自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)治療膝關(guān)節(jié)軟骨缺損 11 例報告

王志學(xué) 姬振偉 徐奎 吳鵬 程世陽 丁勇

各種原因?qū)е碌南リP(guān)節(jié)軟骨損傷發(fā)生率為5%，在特定人群中如運動員的發(fā)生率可高達(dá) 22%～50%[1]。人體膝關(guān)節(jié)軟骨無血管組織、無血液供應(yīng)，營養(yǎng)主要來源于關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑液，一旦損傷就很難再生，后期可能發(fā)展為骨關(guān)節(jié)炎[2]。因此膝關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)成為骨科醫(yī)生最具挑戰(zhàn)性的臨床難題之一。膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的傳統(tǒng)治療方法包括關(guān)節(jié)鏡下清理術(shù)、微骨折術(shù)、自體骨軟骨移植術(shù) ( 馬賽克技術(shù) )，但是這些方法各有其不足之處。關(guān)節(jié)鏡下清理術(shù)只能暫時緩解臨床癥狀，不能促進(jìn)缺損區(qū)軟骨修復(fù)。而微骨折術(shù)后再生的組織為纖維軟骨，其耐磨性、生物力學(xué)性能和透明軟骨相差很遠(yuǎn)，達(dá)不到真正意義上的軟骨修復(fù)[3]。自體骨軟骨移植術(shù)則存在供體受限、不適合大面積軟骨缺損等問題，而且骨軟骨栓之間的間隙可導(dǎo)致軟骨退變[4-5]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和組織工程的興起，自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù) ( autologous chondrocyte implantation，ACI ) 開始應(yīng)用于臨床。本研究應(yīng)用 ACI 治療創(chuàng)傷和剝脫性骨軟骨炎導(dǎo)致的膝關(guān)節(jié)軟骨缺損，采用 Lysholm評分、國際膝關(guān)節(jié)文獻(xiàn)委員會 ( International Knee Documentation Committee，IKDC ) 主觀評分和 MRI 對11 例進(jìn)行術(shù)后最長 7 年隨訪。報告如下。

資料與方法

一、納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 年齡 18～55 歲；( 2 ) 膝關(guān)節(jié)急性或繼發(fā)性軟骨缺損患者；( 3 ) 缺損面積 2.5～8.0 cm2；( 4 ) 缺損程度 Outerbridge Ⅲ / Ⅳ 級。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：( 1 ) 感染性關(guān)節(jié)??；( 2 ) 關(guān)節(jié)強直；( 3 ) 痛風(fēng)；( 4 ) 傳染性疾病 ( 肝炎、HIV、梅毒等 )；( 5 ) 糖尿病；( 6 ) 體質(zhì)量指數(shù) ( body mass index，BMI ) ≥ 30；( 7 ) 妊娠期患者；( 8 ) 下肢力線異常 ( 內(nèi)翻或外翻超過正常值 5° )；( 9 ) 精神異常；( 10 ) 醫(yī)生判定不能手術(shù)的其它情況患者。

二、一般資料

本研究納入 2012 年 6 月至 2014 年 6 月于我科住院的 11 例膝關(guān)節(jié)軟骨缺損患者，其中男 4 例( 36.36% )，女 7 例 ( 63.64% )，男女性別比為 0.57∶1；年齡 19～42 歲，平均年齡 ( 26.91±6.92 ) 歲。根據(jù) Outerbridge 標(biāo)準(zhǔn)分級[6]，軟骨缺損為 Ⅲ～Ⅳ 級，缺損面積 2.0～4.2 cm2，平均 ( 3.12±0.70 ) cm2，其中股骨外髁 6 處，股骨內(nèi)髁 3 處，髕骨 2 處。3 例伴有初次髕骨脫位，3 例伴有半月板撕裂，1 例伴有色素沉著絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎。隨訪時間 5.3～7.5 年，平均 ( 6.46±0.79 ) 年。所有受試者均簽署知情同意書，臨床研究按照赫爾辛基宣言和中國倫理委員會要求進(jìn)行。

三、手術(shù)方法

1. 術(shù)前準(zhǔn)備：常規(guī)進(jìn)行患膝關(guān)節(jié)正側(cè)位 X 線片和 3.0 T MRI 檢查，檢測下肢力線和 Q 角，結(jié)合臨床查體。如發(fā)現(xiàn)伴有髕骨脫位，半月板損傷，滑膜炎等合并癥，則同時進(jìn)行相應(yīng)手術(shù)治療。排除手術(shù)禁忌，術(shù)前進(jìn)行 Lysholm 評分和 IKDC 評分。

