕獲鐵，是E. coli 在牛乳腺定植所必需的[1]，其致病的解剖學(xué)部位和致病嚴(yán)重程度與其攜帶的毒力因子（Virulencefactor，VF）的種類(lèi)和數(shù)量有關(guān)[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，E. coli JL05 屬B2 群，且存在完整的fec 基因座，其毒力基因以黏附（29/80）、鐵攝?。?0/80）、分泌系統(tǒng)（18/80）3 類(lèi)毒力因子為主，其中黏附毒力因子與細(xì)菌的定植有關(guān)，鐵攝取毒力因子與ExPEC 的侵襲、內(nèi)化和系統(tǒng)感染有關(guān)，分泌系統(tǒng)毒力因子對(duì)毒力調(diào)控發(fā)揮作用。

在ExPEC 中，HPI 基因被認(rèn)為是強(qiáng)毒株的特征之一，其相對(duì)不穩(wěn)定性與其在腸道桿菌不同種屬間的廣泛分布是毒力島通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移并獲得的一個(gè)強(qiáng)有力的證據(jù)[13]。HPI 基因長(zhǎng)度為35 kb～45 kb，含有編碼鐵載體耶爾森菌素介導(dǎo)的鐵攝取系統(tǒng)以及編碼耶爾森菌素受體的基因，核心功能區(qū)為irp2-fyuA 基因簇[14]。研究表明含有HPI 的E. coli 在導(dǎo)致奶牛乳房炎的E. coli 中占有很高的比例。徐繼英等從7 個(gè)省市奶牛乳腺炎樣品分離得到的190 株E. coli 中檢出26.31%的irp2 基因，18.94%的fyuA 基因[15]。孫武文從140 株致?tīng)倥８篂a的E. coli 中檢出59 株HPI 陽(yáng)性，其中fyuA 為49.15%，asn_tRNA_intB 為32.20%[16]。金文杰等檢測(cè)了216 株禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic E. coli，APEC），有44.9%的菌株攜帶有HPI[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，E. coli JL05 的HPI 一端與int_tRNA-Asn 基因相連，證明了該基因由水平轉(zhuǎn)移而來(lái)。

細(xì)菌的耐藥性可分為天然的或是突變產(chǎn)生的，即染色體遺傳基因介導(dǎo)的耐藥性和獲得耐藥性以及質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性，后者所攜帶的耐藥基因更易于傳播，在臨床上占有重要地位[18]。在抗生素的選擇性壓力下細(xì)菌為了生存便通過(guò)各種耐藥機(jī)理與抗生素對(duì)抗，對(duì)抗菌藥物的耐藥機(jī)理主要分為以下幾類(lèi)：產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶破壞抗生素的活性；影響細(xì)胞膜滲透作用進(jìn)而阻礙抗菌藥物的進(jìn)入；加快細(xì)菌主動(dòng)外排作用，排出菌體內(nèi)的抗生素；改變抗生素作用靶位[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，E. coli JL05 染色體及其質(zhì)粒上攜帶的耐藥基因種類(lèi)及數(shù)量十分豐富，但數(shù)量最多的還是外排機(jī)制的耐藥基因（42/53）。這些外排機(jī)制的耐藥基因多呈現(xiàn)對(duì)多類(lèi)抗菌藥物的耐藥性，如H-NS、evgA、evgS 兼具了RND 和MFS 兩種耐藥機(jī)制，TolC 兼具了RND、MFS、ABC 3種耐藥機(jī)制，soxS 基因除兼具RND、MFS、ABC 3種外排機(jī)制外，還具有改變抗生素作用靶點(diǎn)和降低抗生滲透性的機(jī)制。多樣的抗生素外排系統(tǒng)提示E.coli JL05 一直處于高濃度的抗生素環(huán)境中，巨大的選擇壓力下形成了多藥耐藥的特性。

高通量測(cè)序技術(shù)不僅在新耐藥基因的發(fā)現(xiàn)、耐藥基因的傳播機(jī)制、耐藥菌、耐藥基因的進(jìn)化分析等方面均起到了至關(guān)重要的作用[4]，還可以對(duì)包括基因組島、CRISPR-Cas 系統(tǒng)、前噬菌體在內(nèi)的具有水平轉(zhuǎn)移功能的可移動(dòng)元件進(jìn)行預(yù)測(cè)[20]。本研究通過(guò)對(duì)E. coli JL05 的全基因測(cè)序，不僅發(fā)現(xiàn)了MPEC的特征基因-fec 基因座，還發(fā)現(xiàn)了大量的毒力基因及耐藥基因，且無(wú)論是fec 基因座，還是HPI 以及質(zhì)粒中耐藥基因的上下游均發(fā)現(xiàn)了多種轉(zhuǎn)座子元件和I 型整合子，提示了E. coli JL05 復(fù)雜的進(jìn)化史，有利于更全面地認(rèn)識(shí)MPEC 菌株基因組的特征，為MPEC的感染治療和長(zhǎng)期防控提供參考依據(jù)。