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    大麗輪枝菌淀粉酶VdAmy-1的致病功能*

    2021-01-22 08:44:02王瑩蕾趙鈺瑩王小葉劉子翔徐云巧
    關(guān)鍵詞:大麗枝菌信號肽

    王瑩蕾, 趙鈺瑩, 劉 旭, 王小葉, 劉子翔 徐云巧, 朱 妍, 莊 靖, 田 李

    (曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,273165,山東省曲阜市)

    大麗輪枝菌是引發(fā)多種農(nóng)作物(包括棉花、茄子等重要經(jīng)濟作物)產(chǎn)生黃萎病的土傳性病原真菌,在世界范圍內(nèi)造成重大經(jīng)濟損失[1,2].長期的致病機理研究發(fā)現(xiàn),大麗輪枝菌胞外分泌蛋白在侵染過程發(fā)揮重要作用,是最終引起寄主植株發(fā)病和死亡的主要因素[3].胞外蛋白大致分為兩類:一是扮演毒力因子或者參與調(diào)控寄主免疫反應(yīng)的效應(yīng)蛋白.如蛋白譜發(fā)現(xiàn)的小分子量富含半胱氨酸類蛋白VdSCP7,可誘導(dǎo)植物的免疫反應(yīng)[4];比較基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)的幾丁質(zhì)結(jié)合模體蛋白LysM抑制幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的植物免疫反應(yīng)[5].另外一類是具有酶活的分泌型蛋白.分泌蛋白中的大量酶類可以降解寄主植物的細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì),這不僅有利于病原真菌的侵入與擴展,也為病原菌的生存提供了必要的碳源.根據(jù)酶作用的底物,細(xì)胞壁降解酶可分為果膠酶、纖維素酶等種類.目前,研究人員通過基因敲除實驗發(fā)現(xiàn)果膠酶裂解酶VdPL3.1/3[6],纖維素酶VdEG1/3[7]均參與大麗輪枝菌的致病性.這可能與大麗輪枝菌需要降解寄主富含果膠和纖維素的細(xì)胞壁,從而進入維管束的生活史特點密切相關(guān)[8].淀粉是植物細(xì)胞內(nèi)的重要碳源,大麗輪枝菌如何利用寄主的淀粉作為其營養(yǎng)物質(zhì)一直不明確.本研究選取了一個大麗輪枝菌淀粉酶,利用基因敲除技術(shù)對其功能進行了初步研究.

    1 材料與方法

    1.1 大麗輪枝菌Vd991淀粉酶基因VdAmy-1的克隆

    根據(jù)酵母菌淀粉酶蛋白序列,在NCBI大麗輪枝菌基因組數(shù)據(jù)庫中進行BLASTp搜索.根據(jù)數(shù)據(jù)庫中該蛋白的編碼基因序列,設(shè)計可擴增該基因全長的引物Amy-F/R (見表1).分別以大麗輪枝菌Vd991基因組DNA和cDNA為模板,擴增該基因的全長序列和編碼框序列.PCR產(chǎn)物送交上海生工生物工程有限公司測序.

    1.2 VdAmy-1信號肽功能驗證

    PCR擴增編碼信號肽的基因序列,將擴增產(chǎn)物連接到EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切的pSUC2載體(該載體含有缺失信號肽的蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因SUC).利用聚乙二醇/醋酸鋰(PEG/LiAc)法將重組載體轉(zhuǎn)入YTK12酵母菌株(該酵母菌株缺失蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因SUC,在以棉子糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中不能生長).將上述酵母菌培養(yǎng)在以棉子糖為唯一碳源的YPRAA培養(yǎng)基 (1% yeast extract,2% peptone,2% raffinose,2 μg/Μl antimicyn A),通過觀察酵母是否生長,判斷蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC是否可有效分泌.

