滋陰化痰方調控腫瘤細胞來源外泌體對HUVECs管樣分化的影響*

李晶晶，季青，劉煊，李琦，岳小強

1.中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院，上海200003；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海200003

胃癌是我國常見惡性腫瘤，雖然手術、放療、化療等技術不斷進步，靶向藥物也不斷涌現(xiàn)，但目前對于胃癌的整體療效仍不理想。近年來，中醫(yī)藥在胃癌綜合防治中的作用與地位越來越受到重視。滋陰化痰方（Ziyin Huatan Recipe，ZYHT）是上海長征醫(yī)院中醫(yī)科基于“胃癌痰證理論”所創(chuàng)制的針對晚期胃癌的有效方劑。前期研究證實其對胃癌血管新生有明顯的抑制作用［1］，但其確切機制尚不明確。外泌體是由多種細胞（包括腫瘤細胞）通過胞吐方式分泌至微環(huán)境中的一種直徑在30～100 nm，具有雙層膜結構的囊狀結構［2］，幾乎所有的細胞都可以分泌外泌體，有些微生物亦可以產生［3-5］。近年來發(fā)現(xiàn)在細胞之間的通訊中發(fā)揮重要調節(jié)作用［6］，可直接轉運促血管新生相關蛋白至內皮細胞，也可通過轉運microRNA和lncRNA，進而影響促血管新生因子的表達［7］。外泌體不僅本身參與腫瘤免疫、腫瘤侵襲及轉移等過程，并且腫瘤外泌體攜帶的內容物可能作為腫瘤標志物用于腫瘤的早期診斷與治療［8］?，F(xiàn)代研究者認為，外泌體研究雖屬微觀分子學，但其整體表達的特點與中醫(yī)整體觀念有相似性［9］。目前更有學者將外泌體引入中醫(yī)的研究領域，為中醫(yī)和外泌體的結合帶來新的進展與突破［10］。本研究擬觀察ZYHT是否通過調控胃癌細胞來源的外泌體來影響人臍靜脈內皮細胞管樣分化，繼而影響腫瘤的血管新生。

1 材料

1.1 細胞HUVECs、SGC-7901、MGC-803均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 藥品與試劑ZYHT中所需藥物百合（批號:18041006）、白花蛇舌草（批號:18082704）、制半夏（批號:19052209）均為吳江上海蔡同德中藥飲片公司提供。DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號:AE29431636）；FBS（美國 GIBCO 公司，批號:42G9081K）；0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（上海碧云天科技有限公司，批號:090619191011）；PKH67細胞膜標記熒光染色劑（美國Sigma公司，批號:MKCH2943）；Matrigel基質膠（美國BD公司，批號:9189007）；BCA蛋白質定量試劑盒（上海碧云天科技有限公司，批號:010719190723）；表面標志物TSG101、CD81多克隆抗體（美國Proteintech公司，批號:14497-1-AP、66866-1-Ig）；GAPDH多克隆抗體（美國Cell signaling公司，批號:14971633）。細胞培養(yǎng)上清外泌體快速抽提試劑盒HieffTM（上海翊圣生物科技有限公司，批號:H8914770）。

1.3 儀器倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號:CKX53）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司，型號:CCL-170B-8）；多功能酶標儀（美國Biotek Instruments公司，型號:8218141）；透射電鏡（美國FEI公司，型號:Tecnai G2 Spirit Biotwin）；納米顆粒跟蹤分析儀NanoSight（英國Malvern公司，型號:Zeta View）；共聚焦熒光顯微鏡［奧林巴斯（中國）有限公司，型號:IX73］。

2 方法

2.1 ZYHT制備將百合30 g，白花蛇舌草30 g和制半夏15 g，加8倍水煎2次，每次2 h，將煎液濾過，減壓濃縮成膏。加入2倍乙醇攪拌，靜置48 h，過濾并回收乙醇，濃縮成膏，并干燥粉碎［11］。由上海長征醫(yī)院藥材科統(tǒng)一制備，質控穩(wěn)定。ZYHT配制:用培養(yǎng)基配制1 g·L-1母液。CCK-8法檢測ZYHT的IC10值，根據(jù)IC10值確定ZYHT的給藥濃度［1］。此次實驗確定高劑量ZYHT（ZYHT-H）和低劑量ZYHT（ZYHT-L）為研究對象。

