兔斯氏艾美耳球蟲(chóng)感染模型及巢式PCR診斷方法的建立

溫福利

（聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，福州 350025）

兔球蟲(chóng)病（rabbit coccidiosis）是由兔球蟲(chóng)寄生于腸道或膽管引起的一種感染性寄生蟲(chóng)病[1]。兔球蟲(chóng)共有11種，其中斯氏艾美耳球蟲(chóng)（Eimeria stiedai，E.stiedai） 是唯一寄生于肝膽管上皮細(xì)胞的兔球蟲(chóng)，可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝球蟲(chóng)病[2]。兔球蟲(chóng)病在臨床中以腸型和肝型球蟲(chóng)混合感染為主，經(jīng)過(guò)裂殖生殖和配子生殖的E.stiedai卵囊到腸腔后與腸型球蟲(chóng)一起隨糞便排出[3]。巢式PCR是一種成熟的核酸擴(kuò)增技術(shù)，通過(guò)內(nèi)引物和外引物的雙重基因擴(kuò)增，可特異地鑒定是否存在E.stiedai感染。在科學(xué)實(shí)驗(yàn)中，因E.stiedai寄生部位的特殊性，較易獲取純種卵囊。本研究通過(guò)建立兔E.stiedai感染模型可獲取更多卵囊，利用臨床剖檢、顯微鏡觀察、血液生化檢查和病理組織學(xué)檢查等方法對(duì)建立的模型進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)雄性新西蘭兔9只，40～45日齡，平均體質(zhì)量為0.84 kg，購(gòu)自福建省連江玉華山自然生態(tài)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)場(chǎng) [SCXK(閩)2014-0001]，有抗球蟲(chóng)藥物治療記錄。實(shí)驗(yàn)兔飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院普通環(huán)境[SYXK(閩)2018-0005]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合相關(guān)倫理要求并給予人道關(guān)懷。

1.2 主要儀器與試劑

Catalyst One 全自動(dòng)生化分析儀為美國(guó)IDEXX Laboratories公司產(chǎn)品；EG1150H石蠟包埋機(jī)、RM2245半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、ST5020多功能染色機(jī)、CV5030全自動(dòng)化玻片蓋片機(jī)和DM2000生物顯微鏡均為德國(guó)Leica公司產(chǎn)品；ABI Veriti PCR儀為美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品。植物基因組DNA快速抽提試劑盒和DNA擴(kuò)增相關(guān)試劑為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀為北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；FR980凝膠成像系統(tǒng)為上海復(fù)日科技有限公司產(chǎn)品。E.stiedai由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)索勛課題組提供。

1.3 兔E.stiedai感染模型的建立

將約5×104個(gè)E.stiedai通過(guò)灌胃法注入實(shí)驗(yàn)組新西蘭兔體內(nèi)，21 d后對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行觀察，剖檢肝臟病變。取病變肝臟的一小塊結(jié)節(jié)病灶，加適量0.9%NaCl溶液（即生理鹽水）進(jìn)行壓片鏡檢，拍照后測(cè)量蟲(chóng)卵長(zhǎng)度。采集耳緣靜脈血液于綠色頭蓋標(biāo)記的肝素鋰采血管中，進(jìn)行血液生化檢查。同時(shí)，分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組一小塊肝臟組織（1 cm×1 cm×0.5 cm），置于體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液中固定24 h。梯度乙醇脫水后二甲苯透明，常規(guī)石臘包埋，切片后進(jìn)行HE染色，中性樹(shù)膠封固后，顯微鏡下觀察。

1.4 血液生化檢查

采用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)感染后實(shí)驗(yàn)兔的血糖（GLU）、尿素（UREA）、肌酐（CREA）、血尿素氮/肌酐比（BUN/CREA）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB）、白蛋白/球蛋白比（ALB/GLOB）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALKP）各項(xiàng)血液生化項(xiàng)目進(jìn)行檢查。

1.5 巢式PCR檢測(cè)方法的建立

1.5.1 卵囊收集 將含有白色結(jié)節(jié)病灶的肝臟剪成小塊并置于攪拌機(jī)中攪拌均勻，加入5倍0.25%胰蛋白酶，置于37 ℃振蕩器150 r/min振蕩1 h，消化后肝臟組織分別用1層、2層和4層紗布進(jìn)行多次過(guò)濾，濾液用飽和鹽水漂浮法收集卵囊。以雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)（E.tenella）、兔巨型艾美耳球蟲(chóng)（E.maxima）和兔大型艾美耳球蟲(chóng)（E.magna）為陰性對(duì)照，雙蒸水為空白對(duì)照。