    1.3 VdAmy-1基因敲除突變體的構(gòu)建

    按照高效大麗輪枝菌基因敲除方法進行[9].簡要來說,使用引物K1-K6分別擴增VdAmy-1基因上游、下游和潮霉素抗性基因片段,融合 PCR方法構(gòu)建基因敲除載體,然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化大麗輪枝菌.在添加有50 μg/mL頭孢霉素、30 μg/mL潮霉素和50 μmol/L F2dU的PDA培養(yǎng)基中篩選基因敲除轉(zhuǎn)化子,并利用VdAmy-1基因內(nèi)部引物K7-K8對其進行PCR分子驗證.將野生型VdAmy-1基因重新導(dǎo)入突變體細(xì)胞,得到回補菌株.本文所使用的引物見表1.

    表1 本研究中使用的引物

    1.4 突變體菌株利用淀粉能力分析

    分別取5 μL濃度為1×106個/mL野生型菌株、突變體菌株和功能互補菌株的孢子點接至1%淀粉作為唯一碳源的固體查比克鹽(NaNO32 g/L,KCl 0.50 g/L,F(xiàn)eSO40.01 g/L,KH2PO41.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.50 g/L) 培養(yǎng)基上(以豐富培養(yǎng)基PDA為對照),25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d并拍照,根據(jù)菌落大小定性推測各菌株利用淀粉能力的差異.

    1.5 致病力檢測

    在棉苗子葉期,將棉株連根拔起.將根在無菌水中沖洗,然后置于大麗輪枝菌的孢子懸浮液中5 min.每個菌株接種10株棉苗,共設(shè)3個重復(fù).接菌后的第4周拍照并調(diào)查病情指數(shù)[10].

    2 結(jié)果與討論

    2.1 大麗輪枝菌VdAmy-1基因的序列分析

    根據(jù)酵母菌淀粉酶蛋白序列,在大麗輪枝菌 Vd991基因組數(shù)據(jù)庫中進行 BLASTp 搜索,得到大麗輪枝菌Vd991中的同源蛋白,Genbank編號為VEDA_08865,本研究中命名為VdAmy-1.基因測序結(jié)果顯示,該基因全長1967 bp,含有1個內(nèi)含子,編碼635個氨基酸殘基.大麗輪枝菌VdAmy-1蛋白與酵母菌淀粉酶蛋白具有76%的氨基酸序列同源性,其中C端的淀粉酶結(jié)構(gòu)域的同源性高達(dá)91%.蛋白質(zhì)保守功能域預(yù)測表明,在該蛋白的 N端有典型的信號肽,C端有1個保守的淀粉酶(carbohydrate-binding module,family 20)結(jié)構(gòu)域,說明VdAmy-1蛋白是一個分泌型淀粉酶.

    2.2 VdAmy-1的N端信號肽具有分泌活性

    本研究利用酵母信號肽捕獲系統(tǒng)對其信號肽活性進行驗證[11].YTK12 酵母菌株為蔗糖轉(zhuǎn)化酶SUC缺陷性菌株,不能夠在只含有棉籽糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基YPRAA中生長.pSUC2質(zhì)粒中含有缺失信號肽的SUC2編碼基因,只有在該基因前插入編碼信號肽的核酸序列,并將重組pSUC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入YTK12菌株中,這樣蔗糖轉(zhuǎn)化酶才可以正常分泌至胞外,從而使YTK12菌株可以利用棉籽糖作為碳源生長.

    信號肽預(yù)測程序 SignalP 5.0顯示VdAmy-1蛋白質(zhì)N端前21個氨基酸為信號肽序列.本研究將VdAmy-1編碼信號肽的核苷酸序列連接到 pSUC2 載體中,轉(zhuǎn)入YTK12酵母細(xì)胞中進行信號肽活性驗證.結(jié)果顯示,YTK12菌株和含有pSUC2空載體的菌株不能夠在YPRAA培養(yǎng)基中生長,而含有VdAmy-1信號肽的酵母菌株可以在YPRAA培養(yǎng)基中正常生長(圖1),說明該蛋白的信號肽具有分泌活性,VdAmy-1為大麗輪枝菌分泌型蛋白.

