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    基于電化學(xué)酶生物傳感器的食品和藥物分析的研究進(jìn)展

    2021-01-21 08:12:38陳彥宇關(guān)樺楠劉雨欣趙子璇
    精細(xì)石油化工進(jìn)展 2020年5期
    關(guān)鍵詞:黃嘌呤伏安底物

    陳彥宇,關(guān)樺楠,劉雨欣,趙子璇,彭 勃

    哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,哈爾濱 150076

    酶是由活細(xì)胞產(chǎn)生的、對(duì)其底物具有高度特異性和高度催化效能的蛋白質(zhì)或RNA。酶的催化作用有賴于酶分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)的完整。酶固定化技術(shù)是用物理或化學(xué)手段,將游離酶封鎖住固體材料或限制在一定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行活躍的、特有的催化作用,并可回收長(zhǎng)時(shí)間使用的一種技術(shù)。酶的固定化技術(shù)已經(jīng)成為酶應(yīng)用領(lǐng)域中的一個(gè)主要研究方向。經(jīng)固定化的酶與游離酶相比具有穩(wěn)定性高、回收方便、易于控制、可反復(fù)使用、成本低廉等優(yōu)點(diǎn),在生物工業(yè)、醫(yī)學(xué)及臨床診斷、化學(xué)分析、環(huán)境保護(hù)以及基礎(chǔ)研究等方面發(fā)揮了重要作用[1]。在設(shè)計(jì)生物傳感器時(shí),根據(jù)生物傳感器的用途選擇合適的固定化方法。固定化方法主要有吸附法[2]、共價(jià)鍵合法[3]、交聯(lián)包埋法[4]和包埋法[5]。吸附法不需要對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)改性,因此簡(jiǎn)單、廉價(jià)、可逆,缺點(diǎn)為可能存在鍵合不良和酶漏,穩(wěn)定性差。在共價(jià)固定化中,酶與共價(jià)鍵結(jié)合緊密,可以合理控制酶的用量和微環(huán)境,但這種方法通常很昂貴,且對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)體稀釋酶的活性。包埋法的基本原理是,載體與酶溶液混合后,借助引發(fā)劑進(jìn)行聚合反應(yīng),通過物理作用將酶限定在載體的網(wǎng)格中,從而實(shí)現(xiàn)酶固定化的方法。包埋法不需要對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾,更適合于細(xì)胞。交聯(lián)法,一般適用于高溫有機(jī)溶劑,不需要載體,酶與交聯(lián)劑之間有緊密的結(jié)合,這種方法的主要缺點(diǎn)是酶結(jié)晶的要求高,并且很難控制顆粒的性質(zhì)。

    就像所有用來抑制特定反應(yīng)的藥物一樣,藥物也可以使用基于酶抑制的策略進(jìn)行檢測(cè)[6]。酶抑制可以是可逆的或不可逆的。在可逆抑制中,底物和抑制劑競(jìng)爭(zhēng)酶,稱為競(jìng)爭(zhēng)抑制。抑制劑通常是底物的結(jié)構(gòu)類似物。在非競(jìng)爭(zhēng)性抑制中,抑制劑從另一個(gè)位點(diǎn)而不是底物結(jié)合位點(diǎn)與酶結(jié)合,導(dǎo)致底物結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變。因此,底物不能結(jié)合并發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制。抑制劑可以與游離酶或酶底物復(fù)合物結(jié)合[7-8]。通常用殺蟲劑抑制特定的酶,阻止或降低酶的活性[9]。