2.2 外泌體的分離純化取對數(shù)生長期的第4代MGC-803細胞，分別加入2種不同劑量的ZYHT，用去除外泌體的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，收集上清培養(yǎng)液，0.22μm 濾膜過濾，離心半徑11.5 cm，3 000 g離心10 min，小心收集上清并轉移至新的離心管，于冰上放置待用；加入一定比例的外泌體抽提試劑，渦旋振蕩混勻1 min，放置4℃靜置2 h或過夜；取出裝有混合液的離心管于4℃，離心半徑8.4 cm，10 000 g離心60 min，棄上清，收集沉淀，取適量PBS均勻吹打離心沉淀物，使其充分混勻，并轉移至新的離心管中；將含有外泌體的離心管于4℃，離心半徑8.4 cm，12 000 g離心2 min，棄沉淀，保留上清；將獲取的MGC-803-Exos于80℃保存?zhèn)溆?，避免反復凍融。SGC-7901-Exos操作同前。

2.3 外泌體的鑒定

2.3.1 透射電鏡觀察MGC-803-Exos形態(tài)取10μL的MGC-803-Exos滴于透射電鏡專用的載樣銅網上，常溫靜置2 min，濾紙吸去浮液，用1%（W/V）磷鎢酸溶液染色5 min后，濾紙吸去多余染色液，晾干，透射電鏡觀察MGC-803-Exos的形態(tài)。

2.3.2 W estern blot法檢測MGC-803-Exos膜表面標志性蛋白取MGC-803-Exos 100μg，加入100μL的RIPA裂解液，吹打使裂解液和MGC-803-Exos充分混合，冰上裂解30min，在4℃下，離心半徑8.4 cm，12 000 g離心30 min，吸取上清液置于1.5 mL EP管中，-80℃凍存。BCA法檢測蛋白濃度后，加入5×Loading Buffer，99℃變性10 min。按每孔20μL上樣至10%SDS-PAGE膠，80 V電泳30min，120 V電泳1 h，采用濕法轉膜，200mA轉膜1 h 30 min，5%BSA封閉液室溫封閉2 h，5%BSA封閉液以1∶1 000的比例稀釋一抗GAPDH、TSG101和CD81，4℃孵育一抗過夜。TBST漂洗10 min，洗滌3次，加入二抗室溫孵育2 h，加入顯影液，上機曝光。

2.3.3 MGC-803-Exos粒徑分析取濃度為100 mg·L-1的100μL的MGC-803-Exos重懸于1.5 mL PBS內，經納米顆粒跟蹤分析儀NanoSight進行檢測。SGC-7901-Exos操作同前。

2.4 外泌體與HUVECs共培養(yǎng)觀察

2.4.1 外泌體染色取濃度為100 mg·L-1的MGC-803-Exos加入300μL的DiluentC溶液混勻，配制成MGC-803-Exos工作液，以確保完全分散。在新的離心管中加入1μL的PKH6與250μL的Diluent C溶液混勻，配制成PKH67染色液。SGC-7901-Exo工作液和PKH67染色液輕柔混勻4 min后，加入等體積0.5%BSA結合多余染料，室溫孵育20min。加入比例外泌體提取試劑4℃避光靜置2 h。4℃，10 000 g，離心60 min，PBS重懸染色后的MGC-803-Exos。將含有外泌體的離心管于4℃，離心半徑8.4 cm，12 000 g離心2 min，棄沉淀，保留上清，用0.22 nm濾器過濾，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 MGC-803-Exos與HUVECs共培養(yǎng)取第5代HUVECs重懸于無血清培養(yǎng)基中，以5×104·mL-1濃度加入24孔板中，每孔100μL（5 000個），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細胞貼壁后加入上述PKH67熒光標記的MGC-803-Exos，孵育24 h后去培養(yǎng)基，將細胞用TBST洗3遍，每次3 min；用4%多聚甲醛固定爬片15 min（可4℃固定過夜），PBS洗3次，每次3 min；每孔加入0.5%Tritonx-100 250μL，室溫通透20 min（細胞膜打孔）；用TBST洗3遍，每次3～5 min，吸水紙吸干；每孔加入DAPI200μL，避光孵育5min，用TBST洗3遍，每次3 min；染膜:膜探針（紅色），1∶100稀釋，每孔200μL，染5～20 min，用TBST洗3遍，每次3 min。共聚焦熒光顯微鏡下觀察ADSC-Exos是否進入細胞，鏡下PKH67熒光標記的MGC-803-Exos呈綠色熒光。SGC-7901-Exos操作同前。

