應(yīng)用DNA提取改良和二次聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)烏頭及其炮制品

朱高倩， 李雙良， 馬莉， 周培軍， 蒲星宇， 王麗， 符德歡

（1.云南省藥物研究所，云南昆明 650111；2.云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650111）

烏頭類藥物有較為悠久的傳統(tǒng)用藥歷史，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛等功效，廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕麻痹、關(guān)節(jié)疼痛等臨床治療中，在各類成藥制劑、藥材標(biāo)準(zhǔn)中占比較大[1]。該類藥材均來(lái)自毛茛科（Ranunculaceae）烏頭屬（Aconitum）植物根莖。烏頭屬種類繁多，分布廣泛，全球約有350種，我國(guó)約有167 種[2]，僅云南省境內(nèi)就有約66 種，25 變種，4 變型[3]。《中華人民共和國(guó)藥典》2000 年版、2005 年版、2010 年版、2015 年版等標(biāo)準(zhǔn)均有記載烏頭類藥材[4-7]?！吨腥A本草》記載了60多種烏頭屬植物可入藥[8]。目前，《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》收載的烏頭類藥材僅有黃草烏一種[9]，但當(dāng)?shù)孛耖g還將烏頭屬其他種也當(dāng)作烏頭類藥材使用。目前，有些非國(guó)標(biāo)或非省標(biāo)的烏頭屬植物被盲目栽培，市場(chǎng)上充當(dāng)國(guó)標(biāo)或省標(biāo)藥材銷售，難以通過(guò)產(chǎn)地判斷烏頭屬藥材的基原，市場(chǎng)上充斥了大量以國(guó)標(biāo)或省標(biāo)正品名銷售的混偽品，加之烏頭屬種間的化學(xué)成分種類、含量可能會(huì)存在差異[10-12]，炮制前混雜的品種經(jīng)過(guò)統(tǒng)一的炮制方法炮制后，導(dǎo)致有效成分（或有毒成分）含量可能不在預(yù)期范圍內(nèi)，進(jìn)而導(dǎo)致入藥后無(wú)效、低效或中毒。

目前，對(duì)于烏頭屬藥材的鑒別，單純通過(guò)性狀、顯微、理化等方法已不能滿足市場(chǎng)藥材種源鑒定的需求，研究發(fā)現(xiàn)，ITS、psbA-trnH 對(duì)烏頭屬植物具有一定的鑒別能力[13-14]。2015 年版《中華人民共和國(guó)藥典》首次收載了“中藥材DNA 條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則”，植物類中藥材選用ITS2/ITS 為主體序列，以葉綠體psbA-trnH 為輔助序列[7]。而DNA 條形碼技術(shù)的應(yīng)用成功與否取決于DNA 的成功提取和PCR 的成功擴(kuò)增。烏頭作為重要藥材，其入藥的關(guān)鍵即經(jīng)過(guò)炮制，需“用水浸泡至內(nèi)無(wú)干心，加水煮至取大個(gè)切開內(nèi)無(wú)白心”[7]，長(zhǎng)時(shí)間的水煮會(huì)使DNA嚴(yán)重降解[15-16]，加之烏頭藥用部位富含淀粉、多糖等成分也會(huì)干擾DNA 提取[17]，使得烏頭屬炮制品PCR 擴(kuò)增難以有效實(shí)現(xiàn)，從而影響DNA 條形碼技術(shù)在烏頭藥材鑒定的應(yīng)用。因此，在DNA 提取方面，本研究從細(xì)胞裂解階段和DNA 沉淀階段入手，基于十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[18]和十二烷基硫酸鈉（SDS）法[19]，并參考前人研究所獲得的DNA 提取改良方式[17，20]，對(duì)烏頭屬藥用部位炮制前后DNA 提取方法進(jìn)行系統(tǒng)分析，從裂解液類型、水浴時(shí)間、沉淀方式等方面進(jìn)行改良比較。在PCR 擴(kuò)增方面，將應(yīng)用于臨床上提高基因擴(kuò)增效率的二次PCR 擴(kuò)增技術(shù)[21-22]在炮制品DNA的PCR擴(kuò)增中進(jìn)行嘗試，旨在探索對(duì)烏頭屬植物炮制前后樣品DNA 提取和PCR 擴(kuò)增適用性較好的方法，以期為產(chǎn)地、市場(chǎng)烏頭類藥材生品、炮制品的基原檢測(cè)提供有效的技術(shù)支持，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1藥材研究材料包括9 種烏頭根莖生品和對(duì)應(yīng)的炮制品，其中炮制品參照2015 年版《中華人民共和國(guó)藥典》“制川烏”【制法】進(jìn)行炮制，憑證標(biāo)本由中國(guó)科學(xué)院華南植物園楊親二研究員鑒定，標(biāo)本保存于云南省藥物研究所標(biāo)本館中。具體采集信息見表1。