    1 電化學(xué)酶生物傳感器

    在電化學(xué)分析中,伏安法是常用的電分析技術(shù),它記錄電流作為外加電位的函數(shù)[10]。伏安法分為循環(huán)伏安法[11]、階躍脈沖伏安法[12]、交流伏安法[13]、溶出伏安法[14]。安培技術(shù)是酶生物傳感器中最常用的電化學(xué)技術(shù)。Amperometric生物傳感器分為3類即第一代、第二代和第三代酶生物傳感器[15]。第一代酶電極是由一個(gè)酶和一個(gè)載體組成的系統(tǒng)。在底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的過程中,觀察到氧還原為過氧化氫。在第一代酶電極中,實(shí)現(xiàn)了過氧化氫(+0.68 V)的氧化[16]。第一代電極的不利之處在于,在過氧化氫被氧化的電位下,其他物種可被氧化而產(chǎn)生干擾效應(yīng)。在第二代酶電極中,電子傳遞是由稱為介體的氧化反應(yīng)物而不是氧提供的。介質(zhì)使輔酶再生,介質(zhì)不應(yīng)與介質(zhì)中的氧發(fā)生反應(yīng),而應(yīng)與還原的輔酶迅速反應(yīng),并具有穩(wěn)定的氧化和還原形式。理想介質(zhì)的性質(zhì)是:與還原酶反應(yīng)迅速,具有穩(wěn)定的氧化還原形式,在操作條件下穩(wěn)定,在電子傳遞過程中不應(yīng)參與副反應(yīng),其氧化還原電位應(yīng)低于樣品中其他電活性物質(zhì),不應(yīng)有毒,其還原形式不應(yīng)與氧發(fā)生反應(yīng)。用作介質(zhì)的材料可以加入溶液中,也可以固定在電極上[17]。通過對(duì)兩代人的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)人工介質(zhì)用于復(fù)雜介質(zhì)時(shí),它們會(huì)導(dǎo)致樣品污染。因此,盡管在復(fù)雜介質(zhì)中使用人工介質(zhì)具有優(yōu)勢(shì),必須消除第二代生物傳感器中介體引起的接觸。在第三代酶電極中,酶氧化還原中心和電極表面通過有機(jī)導(dǎo)電鹽產(chǎn)生直接的相互作用[18]。

    2 酶生物傳感器在食品藥品工業(yè)中的應(yīng)用

    近年來,基于電化學(xué)酶的生物傳感器的食品和藥物分析應(yīng)用越來越廣泛。CHAWLA等[19]開發(fā)了一種基于固定在鎳納米粒子、羧化多壁碳納米管和聚苯胺中的漆酶修飾電極的安培生物傳感器。

    這種修飾是在金電極上進(jìn)行的,并在pH為5.5和0.1 M(M=mol/L,下同)的醋酸鹽緩沖液中,在35 ℃下進(jìn)行測(cè)量。線性響應(yīng)在0.1~10 μM之間,檢測(cè)限為0.05 μM,靈敏度為0.694 μA·μm-1·cm-2。將所設(shè)計(jì)的生物傳感器應(yīng)用于10種果汁中酚類物質(zhì)的測(cè)定,并與分光光度法進(jìn)行了比較。在果汁中添加已知量的愈創(chuàng)木酚進(jìn)行回收研究,回收率為95.61%。Lac/NiNPs/cMWCNT/PANI在4個(gè)月內(nèi)使用了200次,失去了15%的初始活性。漆酶可用于測(cè)定多種草藥、茶葉、醇類中的酚類物質(zhì),有許多不同的應(yīng)用領(lǐng)域。與其他最近的研究相比,此研究的檢出限較低。此外,從研究中可以看出,傳感器的改性和納米材料的使用非常重要,充分利用了金屬納米顆粒與碳基納米顆粒和聚合物相結(jié)合的優(yōu)勢(shì)。

