寧夏地區(qū)不育患者染色體多態(tài)性與人工輔助生殖技術(shù)助孕結(jié)局的關(guān)系*

劉芳, 包俊華, 于辛酉, 金銳, 唐大偉, 白剛, 馬文葉, 任萌萌

1銀川市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心(寧夏銀川 750001)； 2寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心(寧夏銀川 750001)

染色體多態(tài)性的定義是染色體異染色質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)內(nèi)的微小變異。異染色質(zhì)由高度重復(fù)的非編碼DNA序列所連接構(gòu)成，而染色體多態(tài)性在近些年以來，隨著醫(yī)學(xué)科技以及生物基因工程等學(xué)科的飛速發(fā)展，已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)科學(xué)所集中探討的焦點問題之一[1-3]。目前全球所研究的染色體多態(tài)性變化較多，如1號、9號、16號染色體的次縊痕區(qū)加長或者缺如，9號染色體臂間倒位，D/G組染色體短臂或者Y染色體長臂的長度出現(xiàn)變異等[4-6]。長久以來，研究人員一般認(rèn)為異染色質(zhì)的變異不會產(chǎn)生實際的臨床意義，所以將其歸屬為染色體的正常多態(tài)性變化。但是隨著近些年以來我國人群中不孕不育患者數(shù)量和比例的急速上升，部分學(xué)者提出異染色質(zhì)區(qū)的變異可能會引發(fā)部分客觀存在的臨床改變，比如原發(fā)性不孕不育以及反復(fù)流產(chǎn)等[7-8]。同時，由于不孕不育家庭的數(shù)量上升，采用人工輔助生殖技術(shù)(ART)完成生育功能的需求也在逐年上升[9-10]。而接受ART的男性患者是否會因為染色體多態(tài)性的問題導(dǎo)致多次助孕失敗，尚存在不小的爭議。而人群中基因的分布情況又與地域差異密切相關(guān)，因此針對本地區(qū)人群的染色體多態(tài)性調(diào)查就顯得較為重要。本研究選擇我中心接診的1 029例男性患者的資料進(jìn)行回顧性分析，對寧夏地區(qū)不育男性患者染色體多態(tài)性與ART助孕[體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)]結(jié)局的關(guān)系進(jìn)行探討，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月至2018年10月在我中心首次接受IVF/ICSI-ET治療的1 029例男性患者為研究對象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)男女雙方為合法夫妻，生殖系統(tǒng)均不存在解剖結(jié)構(gòu)異常；(2)女方的染色體核型為46，XX，且不具有任何染色體多態(tài)，年齡低于38周歲；(3)男方的染色體核型為46，XY，可以攜帶或不攜帶染色體多態(tài)；(4)均為新鮮周期移植樣本，關(guān)于本次研究的數(shù)據(jù)完整，可以分析。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)男女雙方患有已知可以對ART結(jié)局產(chǎn)生影響的疾?。?2)具有對IVF/ICSI-ET過程中使用藥物的過敏現(xiàn)象；(3)男方具有明確的染色體異常，無精癥等；(4)相關(guān)數(shù)據(jù)不完整。

按照所采用的助孕方法和男方是否具有染色體多態(tài)，分為A組(接受IVF且男方染色體多態(tài)，n=87)、B組(接受IVF且男方染色體正常，n=530)、C組(接受ICSI且男方染色體多態(tài)，n=61)、D組(接受ICSI且男方染色體正常，n=351)。

1.2 方法

1.2.1 染色體核型分析 采集患者的肘部靜脈血1 mL，放入肝素抗凝管中，取0.5 mL接種在5 mL RPMI 1645培養(yǎng)基中，以37℃恒溫培養(yǎng)72 h。之后進(jìn)行常規(guī)染色體制片和G顯帶。對樣品計數(shù)分裂相中期細(xì)胞共30個，嵌合型需計數(shù)50個，G帶核型在鏡下完成分析3～5個。依據(jù)人類細(xì)胞學(xué)國際命名體質(zhì)(ISCN)完成染色體的核型分析診斷。

1.2.2 控制性超排卵 我中心執(zhí)行常規(guī)超排卵方案，具體如下：在女性的黃體中期進(jìn)行降調(diào)節(jié)，達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后，依據(jù)患者的年齡、體重、基礎(chǔ)卵泡刺激素水平、竇卵泡數(shù)量等，制定促性腺激素的起始劑量。在周期啟動之后，對女性的血清激素水平和卵泡發(fā)育情況進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，根據(jù)個人的情況適時調(diào)整促性腺激素的用量。在有1個卵泡直徑>2 cm或者2個卵泡的直徑>1.8 cm的情況下，停止使用促性腺激素。當(dāng)天注射人絨毛膜促性腺激素。完成注射之后的36 h后取卵。所取得的卵子經(jīng)過體外受精收培養(yǎng)72 h。之后進(jìn)行胚胎移植或者繼續(xù)進(jìn)行囊胚培養(yǎng)后移植。

