非小細(xì)胞肺癌患者鉑類藥物化療前后RMB5基因表達(dá)的變化及化療預(yù)后分析

林杰勛 徐象威 張鵬海 朱佩禎 陳銀巧 奚一源

肺癌是我國發(fā)病率和病死率最高的一種惡性腫瘤，一項調(diào)查報道2015年約有733 300例新發(fā)的肺癌病例和610 200例死亡病例[1]。其中非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）仍是我國肺癌的主要類型，且常在發(fā)現(xiàn)時就已處于晚期。盡管近年來手術(shù)方案不斷革新，靶向治療、免疫治療不斷應(yīng)用于臨床，但是其5年生存率仍不足17%[2-3]。特別對于鱗癌及EGFR基因未突變的患者，含鉑類藥物化療方案仍是晚期NSCLC的一線抗腫瘤治療方案之一[4]。鉑類化合物與細(xì)胞核內(nèi)DNA結(jié)合，形成DNA-鉑類配合物引起DNA損傷，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。但是由于肺癌對鉑類藥物的天然耐藥或繼發(fā)性耐藥可對藥物的臨床療效和患者的遠(yuǎn)期預(yù)后造成嚴(yán)重影響。已有研究表明，凋亡缺陷是腫瘤細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥的主要機制之一[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，RBM5基因是人體內(nèi)一種重要的抑癌基因，在諸多腫瘤細(xì)胞中，RBM5調(diào)控許多基因的mRNA前體的選擇性剪切，可以調(diào)控細(xì)胞分化、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡等細(xì)胞代謝過程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[6-7]。外源性高表達(dá)RBM5可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡及G1期周期阻滯，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥。當(dāng)前對于RBM5的研究多為體外基礎(chǔ)研究，本研究從臨床實際病例中分析NSCLC患者鉑類化療前后RBM5 mRNA表達(dá)情況，評估其與化療療效以及無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年2月至2017年8月永康市第一人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科收治的接受含鉑類藥物化療方案的晚期NSCLC患者52例，其中男37例，女15例，年齡43～78（64.35±8.92）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡 18～80 歲；（2）入組前均經(jīng)氣管鏡或經(jīng)皮肺穿刺或胸水及痰查脫落細(xì)胞學(xué)明確病理類型的NSCLC患者，經(jīng)CT、MRI檢查證實具有一處及以上可測量腫瘤病灶，可根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟TNM分期進(jìn)行分期；（3）EGFR基因未見突變，未使用靶向治療藥物；（4）治療方案均以鉑類化療藥物為主的聯(lián)合化療，且化療至少4個周期的患者；（5）患者心電圖、肝腎功能檢查正常，均能達(dá)到化療的基本要求，預(yù)計生存期＞3個月，Karnofsky功能狀態(tài)評分≥60分。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）同時具有2種以上原發(fā)腫瘤患者；（2）曾接受放射治療或手術(shù)治療患者；（3）嚴(yán)重肝腎、心功能不全患者。剔除標(biāo)準(zhǔn)：（1）研究期間發(fā)生嚴(yán)重不良事件、并發(fā)癥和特殊病情變化不宜繼續(xù)接受調(diào)查者；（2）患者或家屬不愿繼續(xù)配合并退出者。所有患者均簽署書面知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法 于患者入院時記錄一般資料，包括性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤類型、臨床分期、體力活動狀態(tài)（performance status，PS）評分等。所有患者確診后均給予標(biāo)準(zhǔn)的含鉑類聯(lián)合化療方案，包括長春瑞濱+順鉑、紫杉醇+順鉑/卡鉑、吉西他濱+順鉑/卡鉑、多西他賽+順鉑/卡鉑、培美曲賽+順鉑/卡鉑。通過評估患者血常規(guī)、肝腎功能、心電圖等檢查結(jié)果，確認(rèn)患者化療耐受性，當(dāng)接受鉑類化療的患者出現(xiàn)疾病突然惡化或患者無法承受化療藥物毒性時，鉑類化療即時終止。進(jìn)行4個周期化療后，通過腫瘤標(biāo)志物、B超、胸部CT或MRI等檢查評估患者化療療效。療效按實體瘤標(biāo)準(zhǔn)判定[7]：分為完全緩解（CR），部分緩解（PR），無變化（SD），疾病進(jìn)展（PD）。其中有效率（RR）＝[（CR+PR）/（CR+PR+SD+PD）]×100%，穩(wěn)定率（CBR）＝[（CR+PR+SD）/（CR+PR+SD+PD）]×100%?；颊呓?jīng)鉑類化療后表現(xiàn)為CR或PR被定義為高反應(yīng)（17例），SD或PD被定義為低反應(yīng)（35例），兩組患者性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤類型、臨床分期、PS評分比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。同時，抽取患者初次化療前及化療4個周期后靜脈血，置于-70℃超低溫冰箱保存。