1.5.2 DNA提取與質(zhì)粒構(gòu)建 將1×106個(gè)卵囊和2 000個(gè)卵囊分別置于含磁珠的振蕩器振蕩20 min，然后按照植物基因組DNA快速抽提試劑盒說(shuō)明提取DNA，－20 ℃保存。將2 000個(gè)E.stiedai卵囊的DNA稀釋成1個(gè)、5個(gè)、10個(gè)、25個(gè)和50個(gè)卵囊的DNA模板。E.stiedai的重組質(zhì)粒構(gòu)建于前期實(shí)驗(yàn)，拷貝數(shù)為1.41×1013，質(zhì)粒梯度稀釋后用于敏感性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。

1.5.3 巢式PCR方法的建立 根據(jù)E.stiedai的ITS1基因序列，用軟件Premier 5.0設(shè)計(jì)第一輪PCR的引物，正向引物序列為5'-TTGGGTGGGTTTTCTGTGCC-3'，反向引物序列為5'-CGCGAGCCAAGACATCCATT-3'。配制25 μL的反應(yīng)體系：上下游引物（10 μmol/L）、DNA 模板和dNTP（10 mmol/L）均是0.5 μL，Taq buffer（10×）2.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，不足部分用雙蒸水補(bǔ)充。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，連續(xù)30個(gè)循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸8 min。

第二輪PCR引物的正向序列為5'-GGTTCGGTCACCTCTGCATT-3'，反向序列為5'-CAGCACCATCATCCACAGGA-3'。配制25 μL的反應(yīng)體系：以第一輪106倍稀釋質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行再次梯度稀釋，其余成分的加入量與第一輪反應(yīng)體系相同，不足部分用雙蒸水補(bǔ)充。退火溫度提高至60℃，連續(xù)25個(gè)循環(huán)，反應(yīng)程序與第一輪擴(kuò)增相同。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。運(yùn)用Image-pro Plus 6.0軟件對(duì)組內(nèi)3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床剖檢

實(shí)驗(yàn)組兔食欲降低，腹圍明顯增大（圖1A）。解剖后見(jiàn)肝臟腫大明顯，肝臟表面和實(shí)質(zhì)布滿白色和淡黃色結(jié)節(jié)，膽囊和膽管腫大，膽汁呈淡綠色，感染嚴(yán)重的病兔膽汁呈淡黃色（圖 1B）。

2.2 血液生化檢查

GLOB含量偏高， CREA和ALKP含量偏低（表1），其余檢測(cè)指標(biāo)均在全自動(dòng)生化分析儀提供的兔血液生化檢查參考值范圍內(nèi)。

圖 1 斯氏艾美耳球蟲(chóng)感染兔的臨床剖檢Figure 1 Clinical biopsy of Eimeria stiedai infected rabbits

表 1 斯氏艾美耳球蟲(chóng)感染的兔血液生化檢測(cè)Table 1 Blood biochemistry of Eimeria stiedai infected rabbits

2.3 顯微鏡觀察

E.stiedai呈長(zhǎng)橢圓形，借助于顯微鏡及其計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)對(duì)蟲(chóng)卵形態(tài)特征進(jìn)行觀察鑒定。取肝臟結(jié)節(jié)和膽管上皮進(jìn)行壓片鏡檢，可見(jiàn)大量未孢子化E.stiedai蟲(chóng)卵，未孢子化卵囊大小為36.26μm×19.73 μm（圖2A）。將卵囊進(jìn)行分離培養(yǎng)，鏡下孢子化卵囊大小為34.35 μm×18.32μm，卵囊內(nèi)孢子囊呈卵圓形，有斯氏體（圖2B）。

2.4 病理組織學(xué)檢查

圖 2 斯氏艾美耳球蟲(chóng)感染兔卵囊的顯微鏡觀察（×400）Figure 2 Microscopic observation on oocyst of Eimeria stiedai infected rabbits (×400)

HE組織染色結(jié)果顯示，健康肝組織細(xì)胞排列緊密，未見(jiàn)E.stiedai蟲(chóng)卵（圖3A）。實(shí)驗(yàn)兔肝組織HE染色后，鏡下可見(jiàn)肝臟組織結(jié)節(jié)含大量E.stiedai蟲(chóng)卵，蟲(chóng)卵在10倍目鏡下呈空泡樣（圖3B）。肝膽管上皮增生，組織內(nèi)出現(xiàn)大量被切成縱橫等不同斷面的兔E.stiedai蟲(chóng)卵（圖3C）。40倍目鏡下，可見(jiàn)膽管內(nèi)蟲(chóng)卵呈橢圓形，粉紅色（圖3D）。

2.5 巢式PCR檢測(cè)方法

建立的E. stiedai巢式PCR檢測(cè)方法可擴(kuò)增出特異性片段，最低檢測(cè)限為1個(gè)卵囊DNA樣本，重組質(zhì)粒最低檢測(cè)限為1010倍稀釋的質(zhì)粒，拷貝數(shù)為1.14×103。以E.maxima、E.magna、E.tenella的DNA樣本為陰性對(duì)照組，以雙蒸水為空白對(duì)照組，兩組均未擴(kuò)增出條帶（圖4）。分析組內(nèi)3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，變異性系數(shù)＜5%，重復(fù)性較好（表2）。