2. 關(guān)節(jié)鏡探查術(shù)：硬膜外麻醉下手術(shù)。氣壓止血帶充氣至 50～60 kPa。取膝關(guān)節(jié)前內(nèi)、前外入路，鏡下檢查膝關(guān)節(jié)滑膜、內(nèi)外側(cè)半月板、前后交叉韌帶以及髕股關(guān)節(jié)對應(yīng)關(guān)系，如有損傷或病變進(jìn)行相應(yīng)處理 ( 3 例伴有初次髕骨脫位進(jìn)行髕骨外側(cè)支持帶松解術(shù)，3 例伴有半月板撕裂進(jìn)行半月板部分切除成形術(shù)，1 例伴有色素沉著絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎進(jìn)行滑膜切除術(shù) )。鏡下探查明確膝關(guān)節(jié)軟骨缺損具體部位和范圍 ( 圖 1 )。取關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)健康軟骨200～300 mg 作為種子細(xì)胞，送實驗室 ( 陜西瑞盛生物科技有限公司 ) 進(jìn)行自體軟骨細(xì)胞制備。沖洗關(guān)節(jié)腔，縫合切口，手術(shù)完畢。

3. 移植物制備：超凈工作臺內(nèi)使用磷酸緩沖鹽溶液 ( phosphate buffer saline，PBS ) 反復(fù)清洗軟骨碎片，Ⅱ 型膠原酶消化約 15～20 h。終止消化后依次進(jìn)行離心、棄上清，并接種于培養(yǎng)皿置于恒溫箱培養(yǎng)。定期觀察軟骨細(xì)胞生長、換液及傳代。培養(yǎng)后約 6～8 周完成細(xì)胞計數(shù)和安全性檢測，從培養(yǎng)皿底部機械分離軟骨細(xì)胞移植物，制備完成。同時預(yù)約患者再次入院，準(zhǔn)備手術(shù)移植。

4. 手術(shù)移植：硬膜外麻醉下常規(guī)消毒鋪巾。再次關(guān)節(jié)鏡探查軟骨缺損區(qū)，撤關(guān)節(jié)鏡后根據(jù)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損具體部位采用不同關(guān)節(jié)入路切開暴露關(guān)節(jié)缺損。同時將自體軟骨細(xì)胞移植物浸入 0.9% 氯化鈉溶液中備用 ( 圖 2 )。缺損區(qū)清創(chuàng)至軟骨下骨，修整缺損邊緣。修剪自體軟骨細(xì)胞膜片以匹配缺損形狀，均勻覆蓋于缺損區(qū)之后使用重組人纖維蛋白凝膠固定 ( 圖 3 )。靜置約 3 min，屈伸關(guān)節(jié)確定膜片無松動脫落。輕柔沖洗，依次縫合關(guān)閉切口。

5. 術(shù)后康復(fù)：術(shù)后佩戴可調(diào)節(jié)膝關(guān)節(jié)支具逐步進(jìn)行功能康復(fù)鍛煉。術(shù)后 48 h 內(nèi)固定于伸膝位，術(shù)后 48 h 進(jìn)行 0°～30° 之間主動屈伸膝活動，配合持續(xù)關(guān)節(jié)被動鍛煉 ( CPM 機 )，同時進(jìn)行股四頭肌肌力恢復(fù)鍛煉。逐步加大屈伸角度，術(shù)后 4～6 周開始部分負(fù)重活動，術(shù)后 12 周可去除支具。術(shù)后 1 年內(nèi)避免對抗性體育活動。

四、評價指標(biāo)

1. 術(shù)后 Lysholm 評分和 IKDC 評分：術(shù)前常規(guī)進(jìn)行患側(cè)膝關(guān)節(jié) Lysholm 評分和 IKDC 評分。Lysholm評分分別于術(shù)后 3 個月、術(shù)后 2 年和末次隨訪時進(jìn)行。從跛行、負(fù)重、交鎖、關(guān)節(jié)不穩(wěn)、疼痛、腫脹、爬樓梯、下蹲共 8 個方面對膝關(guān)節(jié)功能進(jìn)行評估[7]。IKDC 評分同樣于術(shù)后 3 個月、術(shù)后 2 年和末次隨訪時進(jìn)行，通過調(diào)查問卷的形式調(diào)查患者的主觀癥狀變化[8]。