1.2試劑CTAB 緩沖液（含1.4 mol/L NaCl）:100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、1.4 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA（pH8.0）、2%CTAB；CTAB緩沖液（含2.5 mol/L NaCl）:100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、2.5 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA（pH8.0）、2%CTAB；1%SDS:100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、10 mmol/L EDTA（pH8.0）、0.1 mol/L NaCl、1%SDS；植物基因組DNA 快速抽提試劑盒（上海生工公司，產(chǎn)品編號(hào):B518231）；異丙醇、2 mol/L 醋酸 銨（NH4Ac）、無(wú) 水 乙 醇、1×TAE 緩 沖 液、BIOWEST G-10瓊脂糖、花青素核酸染料均購(gòu)自上海生工公司；2×Es TaqMasterMix（Dye）購(gòu)自康為世紀(jì)公司。

表1 9種烏頭屬植物采集信息表Table 1 Collection information of 9 kinds of Aconitum plants

1.3儀器EYELA NTT-2000 水浴鍋；Eppendorf Mastercycler PCR 擴(kuò)增儀；北京六一DYY-6C 型電泳儀；Eppendorf Centrifuge 5418 離心機(jī)；ZF-258全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用基于CTAB 法[18]和SDS 法[19]的12 種改良方法對(duì)9 種烏頭生品和炮制品進(jìn)行DNA提取，方案設(shè)計(jì)見表2。

1.4.2 DNA 提取 ①將9 種烏頭根莖生品或炮制品研磨成細(xì)粉，取20 mg 左右樣品進(jìn)行提取。②加入表2 中1 ～12 的提取緩沖液1 mL，添加（+）或不添加（-）聚乙烯吡咯烷酮（PVP40）至終濃度1%，65 ℃水浴1 h 或3 h。③以12 000 × g 離心5 min，取上清液，加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1）重復(fù)4 次，以8 000×g 離心10 min。④取上清液，加入等體積異丙醇或5倍體積無(wú)水乙醇+1倍體積2 mol/L NH4Ac，顛倒混勻。⑤于4 ℃或-20 ℃過(guò)夜沉降反應(yīng)。⑥以13 000×g 離心15 min。⑦沉淀干燥后加入100 μL ddH2O溶解備用。

表2 烏頭生品和炮制品DNA提取的12種方法方案設(shè)計(jì)Table 2 Designs for 12 kinds of methods for extracting DNA from crude and preparing products of Aconitum

1.4.3 PCR 擴(kuò) 增 提 取 的DNA 用ITS2F/ITS2R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測(cè)。正向引物ITS2F: 5’-ATGCGA TACTTGGTGTGAAT-3’；反向引物ITS2R:5’-G ACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。引物由上海生工合成。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包括ITS2F 0.1 μL、ITS2R 0.1 μL、2×Es TaqMasterMix（Dye）（康為世紀(jì)公司）10 μL、ddH2O 8.8 μL、DNA 模板1 μL。在Eppendorf Mastercycler PCR 儀上設(shè)定程序:94 ℃預(yù)變性5 min，35 個(gè)循環(huán)（循環(huán)條件為94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s），72 ℃終延伸10 min。PCR 完成后，制作1.5%瓊脂糖凝膠，取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈檢測(cè)。二次PCR 是將上述PCR 反應(yīng)體系中的DNA 模板更換為第一次PCR 產(chǎn)物以相同的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行第二次PCR即可。

1.4.4 改良方法的比較 以試劑盒（上海生工公司，產(chǎn)品編號(hào):B518231）提取DNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果作為參照，比較12 種改良方法提取DNA的PCR擴(kuò)增效果的優(yōu)劣。

2 結(jié)果與分析

圖1 不同緩沖液與水浴時(shí)間互作提取DNA比較Figure 1 Comparion of DNA extraction using interactions of various extraction buffers with different water-bath time