2.4.3 外泌體影響進HUVECs管樣結構形成實驗

將Matrigel基質膠置于96孔板中，37℃孵育30 min使其凝固。用無血清培養(yǎng)基重懸第5代HUVECs后接種至96孔板中，每孔2×104個細胞。實驗分為4組分別加入濃度為100 mg·L-1的MGC-803-Exos、300 mg·L-1的MGC-803-Exos、500 mg·L-1的MGC-803-Exos以及等量PBS（對照組）。每組3個復孔。于37℃處理48 h后，倒置相差顯微鏡下觀察管狀結構形成情況，計算每孔分支結構總長度。SGC-7901-Exos操作同前。

2.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組比較時，先行正態(tài)性檢驗，若不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗KruskalWallis檢驗法；若符合正態(tài)分布，則采用單因素方差分析（one way ANOVA），多個實驗組與對照組進行比較采用Dunnett′s test檢驗。檢驗水準為α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 外泌體鑒定透射電鏡觀察示，MGC-803-Exos和SGC-7901-Exos為大小均勻、形態(tài)一致的圓形或橢圓形膜性囊泡，邊緣清晰。納米顆粒跟蹤分析儀NanoSight檢測顯示，MGC-803-Exos粒徑范圍為37.9～203.5 nm，SGC-7901-Exos粒徑范圍57.4～147.5 nm 符合外泌體粒徑范圍30～200 nm（見圖1、圖2）。Western blot檢測顯示，TSG101和CD81為其標志蛋白，內參蛋白為GAPDH（見圖3）。

圖1 MGC-803-Exos的電鏡形態(tài)和粒徑大小

圖2 SGC-7901-Exos的電鏡形態(tài)和粒徑大小

圖3 外泌體的標志蛋白CD81、TSH101

3.2 外泌體與HUVECs共培養(yǎng)為了進一步驗證外泌體能否被HUVECs攝取，我們對外泌體進行染色標記，與HUVECs共培養(yǎng)24 h后，發(fā)現(xiàn)在共聚焦顯微鏡下被PKH67熒光標記的外泌體呈云霧狀或斑片狀綠色熒光，聚集在細胞核周圍。說明外泌體可以被HUVECs攝?。ㄒ妶D4）。

圖4 血管內皮細胞攝取外泌體

3.3 ZYHT調控腫瘤細胞來源外泌體抑制HUVECs管樣結構形成將外泌體與HUVECs共培養(yǎng)，觀察ZYHT能否調控外泌體影響HUVECs的管樣分化能力。倒置相差顯微鏡觀察結果顯示，當外泌體濃度為100 mg·L-1時，不論是MGC-803-EXOs或SGC-7901-EXOs對HUVECs成管能力無明顯影響。但當外泌體濃度為300 mg·L-1和500 mg·L-1時，ZYHT調控外泌體影響HUVECs的管樣分化能力與對照組相比表現(xiàn)出明顯差異（見圖5、圖6）。

圖5 ZYHT調控MGC-803-Exos對HUVECs體外成管能力的影響

圖6 ZYHT調控SGC-7901-Exos對HUVECs體外成管能力的影響

3.4 不同處理方式對MGC細胞的比較運用重復測量方差分析的方法發(fā)現(xiàn)在MGC-803細胞實驗中不同的處理之間存在著顯著的差異（F ＝212.257，P＜0.001），不同處理方法與不同濃度之間的交互作用顯著（F＝49.539，P＜0.001），而不同濃度之間不存在顯著的差異（見表1和表2）。由表1可知，HUVECs的分支長度，在MGC-803-Exos組是隨著濃度的增加而增加；在ZYHT-L-MGC-803-Exos組和ZYHT-H-MGC-803-Exos組是隨濃度的增加而減少。由表2可知，外泌體濃度為100mg·L-1，MGC-803-Exos組的HUVECs分支長度最長；外泌體濃度為300 mg·L-1和500 mg·L-1，ZYHT-H-MGC-803-Exos組的HUVECs分支長度最短。由此得出ZYHT調控MGC-803-Exos抑制HUVECs管樣分化能力的影響是隨著外泌體濃度的增加及ZYHT劑量的增加而增強（見圖7）。