圖 1 患者，女，28 歲，關(guān)節(jié)鏡下探查見股骨外髁軟骨缺損伴有色素沉著絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎Fig.1 A 28-year-old female with femur lateral condyle cartilage defect and pigmented villonodular synovitis

圖 2 自體軟骨細(xì)胞移植物浸入 0.9% 氯化鈉溶液中備用Fig.2 Autologous chondrocyte grafts were immersed in 0.9% sodium chloride solution for preparation

2. 術(shù)后 MRI 檢查：術(shù)后 3 個月、術(shù)后 2 年和末次隨訪時分別進(jìn)行患膝關(guān)節(jié) MRI 檢查，11 例均于空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院磁共振室完成 ( GE 公司，3.0 T )，之后交由磁共振室富有經(jīng)驗的醫(yī)師進(jìn)行術(shù)前術(shù)后不同時期的影像對比，進(jìn)行軟骨修復(fù)組織的磁共振觀察 ( magnetic resonance observation of cartilage repair tissue，MOCART ) 評分，分別從缺損填充程度、移植物整合情況、修復(fù)區(qū)表面連續(xù)性、修復(fù)組織的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、修復(fù)組織的信號、軟骨下骨板情況、軟骨下骨情況、關(guān)節(jié)是否粘連、關(guān)節(jié)積液或滑膜炎等方面進(jìn)行系統(tǒng)評估[9]。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對受試者基本資料和基線情況進(jìn)行統(tǒng)計描述，計數(shù)資料用構(gòu)成比表示，計量資料用表示。采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，分別利用 Lysholm 評分、IKDC 評分和 MOCART 評分評價手術(shù)療效。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

所有患者均切口愈合良好，1 例合并色素沉著絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎術(shù)后康復(fù)依從性差，膝關(guān)節(jié)活動度恢復(fù)情況較康復(fù)計劃滯后，術(shù)后 1 個月時經(jīng)手法松解后逐漸恢復(fù)正?？祻?fù)進(jìn)度。所有患者未出現(xiàn)其它相關(guān)并發(fā)癥和不良事件。所有患者均獲得隨訪。

一、Lysholm 評分

采用 Lysholm 評分評價 ACI 對膝關(guān)節(jié)軟骨缺損患者的治療效果，結(jié)果顯示，不同隨訪時間患者的 Lysholm 評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F= 89.874，P=0.000 ) ( 表 1 )。

圖 3 a：軟骨缺損區(qū)顯露；b：缺損區(qū)清創(chuàng)；c：自體軟骨細(xì)胞移植物覆蓋Fig.3 a: Exposure of the cartilage defect; b: Debridement of the cartilage defect; c: Autologous chondrocyte graft implant

二、IKDC 評分

采用 IKDC 評分評價 ACI 對膝關(guān)節(jié)軟骨缺損患者的治療效果，結(jié)果顯示，不同隨訪時間患者的 IKDC 評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F= 186.353，P=0.000 ) ( 表 2 )。

表 1 11 例膝關(guān)節(jié)軟骨缺損患者 Lysholm 評分 ( 分 )Tab.1 Lysholm scores were obtained from 11 patients with knee cartilage defects ( point )

表 2 11 例膝關(guān)節(jié)軟骨缺損患者 IKDC 評分 ( 分 )Tab.2 IKDC scores were obtained from 11 patients with knee cartilage defects ( point )

三、MRI 檢查

患者術(shù)后 3 個月 MRI 檢查顯示：軟骨缺損處基本填充，偶見局部混雜信號影，部分病例可見骨髓下水腫信號影，可見少量關(guān)節(jié)腔積液；術(shù)后 2 年軟骨組織修復(fù)信號與周圍正常組織接近，信號呈均勻一致樣改變，骨髓水腫信號較前明顯減退 ( 圖 4 )；末次隨訪顯示移植軟骨與周圍正常組織完全融合，骨髓下水腫信號影完全消失，關(guān)節(jié)面平整，無關(guān)節(jié)積液，與正常組織結(jié)構(gòu)無差異 ( 圖 5 )。

四、MOCART 評分

采用 MOCART 評分評價 ACI 對膝關(guān)節(jié)軟骨缺損患者的治療效果，結(jié)果顯示，不同隨訪時間患者的MOCART 的評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F= 277.692，P= 0.000 ) ( 表 3 )。