表1 兩組患者一般資料對比（例）

1.2.1 RBM5 mRNA表達(dá)量檢測 采用qRT-PCR法?？俁NA的提取采用RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒（北京天根生化有限公司，批號：Q5812）。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國 Thermo Fermentas公司，批號：00314979）將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成第1條鏈。引物合成由上海生工生物工程有限公司合成：P1:ACACGATGGATGGAAGCCA；P2:TCTGCTCTGCCTCTGACTT。按照 KAPA SYBRRFAST Real-time PCR Kit的反應(yīng)體系于ABI 7300 qPCR儀上完成基因檢測。以β-action為內(nèi)參，采用相對定量法（ΔΔCt）對實時熒光定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行比較。公式如下：ΔCt=Ct均值（目的基因）－Ct均值（管家基因），ΔΔCt=實驗組 ΔCt－對照組 ΔCt，差異倍數(shù)=2-ΔΔCt。

1.2.2 預(yù)后情況評估 采用電話隨訪、門診或住院病歷系統(tǒng)查詢等方式。研究主要觀察終點為PFS，定義為自首次化療后至隨訪終止或疾病復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時間，主要通過醫(yī)院信息系統(tǒng)或患者直系親屬電話確認(rèn)，末次隨訪截止2018年10月31日?；颊咴诨煰煶探Y(jié)束后每2個月隨訪1次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，化療前后比較采用配對t檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者化療療效評價 52例患者經(jīng)過4周期化療后，通過B超、腫瘤標(biāo)志物、胸部MRI等檢查評估患者化療療效。其中CR 4例，PR 13例，SD 18例，PD 17例。治療4周期后，RR為32.69%，CBR為67.30%。

2.2 不同療效及高反應(yīng)、低反應(yīng)組患者化療前后RBM5 mRNA表達(dá)量比較 不同療效組患者化療前RBM5 mRNA表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?；熀?，CR組、PR組RBM5 mRNA表達(dá)量均明顯高于化療前，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），而PD組患者RBM5 mRNA表達(dá)量明顯低于化療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）?；熀蟾鳢熜ЫM比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且SD、PD組 RBM5 mRNA表達(dá)量均明顯低于CR、PR組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。見表2。

高反應(yīng)、低反應(yīng)組患者化療前RBM5 mRNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。化療后，高反應(yīng)組RBM5 mRNA表達(dá)較化療前明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而低反應(yīng)組RBM5 mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且高反應(yīng)組RBM5 mRNA表達(dá)明顯高于低反應(yīng)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表2 不同療效患者化療前后RBM5 mRNA表達(dá)量比較

表3 高反應(yīng)、低反應(yīng)組患者化療前后RBM5 mRNA表達(dá)量比較

2.3 NSCLS患者化療后不同療效及高反應(yīng)、低反應(yīng)與PFS的關(guān)系分析 按照化療后療效情況，分析不同療效患者的生存曲線，CR組患者中位PFS為8.35個月，PR組患者為7.80個月，SD組患者為6.70個月，PD組患者為6.80個月，4組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.257，P＞0.05），見圖1。按照化療后反應(yīng)情況，分析化療高、低反應(yīng)患者的生存曲線，高反應(yīng)組與低反應(yīng)組的中位PFS分別為7.8個月與6.7個月，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.796，P＜0.05），見圖 2。