表1 不同濃度在同一實驗處理的比較 （±s）

表1 不同濃度在同一實驗處理的比較 （±s）

注：*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001

處理方法（I）濃度（ρ/mg·L-1）（J）濃度（ρ/mg·L-1）平均差異（I-J ）***MGC-803-Exos 100 300-1 107.33 500-3 674.33 300 100 1 107.33***500-2 567.00 500 100 3 674.33 300 2 567.00 ZYHT-L-MGC-803-Exos 100 300 1 359.00*500 2 273.67*300 100-1 359.00*500 914.67*500 100-2 273.67*300-914.67*ZYHT-H-MGC-803-Exos 100 300 2 473.67**500 3140.67**300 100-2473.67**500 667.00 500 100-3140.67**300-667.00

圖7 不同濃度在同一實驗處理的比較

3.5 不同處理方式對SGC-7901細胞的比較在SGC-7901細胞實驗中，不同的處理之間也存在著顯著的差異（F＝408.572，P＜0.001），不同濃度之間存在顯著差異（F＝53.374，P＜0.01），且不同處理方法與不同濃度之間的交互作用顯著（F＝407.535，P＜0.001）（見表3和表4）。由表3可知，HUVECs的分支長度，在SGC-7901-Exos組是隨著濃度的增加而增加；在ZYHT-L-SGC-7901-Exos組和ZYHT-H-SGC-7901-Exo是隨濃度的增加而減少。由表4 可知，外泌體濃度為100 mg·L-1的情況下，SGC-7901-Exos組的HUVECs分支長度最長；外泌體濃度為300 mg·L-1和500 mg·L-1，ZYHT-H-SGC-7901-Exos組的HUVECs分支長度最短。由此得出ZYHT調控SGC-7901-Exos抑制HUVECs管樣分化能力的影響是隨著外泌體濃度的增加及ZYHT劑量的增加而增強（見圖8）。

表2 不同處理在同一濃度的比較（±s）

表2 不同處理在同一濃度的比較（±s）

注：*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001

濃度（ρ/mg·L-1）（I）處理方法（J）處理方法平均差異（I-J ）100 Control MGC-803-Exos-1106.67 ZYHT-L-MGC-803-Exos-449.67 ZYHT-H-MGC-803-Exos 84.67 MGC-803-Exos Control 1106.67 ZYHT-L-MGC-803-Exos 657.00 ZYHT-H-MGC-803-Exos 1191.33**ZYHT-L-MGC-803-Exos Control 449.67 MGC-803-Exos-657.00 ZYHT-H-MGC-803-Exos 534.33 ZYHT-H-MGC-803-Exos Control-84.67 MGC-803-Exos-1191.33*ZYHT-L-MGC-803-Exos-534.33 300 Control MGC-803-Exos-2214.00*ZYHT-L-MGC-803-Exos 909.33 ZYHT-H-MGC-803-Exos 2558.33*MGC-803-Exos Control 2214.00*ZYHT-L-MGC-803-Exos 3123.33***ZYHT-H-MGC-803-Exos 4772.33***ZYHT-L-MGC-803-Exos Control-909.33 MGC-803-Exos-3123.33***ZYHT-H-MGC-803-Exos 1649.00***ZYHT-H-MGC-803-Exos Control-2558.33*MGC-803-Exos-4772.33***ZYHT-L-MGC-803-Exos-1649.00***500 Control MGC-803-Exos-4781.00 ZYHT-L-MGC-803-Exos 1824.00*ZYHT-H-MGC-803-Exos 3225.33*MGC-803-Exos Control 4781.00 ZYHT-L-MGC-803-Exos 6605.00 ZYHT-H-MGC-803-Exos 8006.33*ZYHT-L-MGC-803-Exos Control-1824.00*MGC-803-Exos-6605.00*ZYHT-H-MGC-803-Exos 1401.33*ZYHT-H-MGC-803-Exos Control-3225.33*MGC-803-Exos-8006.33*ZYHT-L-MGC-803-Exos-1401.33*