表 3 11 例膝關(guān)節(jié)軟骨缺損患者 MOCART 檢查評分 ( 分 )Tab.3 Mocart scores of 11 patients with knee cartilage defect ( point )

圖 4 a：術(shù)前，白色箭頭顯示股骨外髁軟骨缺損；b：術(shù)后 2 年，白色箭頭顯示缺損區(qū)修復(fù)良好Fig.4 a: Cartilage defect of femur lateral condylar preoperation ( white arrow ); b: Good repair of the cartilage defect 2 years postoperation ( white arrow )

討 論

圖 5 a：術(shù)前，白色線頭顯示股骨外髁軟骨缺損；b：術(shù)后 3 個月，白色箭頭顯示原缺損區(qū)初步填充，但仍可見輕微凹陷，信號不均勻；c：術(shù)后 7 年，白色箭頭顯示原缺損區(qū)修復(fù)良好，與正常結(jié)構(gòu)無差別Fig.5 a: Cartilage defect of femur lateral condylar preoperation ( white arrow ); b: The defect was initially filled 3 months postoperation, but with slight sunken and uneven signals ( white arrow ); c: Good repair of the cartilage defect 7 years postoperation ( white arrow )

1987 年，瑞典醫(yī)生 Peterson 最早應(yīng)用 ACI 治療膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。1994 年，Brittberg 等[10]報道使用 ACI治療 23 例膝關(guān)節(jié)軟骨缺損患者，缺損面積 1.6～6.5 cm2。術(shù)后隨訪16～66 個月 ( 平均 39 個月 )，所有患者的臨床癥狀包括關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、關(guān)節(jié)彈響均得到改善。當(dāng)時該技術(shù)需取自體脛骨近端骨膜覆蓋固定于關(guān)節(jié)表面缺損區(qū)，將含有自體軟骨細(xì)胞的混懸液注入骨膜與缺損區(qū)的間隙，通過軟骨細(xì)胞生長來修復(fù)軟骨缺損。被稱為第一代 ACI。隨著應(yīng)用日漸增多，第一代 ACI 顯露出了很多缺點：細(xì)胞混懸液的滲漏、移植前軟骨細(xì)胞去分化、軟骨細(xì)胞在缺損區(qū)的不均勻分布等[11]。針對第一代 ACI 的不足，第二代 ACI 摒棄了常常導(dǎo)致脛前區(qū)疼痛及需要額外切口等術(shù)后并發(fā)癥的自體脛骨骨膜，而采用 Ⅰ / Ⅲ 型雙層膠原膜覆蓋膝關(guān)節(jié)缺損區(qū)并注入軟骨細(xì)胞混懸液。在一項對比研究中，第二代 ACI 術(shù)后效果明顯優(yōu)于第一代 ACI[12]。第三代 ACI 以生物材料作為軟骨種子細(xì)胞載體，而不再需要骨膜或者 Ⅰ / Ⅲ 型雙層膠原膜，也稱為基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植( matrixinduced autologous chondrocyte implantation，MACI )。一些研究報道了應(yīng)用 MACI 技術(shù)治療膝關(guān)節(jié)軟骨缺損并獲得了滿意的臨床效果[13-16]。

由于 MACI 技術(shù)通常選擇藻酸鹽或者透明質(zhì)酸等作為支架進(jìn)行軟骨細(xì)胞嵌入[17]，技術(shù)要求高，治療花費較大，所以限制了該技術(shù)在臨床的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用，這也是 ACI 治療膝關(guān)節(jié)軟骨缺損術(shù)后長期效果報道相對較少的原因之一。本研究采用的自體軟骨細(xì)胞膜片移植物不需要額外的生物材料作為支架，不含生物因子。相對于其它生物移植材料，可更大程度保證軟骨細(xì)胞數(shù)目和活性。本研究納入11 例膝關(guān)節(jié)軟骨缺損患者采用 ACI 治療并獲得最長7 年隨訪，通過關(guān)節(jié)功能評分的提升和 MRI 表現(xiàn)證實了該技術(shù)臨床效果滿意。Brix 等[18]報道了 53 例接受 MACI 治療的患者術(shù)后至少 5 年時間隨訪，結(jié)果顯示效果良好；Filardo 等[19]對 131 例進(jìn)行最短7 年時間隨訪，關(guān)節(jié)功能改善明顯。上述研究中報道的 ACI 術(shù)后關(guān)節(jié)功能逐步改善和提升與本研究采用的軟骨細(xì)胞膜片作為移植物術(shù)后結(jié)果基本一致，這一結(jié)果說明采用無生物支架材料的自體軟骨細(xì)胞移植物修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損后同樣可以達(dá)到滿意的臨床效果，而且可避免生物材料降解和制備費用高昂等相應(yīng)問題，這為膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的移植材料提供了新的選擇。