圖 3 斯氏艾美耳球蟲(chóng)感染兔肝組織病理學(xué)檢查Figure 3 Pathological observation on the liver of Eimeria stiedai infected rabbits

圖 4 巢式PCR檢測(cè)斯氏艾美耳球蟲(chóng)卵囊DNAFigure 4 Detection of oocyst DNA of Eimeria stiedai by nested PCR

表 2 巢式PCR組內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Table 2 Intra-group repeatability test of nested PCR

3 討論

實(shí)驗(yàn)兔在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，已廣泛應(yīng)用于肝癌、肝移植、脂肪肝、肝硬化等相關(guān)基礎(chǔ)研究[4-6]。兔球蟲(chóng)病危害較大，耐過(guò)球蟲(chóng)病的實(shí)驗(yàn)兔肝損傷難以修復(fù)，并將長(zhǎng)期攜帶蟲(chóng)卵，成為隱性傳染源。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)解剖感染E.stiedai的實(shí)驗(yàn)兔發(fā)現(xiàn)，與健康肝組織相比，實(shí)驗(yàn)組肝臟腫大1.5～2倍，肝質(zhì)量增加4～5倍，肝臟表面和實(shí)質(zhì)布滿結(jié)節(jié)和少量鈣化灶；鏡下病理切片可見(jiàn)大量粉紅色的蟲(chóng)卵，形狀和大小與E.stiedai相符，初步鑒定建模成功。

GLOB是機(jī)體抵抗病毒、寄生蟲(chóng)等病原入侵的重要指標(biāo)，它可反映肝臟的病變程度[7]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)感染E.stiedai的新西蘭兔進(jìn)行血液生化檢查發(fā)現(xiàn)，GLOB含量顯著上升，輔助驗(yàn)證了E.stiedai成功感染。CREA和ALKP指標(biāo)偏低可能與球蟲(chóng)感染后引起的貧血有關(guān)系。肝臟是代謝過(guò)程中的一個(gè)重要器官，ALT是反映肝細(xì)胞受損的靈敏指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)未見(jiàn)ALT升高，可能是與感染后肝衰竭，正常細(xì)胞減少，導(dǎo)致釋放到血液中的轉(zhuǎn)氨酶減少有關(guān)。

兔球蟲(chóng)種類有11種，以混合感染為主，在兔糞樣中經(jīng)?？梢詸z測(cè)到腸型和肝型球蟲(chóng)卵囊。目前，主要通過(guò)顯微鏡觀察孢子化后卵囊的形態(tài)進(jìn)行鑒定，該方法的準(zhǔn)確性有待提高。PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于兔球蟲(chóng)的檢測(cè)。溫福利等[8]建立了E.stiedai的熒光定量PCR檢測(cè)方法。閆文朝等[9]克隆了E.stiedai完整的ITS1-5.8sRNA-ITS2基因序列，建立了PCR檢測(cè)方法，最低檢測(cè)限為50個(gè)卵囊的DNA。許家園等[10]對(duì)兔腸型艾美耳球蟲(chóng)（E.intestinalis）、黃艾美耳球蟲(chóng)（E.flavesce）、E.magna進(jìn)行了ITS序列測(cè)定，結(jié)果表明ITS序列種內(nèi)同源性高于種間同源性，可用于3種球蟲(chóng)的分子標(biāo)志。梁子平等[11]根據(jù)兔球蟲(chóng)ITS1序列分別設(shè)計(jì)了針對(duì)11種兔艾美耳球蟲(chóng)的特異性引物，建立了兔艾美耳球蟲(chóng)多重PCR檢測(cè)方法。宮鵬濤等[12]建立了用于11種兔艾美耳球蟲(chóng)的巢式PCR檢測(cè)試劑盒。本研究通過(guò)建立的E.stiedai感染模型收集了足夠卵囊，并根據(jù)ITS1序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物，該方法的最低檢測(cè)限為1個(gè)卵囊DNA樣本，重組質(zhì)粒最低檢測(cè)限為1010倍稀釋的質(zhì)粒，說(shuō)明該方法的靈敏度高。陰性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果表明特異性較好，組內(nèi)3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的變異性系數(shù)＜5%，說(shuō)明重復(fù)性較好。后期將應(yīng)用該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)兔生產(chǎn)和使用單位進(jìn)行E. stiedai檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)成功建立了兔E. stiedai巢式PCR檢測(cè)方法，有助于進(jìn)一步補(bǔ)充和完善E.stiedai的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，更好地保障實(shí)驗(yàn)兔的供應(yīng)質(zhì)量和相關(guān)科學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。