    圖1 酵母信號肽捕獲系統(tǒng)驗證VdAmy-1信號肽活性.已知的信號肽Avr1b作為陽性對照

    2.3 獲得大麗輪枝菌突變體菌株KO和功能回補菌株EC

    通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,將基因敲除載體導(dǎo)入野生型菌株(Wild Type,WT)進行遺傳轉(zhuǎn)化,共得到26個轉(zhuǎn)化子.選取隨機挑選其中2個候選基因敲除的轉(zhuǎn)化子,對其進行 PCR驗證并命名為KO-1/2.為進一步證明突變體菌株KO-1/2相對于野生型的表型變化是由于VdAmy-1基因缺失所造成的,本研究將VdAmy-1基因重新導(dǎo)入KO-1/2,構(gòu)建功能回補菌株EC-1/2.PCR驗證顯示(圖2),以野生型菌株基因組作為模板,利用VdAmy-1基因內(nèi)部引物K7-K8,可成功擴增出0.7 kb的VdAmy-1基因片段.以突變體菌株KO-1/2基因組作為模板,不能擴增出VdAmy-1基因所對應(yīng)的條帶,回補菌株EC-1/2又重新擴增出VdAmy-1基因所對應(yīng)的條帶(圖2).上述結(jié)果說明已經(jīng)成功構(gòu)建了突變體和功能回補菌株.

    圖2 大麗輪枝菌突變體菌株(KO-1/2)和功能回補菌株(EC-1/2)的構(gòu)建

    2.4 突變體菌株利用淀粉能力減弱

    野生型菌株WT和突變體菌株KO-1/2在豐富培養(yǎng)基PDA上均生長良好,可形成大量的白色氣生菌絲,無黑色微菌核生成,并且形成大小相似的菌落.說明VdAmy-1的缺失不影響大麗輪枝菌的基本生長能力(圖3).與之相比,突變體KO-1/2在以淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基上的菌落直徑明顯小于野生型菌株,僅有野生型菌株的52%.功能互補菌株EC-1/2可彌補突變體菌株的上述缺陷(圖3).

    圖3 VdAmy-1的缺失減弱菌株利用淀粉能力

    以上實驗說明突變體KO-1/2利用淀粉能力明顯減弱,VdAmy-1是大麗輪枝菌重要的淀粉酶.同時,突變體菌株并沒有完全喪失在淀粉培養(yǎng)基上的生長能力,提示大麗輪枝菌中還可能存在其他的淀粉酶編碼基因,它們共同行使利用淀粉的功能.

    2.5 突變體菌株致病性下降

    致病性實驗表明,接種野生型菌株的棉株表現(xiàn)出典型的葉片萎蔫、褪綠、壞死和植株株高變矮的黃萎病發(fā)病癥狀.與之相比,突變體菌株所侵染的棉苗發(fā)病明顯減輕,僅表現(xiàn)出微弱的黃萎病癥狀.病情指數(shù)統(tǒng)計顯示,突變體菌株造成的致病性僅有野生型菌株的41%.回補菌株所侵染的棉苗的發(fā)病癥狀與野生型相似(圖4).以上結(jié)果說明淀粉酶VdAmy-1是大麗輪枝菌重要的致病因子.推測原因,可能是由于淀粉是病原菌重要的碳源,淀粉利用能力的下降可能造成大麗輪枝菌在寄主中的生長受限,從而使菌株致病性下降.

    圖4 VdAmy-1的缺失減弱菌株的致病性

    3 結(jié) 論

    VdAmy-1基因的缺失不影響大麗輪枝菌的基本生長,但是減弱了其利用淀粉的能力,降低了對寄主棉花的致病性.上述研究表明VdAmy-1是大麗輪枝菌一個重要的分泌型淀粉酶,扮演毒力因子的角色.本研究進一步揭示了大麗輪枝菌如何利用寄主的營養(yǎng)物質(zhì),為其生物防控提供了理論基礎(chǔ).

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