1.2.3 妊娠結(jié)局 在胚胎移植之后的14 d和18 d，抽取女性的外周靜脈血，分析血清中β-HCG的含量，若結(jié)果為陽性而且移植完成35 d后盆腔B超顯示出現(xiàn)孕囊，則表示臨床妊娠。如患者在妊娠12周內(nèi)出現(xiàn)終止則為早期流產(chǎn)[11]。

1.3 觀察指標(biāo) 分別對比A組與B組，C組與D組的一般臨床資料。包括女方的年齡、女方的體質(zhì)指數(shù)(BMI)、促性腺激素用量、移植當(dāng)天子宮內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)量、移植胚胎數(shù)量、移植囊胚比例。描述全部男性染色體多態(tài)的核型分布情況。A組與B組的妊娠結(jié)局對比。C組與D組的妊娠結(jié)局對比。其中各類妊娠結(jié)局的定義依據(jù)參考文獻(xiàn)[12]中的定義。

2 結(jié)果

2.1 A組與B組、C組與D組的一般臨床資料對比 A組與B組、C組與D組的各項一般臨床資料對比中，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、2。

表1 A組與B組的一般臨床資料對比

表2 C組與D組的一般臨床資料對比

2.2 全部男性染色體多態(tài)的核型分布情況 在148例出現(xiàn)染色體多態(tài)的男性患者中，染色體臂間倒位28例，占18.92%，常染色體次縊痕區(qū)加長27例，占18.24%，D/G組染色體短臂44例，占29.73%，Y染色體長臂長度變異49例，占33.11%。見表3。

2.3 A組與B組的妊娠結(jié)局對比 A組與B組的正常受精率、多精受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

2.4 C組與D組的妊娠結(jié)局對比 C組與D組的正常受精率、多精受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表3 全部男性染色體多態(tài)的核型分布情況

表4 A組與B組的妊娠結(jié)局對比 例(%)

表5 C組與D組的妊娠結(jié)局對比 例(%)

3 討論

染色體的多態(tài)性是近些年以來全球范圍內(nèi)研究的一個熱點問題，其主要表現(xiàn)為異染色體在一定程度上的變異，尤其是具有高度重復(fù)DNA的結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)的變異。出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常的染色質(zhì)主要集中在端粒、著絲粒、隨體、次縊痕以及Y染色體的長臂端。關(guān)于染色體多態(tài)性與若干疾病的研究，近些年在基因科學(xué)的飛速進(jìn)步下，也取得了較大的突破，但是染色體的多態(tài)性和人體生殖功能之間的關(guān)系，則一直存在不小的爭議。部分學(xué)者認(rèn)為染色體多態(tài)性和多種生殖異常，如流產(chǎn)、胎停育、死胎、男性不育、精子異常等具有關(guān)聯(lián)，可以導(dǎo)致出現(xiàn)不同類別的臨床表現(xiàn)[12-14]。染色體的次縊痕與隨體部分的變異有可能致使紡錘體無法與染色體連接，對染色體的正常分離與運(yùn)動產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。而異染色質(zhì)在著絲粒的功能方面具有十分重要的功效，是姐妹染色單體在結(jié)合以及分離過程中所必須的基礎(chǔ)之一?？梢哉J(rèn)為染色質(zhì)在維持基因組的穩(wěn)定，進(jìn)化以及細(xì)胞正常分化的基因調(diào)控表達(dá)方面，具有核心功能。所以認(rèn)為染色質(zhì)的異常有可能對胚胎的發(fā)育構(gòu)成影響。以此理論為基礎(chǔ)，則推論出在接受人工輔助生殖的患者中，進(jìn)行一定的染色體情況篩查是十分必要的。如果檢查結(jié)果顯示，夫妻任意一方出現(xiàn)染色體的異常(包括常染色體和性染色體)，則其下一代可能出現(xiàn)不良的結(jié)局，并導(dǎo)致妊娠的概率降低，流產(chǎn)的概率上升。當(dāng)然，也有相當(dāng)比例的學(xué)者認(rèn)為單純的染色體多態(tài)性無法對生殖功能構(gòu)成影響，與人工輔助生殖的結(jié)局也沒有必然的聯(lián)系[15-16]。雙方均持有若干的文獻(xiàn)證明，但爭議至今仍然存在。

本研究對4年以來我中心接診的男性患者的染色體檢查數(shù)據(jù)進(jìn)行了回顧性分析。從結(jié)果中可見，在全部1 029例患者之中，僅有238例出現(xiàn)染色體多態(tài)，比例為7.86%，該比例與若干研究結(jié)果報道的數(shù)據(jù)較為接近。需要注意的是，在近些年以來，男性染色體多態(tài)變化的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出逐漸增高的變化趨勢，這可能與外界環(huán)境的影響，自然遺傳的淘汰，生活方式的轉(zhuǎn)變等均具有密切的關(guān)系，而由此是否可以導(dǎo)致人群的生育能力降低，尚缺乏權(quán)威的論斷。本研究中按照人工助孕的方式和是否出現(xiàn)染色體多態(tài)，將全部的男性患者分為4個組。并成對地對兩組之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，探討在相同助孕方式之下，是否出現(xiàn)染色體多態(tài)，對于妊娠結(jié)局的影響。