表3 不同濃度在同一實驗處理的比較

表4 不同處理在同一濃度的比較

圖8 不同處理在同一濃度的比較

4 討論

近年來隨著對腫瘤微環(huán)境研究的不斷深入，外泌體開始受到越來越多的關注。外泌體在腫瘤的自噬、化療抵抗、轉移等生物學進程中發(fā)揮重要的調控作用［12］。眾所周知，在腫瘤發(fā)生的早期就伴隨著新血管的生長，而更多研究表明腫瘤的血管新生與其產生的外泌體密切相關。外泌體作為腫瘤與各種正常細胞之間的通訊系統(tǒng)，可以將自身攜帶的與血管新生相關蛋白、microRNA和lncRNA傳遞給參與血管生成的受體細胞的分子和遺傳物質，并促進內皮細胞和其他正常細胞表型和功能的重新編程［13］。研究發(fā)現(xiàn)惡性黑色素瘤細胞來源的外泌體內含有miRNA-9，其可以通過激活JAK-STAT通路來促進血管內皮細胞的管腔形成［14］。Umezu等［15］發(fā)現(xiàn)來源于人類白血病腫瘤細胞的外泌體傳遞的miRNA被HUVECs攝取后，可增加腫瘤細胞遷移能力和促進血管管腔的形成。Yuk-Kit等［16］研究發(fā)現(xiàn)人鼻咽癌 C666-1 細胞分泌的外泌體被HUVECs胞吞后，改變了HUVECs相應的蛋白質，促進血管生成，表明外泌體可能通過改變內皮細胞蛋白質的表達水平來促進血管生成。還有研究證明，外泌體通過體內和體外靶向轉錄因子c-MYB，將miR-130a從胃癌細胞導入到血管細胞，可以促進血管生成和腫瘤生長［17］。LIU等［18］報道，CD97高表達的胃癌組織來源的外泌體可發(fā)揮促血管生成作用而使胃癌細胞增殖能力提高20%。由此可見，外泌體可以通過多種途徑促進腫瘤血管的生成，加速腫瘤生長。外泌體作為腫瘤血管生成的潛在生物標志物，有望成為抗腫瘤血管生成治療的靶點。

中醫(yī)藥對惡性腫瘤的防治有獨特的作用，通過抑制血管新生、調節(jié)免疫微環(huán)境等干預腫瘤的侵襲和轉移［19］，特別是針對腫瘤的復發(fā)，中醫(yī)藥具有一定的優(yōu)勢［20］。由于外泌體參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲與轉移等諸多生理活動，而中醫(yī)藥防治腫瘤具有多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點的特點，因此，中醫(yī)藥的作用機制可能通過干預外泌體介入腫瘤診療的各個環(huán)節(jié)［21］。中醫(yī)研究著眼于臟腑功能的整體變化，而細胞和組織分子亦是一個動態(tài)演變的過程，外泌體產生異常的蛋白質、分子等靶基因，提示人體內部微環(huán)境的動態(tài)變化，從而出現(xiàn)不同的癥狀和體征。因此將外泌體與中醫(yī)藥相結合，未來可從新的微觀角度揭示中醫(yī)辨證論治腫瘤的機制［22-25］。ZYHT是課題組所在學科基于中醫(yī)“從痰論治胃癌”的理論所創(chuàng)制的針對晚期胃癌的基礎方，該方以百合為君，用之益胃扶正、化痰祛邪；制半夏為臣，降氣和胃、燥濕化痰；佐以白花蛇舌草清熱解毒利濕。前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，其聯(lián)合化療可明顯改善胃癌患者生活質量，延長其生存期。本研究顯示ZYHT可抑制胃癌細胞的侵襲和遷移，其機制與抗胃癌血管新生有關。本研究將ZYHT作用于腫瘤細胞，結果顯示隨著ZYHT藥物劑量的增加，其調控外泌體抑制HUVECs的管樣分化的作用增強，并且這種作用是隨著外泌體濃度的增加而增強，提示調控腫瘤細胞外泌體分泌的確是ZYHT抗血管生成的內在分子機制之一?？梢娢磥砜梢酝饷隗w為切入點，更全面地研究中醫(yī)藥防治腫瘤的機制。