3 討論

鉑類藥物作為治療肺癌最有效的一線化療藥物，使用率達(dá)40%，其主要作用于細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物[8]。多數(shù)患者在化療初期對化療藥物敏感，腫瘤體積縮小，臨床癥狀減輕，但隨著化療周期的增多，臨床療效逐漸不佳，腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性[9]。近年來，已有研究發(fā)現(xiàn)鉑類藥物對DNA產(chǎn)生不可修復(fù)的損傷可激活凋亡通路殺滅腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路中的任何環(huán)節(jié)功能受抑制或失活均能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對鉑類藥物產(chǎn)生耐藥性[10]。

圖1 不同療效患者的生存曲線比較（CR為完全緩解；PR為部分緩解；SD為無變化；PD為疾病進(jìn)展）

圖2 高反應(yīng)、低反應(yīng)患者的生存曲線比較

RBM5，又稱為Luca15或H37，其基因定位于染色體3p21.3區(qū)域，是近年來發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，與肺癌密切相關(guān)[11]。在多種惡性腫瘤細(xì)胞中（特別是肺癌），RBM5通過調(diào)控mRNA前體的選擇性剪切，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡與促凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)、抗凋亡蛋白表達(dá)下調(diào)、線粒體細(xì)胞色C素釋放進(jìn)入細(xì)胞液增加和caspase家族活化增加，也可調(diào)節(jié)其他多種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生物學(xué)行為[12-13]。邵晨[14]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織上RBM5呈現(xiàn)低表達(dá)，且凋亡抑制蛋白表達(dá)明顯增高。同時通過對肺腺癌的體內(nèi)、體外實驗研究證實，RBM5可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖的共同作用來抑制肺腺癌生長。當(dāng)前關(guān)于RBM5在肺癌組織上的表達(dá)及其功能方面的研究目前僅有少數(shù)報道，且多數(shù)局限于細(xì)胞株上的研究。在多種惡性腫瘤細(xì)胞株中，過表達(dá)RBM5可抑制細(xì)胞凋亡，并通過使細(xì)胞周期停滯在G1期來抑制細(xì)胞增殖[15-16]。在Su等[17]研究中RBM5在其耐藥細(xì)胞A549/DDP中表達(dá)下調(diào)，而RBM5基因?qū)朐摷?xì)胞株后，其對順鉑的敏感性顯著增加。在Loiselle等[18]研究中也發(fā)現(xiàn)了RBM5可以降低小細(xì)胞肺癌的生長，增加順鉑的敏感性，并調(diào)節(jié)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)化相關(guān)通路。本研究從臨床實際病例中分析NSCLC患者鉑類化療前后RBM5 mRNA表達(dá)量情況，評估其與化療療效以及生存期間的關(guān)系，通過對比不同化療患者化療前RBM5 mRNA表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，療效為CR、PR的患者RBM5 mRNA表達(dá)量較化療前有升高，而SD、PD的患者較前下降。同時生存情況，CR組中位PFS最高，但由于例數(shù)太少，導(dǎo)致與SD、PD組比較差異無明顯意義，而化療高反應(yīng)組中位PFS明顯長于低反應(yīng)組，說明化療越好，患者生存時間越長。

綜上所述，NSCLC患者經(jīng)鉑類化療后，不同患者對鉑類藥物具有不同的敏感性，從而出現(xiàn)不同的療效及預(yù)后，化療療效好的患者RBM5 mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)，且生存期較長。鉑類藥物可誘導(dǎo)NSCLC患者RBM5 mRNA表達(dá)的改變，檢測其表達(dá)量對于判斷NSCLC患者化療效果與預(yù)后具有一定的參考價值。在今后的研究中可對RBM5對腫瘤耐藥的調(diào)控機制進(jìn)一步研究，以期為今后臨床開展克服腫瘤多藥耐藥提供更多依據(jù)。