從本研究所羅列的男性患者出現(xiàn)染色體多態(tài)的核型分布情況可見，染色體臂間倒位，常染色體次縊痕區(qū)加長，D/G組染色體短臂， Y染色體長臂長度變異成為四個分布種類。這也同目前多數(shù)研究的結(jié)果較為一致[17-19]。

染色體運(yùn)動以及分離的分子機(jī)制研究結(jié)果顯示，在染色體的主縊痕區(qū)，即富含重復(fù)堿基序列的異染色質(zhì)區(qū)域的著絲粒，被稱為動粒復(fù)合體，是細(xì)胞分裂中紡錘絲的著力點，也是染色體可以運(yùn)動，和平均分配到兩個細(xì)胞的功能以及結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。這種結(jié)構(gòu)和其隨體區(qū)域毗鄰，由于距離相近，隨體的變異就可能導(dǎo)致端著絲粒染色體的分離異常，從而使胚胎在發(fā)育過程中出現(xiàn)非整倍體的變異，或者在減數(shù)分裂中出現(xiàn)異常配子的風(fēng)險增高，這有可能導(dǎo)致自然流產(chǎn)或者死胎等出現(xiàn)。

次縊痕區(qū)主要存在與1號、9號、16號染色體，這些次縊痕區(qū)會發(fā)生長度的提升、斷裂或者遠(yuǎn)端染色體片段的重復(fù)，而這些結(jié)構(gòu)方面的改變有可能最終導(dǎo)致臨床病變的出現(xiàn)。次縊痕區(qū)大多位于染色體的結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)區(qū)域，在這個區(qū)域內(nèi)多由高度重復(fù)的DNA序列所構(gòu)成，也有學(xué)者認(rèn)為次縊痕的增多就是高度重復(fù)的DNA序列增多的結(jié)果[20]。高度重復(fù)的DNA序列會對正常的細(xì)胞分裂過程產(chǎn)生影響，導(dǎo)致同源染色體難以配對，也有可能導(dǎo)致不平衡配子出現(xiàn)，因此有可能誘發(fā)不孕不育的出現(xiàn)，提醒在臨床工作中應(yīng)給予一定的重視。

染色體的臂間倒位攜帶者一般外表是正常的，但是在配子的形成過程中，因為同源染色體需要相互配對，在減數(shù)分裂的第1次分裂中，將形成一種獨特的倒位環(huán)。在倒位環(huán)內(nèi)出現(xiàn)同源染色體交換，會出現(xiàn)4種不同的配子，只有一種為正常的染色體，另外一種使倒位染色體，兩種為帶有重復(fù)片段和缺失片段的重排染色體。這形成了不平衡配子，有可能誘發(fā)流產(chǎn)、不孕不育或者死胎等生殖異常。一般認(rèn)為倒位片段的長度越短，則出現(xiàn)重復(fù)或者缺失的可能性越大，形成正常配子以及合子的可能性也就越低，導(dǎo)致流產(chǎn)、不孕不育等的風(fēng)險越高。

Y染色體長臂長度變異主要是指異染色質(zhì)區(qū)的長度增加或者減少。長臂異染色質(zhì)區(qū)的組成部分是Y染色體獨特的串聯(lián)重復(fù)序列，在該區(qū)域內(nèi)過度的DNA序列重復(fù)可能會導(dǎo)致減數(shù)分裂過程中X-Y的配對概率，或者因為斑點位置效應(yīng)對精子生成基因的表達(dá)形成抑制。Y染色體長臂上具有精子分化與發(fā)育的基因，若高度重復(fù)可造成精子生成障礙或受精能力降低，但長臂距離縮短也意味著基因功能的丟失與精子形成的異常。

盡管在理論上，以上4種主要的男性染色體多態(tài)性變異均有可能對妊娠結(jié)局產(chǎn)生影響，但是在實際計算結(jié)果中，各類人工助孕的結(jié)局?jǐn)?shù)據(jù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。出現(xiàn)該種結(jié)果的可能原因如下：盡管在理論上，染色體的多態(tài)性變化可能對妊娠結(jié)局發(fā)生影響，但是這僅存在于理論推導(dǎo)和部分實驗條件無法絕對標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的研究結(jié)果中，畢竟對妊娠結(jié)局可能產(chǎn)生影響的因素眾多，而每種因素能夠影響妊娠結(jié)局的能力也有較大差異。DNA序列在復(fù)制和基因表達(dá)的過程中，同時也具有相當(dāng)?shù)募m錯機(jī)制作為保護(hù)，這在一定程度上也可以對染色體多態(tài)性的變異影響產(chǎn)生抑制效果。本研究中并沒有將因受精情況不佳、沒有合適胚胎抑制的患者的資料納入進(jìn)來，推測如果將研究的樣本量繼續(xù)擴(kuò)大，則有可能出現(xiàn)陽性的結(jié)果。

綜上所述，寧夏地區(qū)的男性不育患者存在一定比例的染色體多態(tài)性變異，但是這種變異對于人工助孕的結(jié)局沒有產(chǎn)生明顯的影響，但本結(jié)果尚需要進(jìn)行深入探討。