本研究采用的 Lysholm 評分是國際公認(rèn)的膝關(guān)節(jié)功能評分，更傾向于膝關(guān)節(jié)運動損傷的功能評估，與關(guān)節(jié)退變等因素基本無關(guān)，相對更適合本次臨床試驗的所有患者。Lysholm 評分從跛行、負(fù)重、交鎖、關(guān)節(jié)不穩(wěn)、疼痛、腫脹、爬樓梯、下蹲共8 個方面評分總和對膝關(guān)節(jié)功能進(jìn)行評估，總分為100 分。本次試驗所得數(shù)據(jù)顯示 11 例在術(shù)后關(guān)節(jié)功能較術(shù)前明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P< 0.05 )。IKDC 評分同樣是全世界范圍內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的評分系統(tǒng)之一，僅次于 Lysholm 評分。IKDC 評分主要對膝關(guān)節(jié)運動損傷患者進(jìn)行關(guān)節(jié)功能評估。本研究采用的 IKDC 評分為 2000 年修訂版，問卷簡單易懂，更加注重患者主觀感受。本研究顯示所有患者術(shù)后的 IKDC 評分在術(shù)后逐步提升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05 )。

膝關(guān)節(jié) MRI 是目前臨床上評價關(guān)節(jié)軟骨狀況的最佳無創(chuàng)檢查手段。本研究中 11 例均于術(shù)前常規(guī)進(jìn)行 MRI 檢查，術(shù)后 3 個月、術(shù)后 2 年以及末次隨訪時分別進(jìn)行 MRI 檢查。術(shù)后各時期 MRI 可見移植后原軟骨缺損區(qū)逐漸填充修復(fù)，軟骨恢復(fù)平整光滑形態(tài)。MOCART 評分逐步升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05 )。Alparslan 等[20]詳細(xì)描述了自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)后不同恢復(fù)階段的 MRI 表現(xiàn)，筆者的研究中各階段 MRI 表現(xiàn)與該作者報道一致。

本研究存在一些不足之處。首先，本研究納入病例數(shù)不多。組織工程技術(shù)的快速發(fā)展促進(jìn)了 ACI的更新?lián)Q代，生物支架的不斷改進(jìn)以及軟骨細(xì)胞成品移植物的層出不窮，使得應(yīng)用單一技術(shù)產(chǎn)品治療大量的膝關(guān)節(jié)軟骨缺損患者比較困難。其次，本研究沒有進(jìn)行缺損區(qū)填充物的組織學(xué)檢查。Marcacci等[13]應(yīng)用 MACI 技術(shù)治療 141 例膝關(guān)節(jié)軟骨缺損患者，術(shù)后組織學(xué)檢查大多是透明樣軟骨。張仲文等[14]對 10 例 MACI 患者進(jìn)行為期 2 年的隨訪，并對部分患者行缺損區(qū)填充物活檢，顯示填充物為透明軟骨和纖維軟骨的混合體，以透明軟骨為主。二次關(guān)節(jié)鏡探查組織學(xué)檢查如顯示填充物為透明軟骨或者類透明軟骨，則對 ACI 的有效性更具說服力。但是本研究納入患者術(shù)后關(guān)節(jié)功能恢復(fù)良好，無疼痛不適癥狀，因此所有患者無意愿接受再次手術(shù)探查。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，ACI 可有效治療膝關(guān)節(jié)軟骨缺損，術(shù)后關(guān)節(jié)功能評分顯著提高，MRI 顯示缺損區(qū)修復(fù)良好，長期隨訪效果滿意。ACI操作簡單，術(shù)后無明顯并發(fā)癥和不良反應(yīng)發(fā)生。對于創(chuàng)傷原因?qū)е碌南リP(guān)節(jié)軟骨缺損患者，尤其是年輕患者，是一項安全、可靠、有效的治療手段。