    以黃嘌呤氧化酶為生物組分的酶生物傳感器也可用于魚類新鮮度檢測(cè)。DERVESEVIC等[20]將黃嘌呤氧化酶固定在多壁碳納米管和氧化還原無規(guī)共聚物中。對(duì)于黃嘌呤檢測(cè),進(jìn)行了pH和溫度的反應(yīng)性研究,在pH 7.0和45 ℃下獲得了最佳響應(yīng)。所設(shè)計(jì)的生物傳感器的線性范圍為2~28 μM、28~46 μM和46~86 μM黃嘌呤,檢測(cè)限為0.12 μM。利用自行設(shè)計(jì)的黃嘌呤生物傳感器,從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購買的魚肉樣品中成功檢測(cè)出黃嘌呤。該研究發(fā)現(xiàn),碳基納米材料與一種方便的聚合物相結(jié)合,形成了一個(gè)高效的固定化平臺(tái),具有良好的協(xié)同效應(yīng)。

    PORTACCIO等[26]利用硫堇導(dǎo)電聚合物和炭黑納米復(fù)合物建立了一種測(cè)定番茄汁中雙酚A的漆酶生物傳感器。從酶負(fù)載、pH和應(yīng)用電位范圍等方面對(duì)所設(shè)計(jì)的生物傳感器進(jìn)行了優(yōu)化。在0.5~50 μM范圍內(nèi),檢測(cè)限為0.2 μM。對(duì)番茄汁進(jìn)行了實(shí)際應(yīng)用研究,回收率在95%到120%之間。這樣的研究證明漆酶不僅可以用于酚類化合物的測(cè)定,而且可以用于農(nóng)藥的測(cè)定。表1總結(jié)了酶基生物傳感器在食品工業(yè)中的其他最新應(yīng)用。在最近的一項(xiàng)研究中,WANG等[27]基于交聯(lián)戊二醛固定化漆酶和石墨烯修飾玻碳電極,提出了一種檢測(cè)天然甾體17β-雌二醇的新型電化學(xué)酶?jìng)鞲衅?。研究了電聚合循環(huán)、賴氨酸用量、漆酶濃度等因素對(duì)傳感器的選擇性、重復(fù)性和穩(wěn)定性的影響。在最佳條件下,17β-雌二醇在0.4~57 pM之間檢測(cè),檢出限為0.13 pM。以人尿?yàn)閷?shí)驗(yàn)對(duì)象,驗(yàn)證了酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)人尿中17β-雌二醇的有效性和可行性。該研究中使用的尿樣表明,生物傳感器可直接用于臨床。

    表1 酶生物傳感器在食品和藥物工業(yè)中的應(yīng)用進(jìn)展

    3 結(jié)論與展望

    大多數(shù)生物傳感器都利用了納米材料在傳感器設(shè)計(jì)中的優(yōu)勢(shì),因?yàn)樗鼈兙哂休^高的導(dǎo)電性,有助于電子從酶的氧化還原位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到傳感器,這對(duì)于快速響應(yīng)非常重要。許多生物傳感器由于其應(yīng)用范圍廣,檢測(cè)限低,有可能用于實(shí)驗(yàn)室的早期疾病監(jiān)測(cè)和食品控制,因此,它們具有巨大的商業(yè)化潛力。酶基生物傳感器的主要挑戰(zhàn)仍然是固定化平臺(tái),因?yàn)樗鼘?duì)生物傳感器的穩(wěn)定性、貨架期、重復(fù)性和重復(fù)性能力至關(guān)重要。因此,新的固定化平臺(tái)仍然需要有效的基于酶的生物傳感器。生物傳感器作為高質(zhì)量食品加工和藥物分析的重要工具,其需求量不斷增加,這就要求在生物傳感器中使用先進(jìn)的技術(shù)。電化學(xué)酶生物傳感器是一種可靠的、靈敏度高的食品和藥品分析儀器。同時(shí)考慮環(huán)境樣品和生物樣品時(shí),現(xiàn)場(chǎng)生物傳感器的應(yīng)用可確保在最長(zhǎng)幾分鐘內(nèi)獲得分析結(jié)果。從數(shù)據(jù)庫中可以看出,酶電化學(xué)生物傳感器在智能器件、納米傳感器、智能材料生物傳感器等方面的研究將越來越受到重視。

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