2.1不同緩沖液與水浴時(shí)間互作對(duì)DNA提取的影響具體結(jié)果見圖1。利用2×CTAB（含1.4 mol/L或2.5 mol/L NaCl）、1%SDS、生工試劑盒等4種緩沖液對(duì)9 種烏頭屬植物根莖生品和炮制品DNA 進(jìn)行提取（異丙醇沉淀DNA），提取的DNA 利用ITS2F/ITS2R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠檢測(cè)，以試劑盒的提取效果為對(duì)照（見圖1-A）。結(jié)果表明:不同緩沖液與水浴時(shí)間互作效應(yīng)不同，2×CTAB（含1.4 mol/L 或2.5 mol/L NaCl）水浴1 h 或3 h、1%SDS 水浴1 h提取的生品DNA均可成功擴(kuò)增ITS2片段，其中2×CTAB（含2.5 mol/L NaCl）水浴3 h 提取的9 種烏頭生品DNA 的ITS2 擴(kuò)增效果最佳，見圖1-B～F；1%SDS水浴1 h、2×CTAB（含2.5 mol/L NaCl）水浴1 h、2×CTAB（含1.4 mol/L 或2.5 mol/L NaCl）水浴3 h提取的炮制品DNA均可擴(kuò)增濃度相對(duì)較低的ITS2 片段，其中，2×CTAB（含1.4 mol/L NaCl）水浴3 h 提取的9 種烏頭生品DNA 的ITS2 擴(kuò)增效果最佳，見圖1-C～F。

圖2 PVP和DNA沉降方式對(duì)烏頭生品和炮制品DNA提取的影響Figure 2 Effects of PVP and DNA sedimentation modes on DNA extraction from crude and preparing products of Aconitum

2.2 1%PVP對(duì)DNA提取的影響在2×CTAB（含1.4 mol/L 或2.5 mol/L NaCl）、1%SDS緩沖液中添加1%PVP，對(duì)9 種烏頭屬植物根莖生品和炮制品DNA進(jìn)行提取，提取的DNA利用ITS2F/ITS2R進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，添加PVP 對(duì)生品DNA 提取影響不大，但對(duì)炮制品有明顯的抑制作用。其中，添加PVP后提取的8～9種烏頭生品DNA 均能成功擴(kuò)增ITS2 片段，而烏頭炮制品均未檢測(cè)到明顯的ITS2片段。見圖2-A～C。

2.3 1%PVP和DNA沉降方式互作對(duì)DNA提取的影響在2×CTAB（含1.4 mol/L 或2.5 mol/L NaCl）、1%SDS 緩沖液中添加1%PVP 對(duì)9 種烏頭屬植物根莖生品和炮制品DNA 進(jìn)行提取，乙醇+NH4Ac 沉降DNA，提取的DNA 利用ITS2F/ITS2R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，添加1%PVP+乙醇+NH4Ac 沉降DNA 對(duì)生品DNA 提取影響不大，但對(duì)炮制品有明顯的抑制作用。其中，添加1%PVP 且進(jìn)行乙醇+NH4Ac 沉降DNA 后，提取的8 ～9 種烏頭生品DNA 均能成功擴(kuò)增ITS2 片段，而烏頭炮制品均未檢測(cè)到明顯的ITS2 片段。見圖2-D ～F。

2.4烏頭炮制品的ITS2片段二次PCR 對(duì)上述12 種方法提取的炮制品DNA 用ITS2F/ITS2R 進(jìn)行一次PCR 后，以PCR 產(chǎn)物為模板進(jìn)行ITS2 位點(diǎn)的二次PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果表明，除了2×CTAB（含1.4 mol/L NaCl）水浴1 h 和1%SDS 水浴3 h+異丙醇沉淀方法，生工試劑盒和其他10 種方法提取的烏頭炮制品DNA 均可通過(guò)二次PCR 顯著提高ITS2擴(kuò)增產(chǎn)物濃度。見圖3。

3 討論

圖3 烏頭炮制品的ITS2片段二次PCRFigure 3 Two-time PCR for ITS2 fragments in preparing products of Aconitum

3.1烏頭生品和炮制品DNA提取方法改良DNA提取為烏頭藥材分子鑒定的第一步，其成功與否直接決定了后續(xù)的鑒定程序能否正常進(jìn)行。在烏頭藥材產(chǎn)地、市場(chǎng)或企業(yè)多以經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間蒸煮后的烏頭炮制品入藥，這類材料的DNA 提取難度遠(yuǎn)大于葉片或干燥生藥。本研究采用基于CTAB 和SDS 的改良方法對(duì)9 種烏頭的生品和炮制品的DNA提取進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。結(jié)果表明，不同水浴時(shí)間與不同緩沖液結(jié)合對(duì)提取烏頭生品和炮制品DNA 有較大影響，篩選出2×CTAB（含2.5 mol/L NaCl）水浴3 h 提取烏頭生品DNA 的ITS2 片段擴(kuò)增效果最好，而2×CTAB（含1.4 mol/L NaCl）水浴3 h提取烏頭炮制品DNA 的ITS2 片段擴(kuò)增效果相對(duì)較好。該結(jié)果與崔紅光等[17]觀點(diǎn)一致。本研究中的生品和炮制品也需要CTAB 法結(jié)合較長(zhǎng)時(shí)間水浴來(lái)提高DNA 得率，這與烏頭藥材本身特性有關(guān)。作為根莖類藥材，富含纖維、淀粉等物質(zhì)，適當(dāng)延長(zhǎng)水浴時(shí)間可使其組織、細(xì)胞得到充分裂解，從而釋放核酸。而烏頭生品和炮制品對(duì)CTAB 緩沖液中NaCl 濃度的反應(yīng)不同，NaCl 濃度為1.4 mol/L 時(shí)更適于提取烏頭炮制品DNA，而升高至2.5 mol/L 時(shí)適合烏頭生品。在藥材DNA 提取中高鹽溶液的應(yīng)用是為了去除其中的淀粉、多糖等物質(zhì)[17，23]，本研究結(jié)果進(jìn)而間接說(shuō)明烏頭生品經(jīng)過(guò)蒸煮后，除了次生代謝產(chǎn)物（生物堿或非生物堿成分）均有了較大的變化[24-25]，其結(jié)構(gòu)物質(zhì)如淀粉、多糖類等物質(zhì)也發(fā)生了變化。另外，添加1% PVP 或者添加1%PVP 并改變DNA 沉降方式對(duì)烏頭生品和炮制品DNA 提取有不同程度的抑制作用。前人在DNA 提取過(guò)程中添加PVP 濃度各有不同，如在提取富含多酚、多糖等次生物質(zhì)的藥用植物新鮮葉片使用1% PVP 結(jié)合0.2% β-巰基乙醇可有效去除雜質(zhì)和防止DNA 降解[26]，而在提取升麻、楤木、木香、烏藥、芍藥和木通等根莖類藥材DNA 時(shí)則在2%CTAB中加入PVP至終濃度6%[27]。本研究結(jié)果顯示1% PVP 產(chǎn)生了抑制作用，說(shuō)明1% PVP 可能不適合提取烏頭生品和炮制品DNA。雖然前人使用乙醇+NH4Ac 可抑制小片段和低濃度的DNA 分子在延長(zhǎng)的低溫保存中形成鹽沉淀物[28]，但在本研究中未顯現(xiàn)出乙醇沉降的優(yōu)勢(shì)，原因可能在于1%PVP 的不當(dāng)比例影響了乙醇沉降的作用。

3.2二次PCR提高烏頭炮制品DNA擴(kuò)增敏感性本研究中烏頭炮制品提取的DNA 擴(kuò)增結(jié)果均不理想，即使是相對(duì)較好的方法[2×CTAB（含1.4 mol/L NaCl）水浴3 h]提取的炮制品DNA 擴(kuò)增的ITS2 片段濃度與生品比較還是較低的。若要進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序等反應(yīng)，濃度一定是達(dá)不到的。目前，二次PCR 多用于臨床檢測(cè)擴(kuò)增量少的標(biāo)本或是極微量DNA 標(biāo)本供后續(xù)SSCP 和DNA 測(cè)序分析，或是加工食品中成分的核酸檢測(cè)，此方法的敏感性明顯高于一次PCR[22，29-31]；但二次PCR 在藥材物種鑒定中還尚未見有報(bào)道。本研究中的烏頭炮制品是由生品經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間蒸煮獲得的，其中的DNA 降解程度遠(yuǎn)超干燥生品，本研究通過(guò)二次PCR 可以明顯提高烏頭炮制品DNA 擴(kuò)增量，減少DNA 中雜質(zhì)對(duì)PCR 的影響，使其后續(xù)的測(cè)序等試驗(yàn)得以順利進(jìn)行。